全 文 ：第 27 卷 第 2 期 作　物　学　报 V o l. 27, N o. 2
2001 年 3 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ar. , 2001
V 型细胞质雄性不育小麦线粒体蛋白质的研究Ξ
杨　毅　滕晓月　阎隆飞
(中国农业大学生物学院, 北京 100094)
提　要　本实验以V 型细胞质雄性不育小麦幼穗为材料, 用蔗糖衬垫法和两相法成功地分离纯化了小
麦幼穗线粒体, 并用 SD S2PA GE 电泳方法结合高灵敏度的银染技术对其线粒体蛋白质进行了比较分
析, 发现雄性不育系与相应保持系之间有明显差异, 不育系 (V 1A 和V 2A ) 均缺少一个分子量为 14 kD
的蛋白质。线粒体与V 型细胞质雄性不育的产生可能存在着某种特定的关系。
关键词　小麦; V 型细胞质雄性不育; 线粒体蛋白质; 梯度 SD S2PA GE
Stud ies on M itochondr ia l Prote in s of CM S-V in W hea t
YAN G Y i　T EN G X iao2Yue　YAN L ong2Fei
(Colleg e of B iolog ica l S ciences, Ch ina A g ricu ltu ra l U niversity , B eij ing 100094, Ch ina)
Abstract　　Tw o CM S2V lines of w heat (w ith the cytop lasm of A e. ven tricosa ) , V 1A and
V 2A w ere u sed in th is invest iga t ion. T he m itochondria w as p repared and pu rif ied
successfu lly from w heat young ears via sucro se cu sh ion and tw o2phase m ethod. D ifferences
of m itochondria po lypep t ides have been found betw een m ale sterile and m ain ta iner lines u sing
silver2sta ined PA GE. A 14kD po lypep t ide ex isted in m ain ta iner lines V 1B and V 2B , and no t
in V 1A and V 2A.
Key words　　W heat; CM S2V ; M itochondria l po lypep t ides; Grad ien t SD S2PA GE;
细胞质雄性不育 (Cytop lasm ic M ale Sterility, CM S) 是作物杂种优势利用的重要途径,
但小麦等作物CM S 形成的机理至今尚未搞清。由于CM S 表现母性遗传的特性, 因此人们将
CM S 现象与线粒体和叶绿体联系起来, 进而研究这两种细胞器的遗传物质与 CM S 的关系。
近年来, 许多证据表明, 线粒体基因组 (m tDNA ) 及其表达产物与 CM S 有直接关系。Song. J
等提出线粒体嵌合基因表达产物OR F256 (一个 7kD 的蛋白质) 可以作为 T 型小麦细胞质雄
性不育的特异蛋白质[ 1, 2 ]。司智海等发现 T 2型细胞质雄性不育小麦缺少 28kD 蛋白质[ 3 ]。V
型细胞质雄性不育小麦这方面的研究未见系统报道。本文以小麦V 型细胞质雄性不育系及其
相应的保持系幼穗为材料, 对其线粒体蛋白质进行比较研究, 寻找与雄性不育有关的特异蛋
白质, 为CM S 形成的机理研究提供有价值的材料。Ξ 本研究系农业部植物生理生化开放实验室资助项目。
收稿日期: 1999211202, 接受日期: 2000206217
Received on: 1999211202, A ccep ted on: 2000206217

1　材料和方法
1. 1　材料
供试材料为V 2型小麦 (T. aestivum L. )细胞质雄性不育系V 329- 1、V 川78- 3460及其相应的保
持系, 以下简称为V 1A öV 1B、V 2A öV 2B , 2 种不育系的回交均在 7 代以上。由中国农业大学植物
科技学院孙其信教授和梁振兴教授提供。幼穗取自二核花粉粒期。
1. 2　方法
1. 2. 1　幼穗线粒体的制备及纯化
1. 2. 1. 1　蔗糖衬垫法纯化小麦幼穗线粒体　　参照D. A. D ay 等的方法[ 4 ] , 略加改动。田
间采集小麦幼穗, 用蒸馏水冲洗干净后, 去芒剪碎, 用液氮研磨成细粉, 加入预冷研磨介质
(0. 4 m o löL 蔗糖, 50 mm o löL T ris2HC l pH 7. 5, 1 mm o löL ED TA , 0. 5% PV P, 0. 1%BSA ,
0. 1% 巯基乙醇) 匀浆, 6 层纱布过滤, 用差速离心获得粗制线粒体。然后将上述粗制线粒体
轻轻置于 2 vo lög 鲜重的蔗糖衬垫液 (0. 6 m o löL 蔗糖, 10 mm o löL T ris2HC l pH 7. 2) 上,
12, 000 röm in 离心 15 m in, 所得沉淀即为纯化线粒体。
1. 2. 1. 2　两相法纯化小麦幼穗线粒体　　参照 Per Gardestroβm 等的方法[ 5 ]。将田间采集小
麦幼穗冲洗干净后, 去芒剪碎, 加液氮研磨成细粉, 按 2～ 3 vo lög 鲜重加入预冷的 (4℃)研磨
介质 (0. 5 m o löL 山梨醇, 1 mm o löL ED TA , 1 mm o löL M gC l2, 1 mm o löL 巯基乙醇, 25
mm o löL H EPES pH 7. 8, 0. 5% PV P)匀浆, 6 层纱布过滤, 6, 000 röm in 离心 2 m in, 弃沉淀,
上清液在 12, 000 röm in 下离心 15 m in, 将沉淀 (即粗制的线粒体) 置于由D ex tran T 500 和
PEG4000 组成的相系统中: 6. 1% (w öw ) PEG4000, 6. 1% (w öw )D ex tran500, 5 mm o lökg,
磷酸钾缓冲液 (pH 7. 8) , 2 mm o lökg KC l, 0. 3 m o lökg 蔗糖。混匀, 上下颠倒 7 次后, 静止 30
m in 或3, 000 röm in 低速离心 3～ 5 m in, 待分相后, 用针头小心吸去上相, 留下相, 注意勿触
动界面, 在下相中加入 5 mL 新的上相, 重复上述操作二次, 最后下相用 7 倍体积悬浮液 (蔗
糖 0. 3 m o löL , 10 mm o löL T ris2HC l pH 7. 2)稀释, 在 5, 000 röm in 离心 5 m in, 取上清液, 上
清液再在 12, 000 röm in 离心 20 m in, 沉淀即为用二相法纯化的线粒体。
1. 2. 2　线粒体显微检测　　将蔗糖衬垫法和两相法纯化后的线粒体用 Janu s green B 活性染
色, 在OL YM PU S 显微镜下观测后照相。
1. 2. 3　线粒体蛋白质浓度的测定　　参照B radfo rd 方法[ 6 ]进行测定。
1. 2. 4　线粒体蛋白质的电泳方法　　梯度 SD S2PA GE 将纯化线粒体样品用 SD S 样品增溶
液按 1∶4 增溶, 于沸水浴中 3～ 5 m in, 冷却后即可点样进行电泳。采用L aemm li[ 7 ]体系。8%
～ 18% 梯度 SD S2PA GE, CBBR 2250 染色或银染, 银染参照D en is F. H. 等的方法进行[ 8 ] , 照
相或用岛津C s2910 双波长薄层扫描仪扫描。
2　结果与分析
幼穗线粒体蛋白质的比较:
梯度 SD S2PA GE 图谱上的差异
用 8%～ 18% 梯度 SD S2PA GE 方法比较了V 型小麦两个品种两系间幼穗线粒体蛋白质
组分的差异, 结果见图 1、图 2 和图 3。
3122 期　　　　　　　　杨　毅等: V 型细胞质雄性不育小麦线粒体蛋白质的研究　　　　　　　　　　　　

图 1　V 型小麦幼穗线粒体 (衬垫法纯
化)蛋白质梯度 SD S2PA GE 图谱从左至
右依次为V 1BöV 1A , V 2BöV 2A
F ig. 1　SD S2GPA GE m app ing of
m itochondrial (purified by sucro se
cush ion) po lypep tides from V 2type
w heat young ears. F rom left
to righ t: V 1BöV 1A , V 2BöV 2A 　　图 2 是图 1 的扫描曲线。从图 1 明显看出, V 1 和V 2 两个品种不育系与保持系间均存在显著差异, 而且这两种差异表现出相当的一致性, 即不育系 V 1A 和V 2A 均比保持系V 1B 和V 2B 少了一条分子量约为 14 kD 的蛋白质 (图 1, 图 2箭头所示)。此项结果同样出现在两相法纯化的线粒体蛋白质的电泳图谱上 (图 3 箭头所示)。3　讨论国内外学者对叶绿体和线粒体基因组及其表达产物与CM S 的关系进行了许多研究。发现线粒体基因组 (m tDNA )及其表达产物与 CM S 有直接关系。比较提莫非维小麦和普通小麦细胞质线粒体基因组结构发现提莫非维小麦细胞质m tDNA 含一个 a tp 6 拷贝, 而普通小麦细胞质m tDNA 含有两个 a tp 6 拷贝。因此在把普通小麦细胞核引入提莫非维小麦细胞质时可导致核质不协调而产生雄性不育[ 9 ]。司智海[ 3 ]对普通小麦 T 型细胞质雄性不育系及其保持系线粒体蛋白质进
行了分析, 发现孕穗期幼穗不育系缺少 28kD 的蛋白质。
Song. J 等人[ 1 ]利用分子生物学技术结合免疫印迹法找出了 T 型小麦不育系线粒体嵌合基因
orf 256 的表达产物O PF256 (一个 7kD 的蛋白质) , 而在普通小麦, 提莫菲维小麦和恢复育性
图 2　　V 型小麦幼穗线粒体蛋白质电泳图谱的扫描曲线
A 不育系 (V 1A )　　B 保持系 (V 1B)
F ig. 2　　T he scanning curves of electropho resis m app ing of m itochondrial po lypep tides from V 2type w heat young ears
A Sterile line (V 1A )　　B M ain tainer line (V 1B)
412　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　27 卷

图 3　　V 型小麦幼穗线粒体 (两相
法纯化)蛋白质梯度 SD S2PA GE
银染图谱从左至右依次为:
V 1BöV 1A
F ig. 3　　SD S2GPA GE Silver2
stained m app ing of m itochon2
drial (purified via two2phase
m ethod)po lypep tides from V 2type
w heat young ears. F rom left
to righ t: V 1BöV 1A的不育系杂种一代细胞质线粒体中均未检测到该蛋白质的表达。因此, 提出OR F256 蛋白质可以作为 T 型小麦细胞质雄性不育的特异蛋白质。而V 2型细胞质雄性不育小麦这方面的研究未见系统报道。所以对不同遗传背景下线粒体基因组及其表达产物的研究, 有助于了解细胞质雄性不育产生的机制。线粒体存在于活细胞中, 其功能的表达会受核与质的共同制约。离体线粒体在特定条件下能继续合成蛋白质, 虽然离体线粒体蛋白质的合成能反应线粒体的一些特征, 但毕竟离开了活细胞, 并不能完全真实地再现线粒体的生物学特征。本实验成功地从活体中即从小麦幼穗中分离出线粒体, 进一步研究线粒体蛋白质的表达行为与CM S 的关系, 为小麦 CM S 机制的深入研究打下基础。本实验用两相法进行小麦幼穗线粒体的纯化, 目前在文献中尚未见报道。我们的实验证明了两相法纯化的小麦幼穗线粒体具有较高的纯度, 完全可以用于线粒体蛋白质的分析。本实验分别采用两种方法 (蔗糖衬垫法和两相法) 对V 型小麦同一品种
(V 1) 不育系及保持系幼穗线粒体进行了分离纯化, 并进一步通
过梯度 SD S2PA GE 电泳图谱加以比较分析, 发现两种纯化线粒体的方法得到的结果基本一
致, 说明了该实验结果具有一定的重复性和两种纯化方法的可靠性。
线粒体的生物功能是由细胞核和线粒体的基因共同控制的。植物线粒体虽有上百种蛋白
质, 但只有一小部分 (10% ) 是由线粒体基因组编码并由线粒体蛋白质合成机构合成, 大多数
线粒体蛋白质是由细胞核基因编码, 在胞质核糖体中合成后运输进入线粒体中。不育系 (V 1A
和V 2A )所缺失的 14kD 线粒体蛋白质是核基因编码还是m tDNA 编码, 现在还不清楚, 但此
特异线粒体蛋白质的缺失可能影响线粒体的功能, 从而导致花粉败育。此结果有待进一步深
入探讨。
参　考　文　献
1　Song J , C H edgco th. Genom e, 1994, 37: 203～ 209
2　J iasheng Song, Charles H edgco th. P lan t M olecu lar B iology , 1994, 26: 535～ 539
3　司智海, 刘植义. 华北农学报 (增刊) , 1989: 82～ 85
4　D A D ay, J B H anson. P lan t S cience L etters, 1977, 11: 99～ 104
5　Gardestroβm P, I E ricson, C L arsson. P lan t S cience L etters, 1978, 13: 231～ 240
6　B radfo rd M M. B iochem istry 1976, 72: 248～ 254
7　L aemm li U K. N atu re, 1970, 227: 680～ 685
8　D enis F H , A Patcho rn ik, C R M erril. A naly tica l B iochem istry , 1988, 173: 412～ 423
9　M oh r S. T heor A pp l Genet, 1993: 86: 259～ 268
5122 期　　　　　　　　杨　毅等: V 型细胞质雄性不育小麦线粒体蛋白质的研究