全 文 ：Vol. 31 , No. 7
pp. 838 - 843 　July , 2005
作 　物 　学 　报
ACTA AGRONOMICA SINICA
第 31 卷 第 7 期
2005 年 7 月 　838～843 页
NAD2ID H亚基 1 基因在油菜花粉与种子发育过程中的表达规律
陈喜文　陈德富 3 　陈海浪
(南开大学生命科学学院 ,天津 300071)
摘 　要 : 以甘蓝型油菜不同发育时期的花粉与种子为材料 ,开展了有关 NAD2IDH 亚基 1 基因表达规律的研究。结果表
明 ,不同发育时期花粉与种子的 NAD2IDH比活力均比叶片的高。花粉与种子发育过程中 NAD2IDH比活力均呈抛物线状
变化 ,这与亚基 1 基因的 RNA 定量斑点杂交和定量 RT2PCR 揭示的花粉与种子发育过程中 NAD2IDH 亚基 1 基因 mRNA
量的变化规律完全一致 ,即油菜 NAD2IDH亚基 1 基因的表达受 mRNA 水平调控。不同品种 (系) 间叶片 NAD2IDH 比活力
研究发现 ,油菜品种 (系)间存在显著差异 ,但这种差异不是由亚基 1 基因的 mRNA 量差异所致 ,而是受转录后水平调控。
本文也对 NAD2IDH亚基 1 基因异常转录与农艺特性之间的关系进行了讨论。
关键词 : NAD + 2依赖型异柠檬酸脱氢酶 ;酶比活力 ;基因异常转录 ;发育
中图分类号 : Q5 ,Q7 ,S565
The Gene Expression Pattern of NAD2ID H Subunit 1 during the Development of
Pollen and Seed in Brassica napus
CHEN Xi2Wen , CHEN De2Fu 3 , CHEN Hai2Lang
( College of Life Sciences , Nankai University , Tianjin 300071 , China)
Abstract : NAD +2isocitrate dehydrogenase is a nuclear2encoding enzyme residing in mitochondria1 The enzyme in Brassica
napus is composed of three subunits encoded by three genes designated as Bnidh0 , Bnidh1 and Bnidh21 In the earlier work
we have found that the sequence of Bnidh1 cloned from Shaan 2A and Shaan 2B is not completely homology1 There was a
deletion existing in 14 % - 33 % of Bnidh1 clone1 In order to further understand its function and its relation with the agro2
nomical characters , RNAs at different developmental stages of pollens and seeds in Brassica napus were used to study the
gene expression of NAD2IDH subunit 11 The results indicated that NAD2IDH specific activity both in pollens and seeds were
higher than in leaves1 The NAD2IDH specific activity showed a parabolic curve2like changing pattern during the process of
pollen or seed development ( Fig11 , Fig12) 1 That was completely coincident with the changing pattern of the expressed
mRNA amount , which was detected by quantitative dot hybridization and quantitative RT2PCR (Fig13 , Fig14) 1 It suggest2
ed that the gene expression of NAD2IDH both in pollens and seeds was regulated by the level of mRNA1 The significant dif2
ference of leaf NAD2IDH specific activities was occurred in different cultivars or lines1 Topas had the highest specific activi2
ty with 1122 U/ mg protein , while Ken C1 had relatively lower specific activity with 0196 U/ mg protein and Shaan 2B had
the lower specific activity with 0157 U/ mg protein and Shaan 2A had the lowest specific activity with 0138 U/ mg protein
(Table 1) 1 But the difference was not caused by the expressed mRNA amount (Fig15) 1 Thus the expression of NAD2IDH
in leaf was regulated by posttranscriptional mechanism1 The agronomical characters affected by NAD2IDH were also dis2
cussed in this paper1
Key words : NAD +2isocitrate dehydrogenase (NAD2IDH) ; Enzymatic specific activity ; Abnormal transcription ; Develop2
ment
　　NAD +2依赖型异柠檬酸脱氢酶 (NAD +2isocitrate
dehydrogenase ,简写为 NAD2IDH ; EC 11111141) 是一 个核编码的线粒体酶 ,具有别构酶特性。在三羧酸循环中负责催化异柠檬酸氧化脱羧成α2酮戊二酸 ,
基金项目 : 教育部高等学校骨干教师资助计划 (00265)和留学回国人员科研启动基金 (20032406)资助。
作者简介 : 陈喜文 (1966 - ) ,博士 ,副教授 ,主要从事植物生物化学与分子生物学研究。 3 通讯作者 (Corresponding author) :陈德富 (1965
-
) ,博士 ,教授 ,主要从事分子遗传学研究。Tel :022223500133 ; E2mail :chendefu @nankai1edu1cn
Received(收稿日期) : 2004207202 , Accepted(接受日期) : 20042112251

并将NAD + 还原成NADH ,是最重要和最具调控意义
的限速酶[1 ] 。NAD2IDH 还参与植物体内的氮代
谢[2 ] 、乙醛酸循环[3 ]等多种生化代谢途径 ,还是某些
线粒体基因 mRNA 的结合蛋白 ,具有调控线粒体基
因翻译的能力[4 ] 。现有研究表明 ,不同物种 NAD2
IDH的亚基组成不同[5 , 6 ] 。拟南芥 NAD2IDH被认为
是由两种亚基组成的异源八聚体 ,但此两亚基组装
的酶并不具有催化的功能[7 ] 。笔者在前文[8 ]中报道
拟南芥和甘蓝型油菜中 NAD2IDH 由 3 种亚基组成 ,
体外蛋白质合成研究显示 3 种亚基以 2∶1∶1 的比例
组成有活性的全酶 ,其中亚基 0 可能为催化亚基 ,亚
基 1 和 2 可能为调节亚基。编码 3 个亚基的基因分
别是 Bnidh0、Bnidh1 和 Bnidh2。育性不同的材料 ,
其克隆的基因序列并不完全相同。Bnidh0 和
Bnidh2 在油菜三系中序列完全相同 ,而 Bnidh1 在来
源于不育系“陕 2A”和保持系“陕 2B”的不同克隆
中 ,序列并不完全相同 ,其中 14 %～33 %的 Bnidh1
基因序列存在碱基缺失的现象。因此 ,以 Bnidh1 基
因来研究植物发育过程中 NAD2IDH 基因的表达规
律 ,将有助于进一步了解该酶的功能 ,有助于阐明其
调控的生命现象。关于 NAD2IDH 基因表达规律 ,目
前仅见于甘蓝型油菜和黄瓜种子萌发过程中基因转
录规律的研究报道[9 ] 。
1 　材料与方法
111 　材料
11111 　植物材料　　甘蓝型油菜 ( Brassica napus)包
括 Topas、陕 2A、陕 2B 和垦 C1 等品种 (系) 。Topas
由加拿大农业与农业食品研究中心 Li X2Q 研究员
馈赠。陕 2A、陕 2B 和垦 C1 由陕西省杂交油菜研究
中心李殿荣研究员馈赠 ,陕 2A 是一种细胞质雄性
不育系 ,陕 2B 是陕 2A 的保持系 ,垦 C1 是陕 2A 的
恢复系[10 ] 。所有供试材料播种在 25 ℃和 15 h 光照
/ 9 h 黑暗的人工气候室中。花期取其幼叶 (顶叶)或
生长良好的主花序或一次分枝上的花蕾、角果为试
验材料。花蕾采集后 ,于冰浴上按蕾长大小将花粉
分成 6 个发育时期 ,蕾长大小与花粉发育时期的关
系参见文献[11 ]。角果采集后 ,于冰浴上剥开 ,取其
种子 (含胚) ,按角果宽度将种子分成 6 个发育时
期[12 ] 。
11112 　试剂 　　MOPS 购自美国 Research Organics
公司。β2NAD + 购自日本 Oriental Yeast 公司。Adeno2
sine 5’2monophosphate ( AMP) 、Diethyl pyrocarbonate
(DEPC) 购自美国 Sigma 公司。thero2Ds2isocitrate 购
自美国 ICN Biomedicals 公司。[α233 P ] dCTP 购自北
京亚辉生物医学工程公司。HybondTM2N + 购自
Amersham 公司。
112 　方法
11211 　NAD2IDH 粗提液的提取 　　按文献[11]方法
提取叶片或花粉线粒体。按文献[12]方法提取种子线
粒体。线粒体沉淀悬浮于含 40 mmol/ L MOPS(pH 714)
及 10 mmol/ Lβ2巯基乙醇的缓冲液中 , - 70 ℃/ 4 ℃下冻
融裂解线粒体。裂解液经15 000 ×g、4 ℃离心 35 min ,
上清液即为酶粗提液。
11212 　NAD2IDH比活力分析　　按文献[8 ]方法测
定叶片、花粉或种子粗提液 NAD2IDH 比活力。酶活
力单位 (U)定义为每分钟产生 1 nmol NADH 所对应
的酶量。蛋白含量的测定采用 Bradford[13 ]方法。酶
比活力为 1 mg 蛋白对应的酶活力 ,取 3～4 次重复
试验的平均值。处理间差异经新复极差检测。
11213 　探针制备 　　按华美生物工程公司缺口平
移试剂盒说明 ,标记来自垦 C1 的 Bnidh1 基因 (命名
为 Bnidh12C[8 ] 。GenBank 注册号 :AY216773) 。
11214 　RNA 定量斑点杂交分析 　　按文献 [12 ]方
法。细胞质总 RNA 点样量分别为 8、4、2、1、015 和
0125μg。杂交膜为 HybondTM2N + 。黑暗下曝光 24 h
或 144 h。依软件 Gel2Pro Analyzer 410 (美国 Media2
Cybernetics 公司) 分析杂交斑点亮度。
11215 　定量 RT2PCR 分析　　按文献[14 ]方法提取
叶片及不同发育时期花粉与种子的总 RNA ,富集其
poly(A) + mRNAs ,合成其第一链 cDNAs。cDNAs 合成
后 ,浓度调至 1215 ng/μL ,取 2μL 加样于 25μL PCR
体系。在 Bnidh12C 与其同源亚基基因 Bnidh02C
(AY216770)和 Bnidh22C (AY216776) 差异碱基处设
计 PCR 引物对 5′2GCCCACCAGGCATGAGAAT23′(位
于 Bnidh12C的 + 402 ～ + 420) 和 5′2AGACACCGTG2
GATCATACCC23′ ( 位 于 Bnidh12C 的 + 1202 ～
+ 1183) 。该引物对在 Bnidh12C 基因上所能扩增的
理论长度为 801 bp。PCR 用的 DNA 聚合酶为宝生
物工程 (大连)有限公司的 Ex2 TaqTM。反应体系遵照
厂家说明 ,反应过程为 94 ℃,5 min ;94 ℃,40 s ,57 ℃,
40 s ,72 ℃,90 s ,30 个循环 (或 36 个、或 42 个循环) ;
72 ℃,7 min。取 8μL PCR 产物于 1 %琼脂糖凝胶上
电泳分析其特异带亮度。依软件 Gel2Pro Analyzer
410 分析亮度。
938　第 7 期 陈喜文等 :NAD2IDH亚基 1 基因在油菜花粉与种子发育过程中的表达规律 　　　

2 　结果与分析
211 　不同发育时期花粉与种子 NAD2ID H 比活力
分析
　　从图 1 可以看出 ,不同发育时期花粉的 NAD2
IDH比活力显著不同。花粉发育过程中 NAD2IDH
比活力变化呈抛物线状。从四分体、单核期、双核期
至三胞期逐渐增加 ,至三胞期达最高点 ,垦 C1 为
6170 U/ mg 蛋白 ,Topas 为 6189 U/ mg 蛋白 ;其后逐渐
下降 ,直至成熟期 ,此时酶比活力与四分体时处于同
一水平。Topas 和垦 C1 均呈现出同样的变化规律 ,
但各时期 Topas 酶比活力均比垦 C1 的高。各发育
时期花粉的 NAD2IDH 比活力都比叶片的 (1102 U/
mg 蛋白)高。与叶片相比 ,花粉发育过程中需要更
多的 NAD2IDH ,因其能量代谢更为旺盛。
图 1 Topas 与垦 C1 花粉发育过程中的 NAD2IDH比活力比较
Fig11 The comparison of NAD2IDH specific activities during
pollen developmental process in Topas and Ken C1
　　从图 2 可以看出 ,不同发育时期种子的 NAD2IDH
比活力变化规律与花粉基本一致。在种子发育早期 ,
NAD2IDH比活力伴随种子的发育而增高 ,到 213～
312 mm角果时期达最高值 ,此时垦 C1 为 5102～5106
U/ mg 蛋白 ,Topas 为 7189～7198 U/ mg 蛋白 ;随后逐
渐下降 ,但与花粉相比 ,下降的趋势相对平缓。角果
发育后期的酶比活力仍显著高于角果发育前期的酶
比活力。表明与花粉不同 ,种子发育后期仍需要较
为旺盛的能量代谢。
212 　不同发育时期花粉与种子 NAD2ID H亚基 1 基
因 mRNA的定量分析
　　蛋白质 (酶)源于其 mRNA 的翻译。不同发育时
图 2 Topas 与垦 C1 种子发育过程中的 NAD2IDH比活力比较
Fig12 The comparison of NAD2IDH specific activities during
seed developmental process in Topas and Ken C1
期花粉与种子 NAD2IDH比活力均比叶片的高 ,且其
变化呈抛物线状 ,这是否由其 mRNA 量的差异所致 ?
为此 ,我们以 Topas 为材料 ,采用 RNA 定量斑点杂交
和定量 RT2PCR 两种方法分析了花粉或种子发育过
程中 NAD2IDH亚基 1 基因的转录规律。结果见图 3
和图 4。
花粉发育过程中 RNA 定量斑点杂交结果显示 ,
在四分体期、单核期、双核期、三胞期、成熟早期及成
熟晚期 ,杂交出明显亮斑的最少 RNA 量分别为 210
μg、110μg、015μg、0125μg、015μg 和 210μg (图 32
A) 。即该基因表达的 mRNA 量在三胞期最高 ,双核
期和成熟早期次之 ,单核期较低 ,四分体期和成熟晚
期最低。叶片则至少需要 210μg RNA 才有明显杂
交亮点 ,显示叶片中该基因 mRNA 量很低。
为避免同源基因对杂交信号的影响 ,笔者时进
行了 Bnidh12C基因的定量 RT2PCR 分析 ,其结果见
图 32B。从中不难看出 ,亚基 1 基因 mRNA 量的变化
规律与 RNA 定量斑点杂交的变化规律完全一致 ,这
种 mRNA 量的变化规律与酶比活力 (图 1) 规律完全
一致 ,也呈良好的抛物线状。
不同发育时期种子 RNA 定量斑点杂交结果 (图
42A)显示 ,在 213～312 mm 角果期出现明显亮斑需
要的最少 RNA 量最低 ,在此前后的各发育时期出现
明显亮斑需要的最少 RNA 量都要高 ,且在此之前的
各时期比在此之后的各时期需要的最少 RNA 量更
高 ,亚基 1 基因的 mRNA 表达量的这种变化规律与
其定量 RT2PCR 亮度 (图 42B)变化及酶比活力 (图 2)
规律也完全一致。
048 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

图 3 Topas 花粉发育过程中 RNA定量斑点杂交( A ,曝光 24 h)及定量 RT2PCR( B,30 循环)分析
Fig13 The quantitative dot hybridization ( A, exposure of 24 h) and RT2PCR ( B, 30 cycles) of
RNAs at different developmental stages of pollen in Topas
1 :四分体 ;2 :单核期 ;3 :双核期 ;4 :三核期 ;5 :成熟早期 ;6 :成熟晚期 ;7 :叶片 ;M:λ2 EcoT14I DNA 分子量标记。
1 :tetrad ;2 :uninucleate ;3 :dinucleate ;4 :trinucleate ;5 :early maturity ;6 :late maturity ;7 :leaf ;M:DNA marker ofλ2 EcoT14I1
图 4 Topas 种子发育过程中 RNA定量斑点杂交
( A ,曝光 24 h)及定量 RT2PCR( B,30 循环)分析
Fig14 The quantitative dot hybridization ( A, exposure of
24 h) and RT2PCR ( B, 30 cycles) of RNAs at different
developmental stages of seed in Topas
1 :叶片 ;2 :角果宽 < 115 mm ;3 :角果宽为 115～212 mm ;
4 :角果宽为 213～216 mm ;5 :角果宽为 217～312 mm ;
6 :角果宽为 313～316 mm ;7 :角果宽 > 317 mm。
1 :leaf ;2 :pod width < 115 mm ;3 :pod width is 115～212 mm ;
4 :pod width is 213～216 mm ;5 :pod width is 217～312 mm ;
6 :pod width is 313～316 mm ;7 :pod width > 317 mm1
213 　品种(系)间叶片 NAD2ID H比活力比较
从表 1 可以看出 ,油菜品种 (系) 间酶比活力存
在显著差异 ,Topas 最高 (1122 U/ mg 蛋白) ,为垦 C1
的 12711 % ;恢复系“垦 C1”次之 (0196 U/ mg 蛋白) ;
保持系“陕 2B”再次之 ,为垦 C1 的 5914 % ;不育系
“陕 2A”最低 ,仅为垦 C1 的 3916 %或为陕 2B 的
6617 %。即陕 2A 的三羧酸代谢活性最低、陕 2B 次
之、垦 C1 再次之、Topas 最高 ,这与其品种 (系) 农艺
特性相吻合。在生产中 ,Topas 是广泛推广品种 ,垦
C1 也是正常可育的品系 (制种用) ,植株高大 ,叶片
宽厚 ,结荚率高。陕 2B 与陕 2A 一样 ,植株相对矮
小。陕 2B 虽可育 ,但结荚率很低。陕 2A 花粉完全
不育 ,需要其他材料提供花粉才能结荚 ,且结荚率非
常低。
214 　品种(系)间叶片 NAD2ID H亚基 1 基因 mRNA
的定量分析
　　品种 (系) 间叶片 NAD2IDH 比活力差异是否由
基因的 mRNA 表达量差异所致 ? 本文以亚基 1 基因
( Bnidh12C)为探针对 4 个品种 (系) 叶片 RNA 进行
148　第 7 期 陈喜文等 :NAD2IDH亚基 1 基因在油菜花粉与种子发育过程中的表达规律 　　　

了定量斑点杂交和定量 RT2PCR 分析 ,结果见图 5。
在试验设置的 RNA 点样量范围内 ,品种 (系) 间斑点
亮度差异不明显 ,表明油菜品种 (系) 间叶片 NAD2
IDH 基因在 mRNA 量上没有明显差异 ,也就是说油
菜品系间叶片NAD2IDH比活力差异不是基因 mRNA
量差异所致。
表 1 不同品种(系)叶片 NAD2IDH比活力比较
Table 1 The comparison of leaf NAD2IDH specific activities
in different cultivars or lines
品种 (系)
Cultivar or line
酶比活力
Specific activity
(U/ mg protein) a)
酶相对活力
Relative activity
( %)
陕 2A Shaan 2A 0138 D 3916
陕 2B Shaan 2B 0157 C 5914
垦 C1 Ken C1 0196 B 10010
Topas 1122 A 12711
　　注 :处理间数据经新复极差检测 (1 %水平) 。
Note : Values followed by a different letter are significantly different as
indicated by Duncan’s Multiple Range Test at P = 01011 A indicates the
highest and D the lowest1
图 5 不同品种(系)的叶片 RNA定量斑点杂交
( A ,曝光 144 h)及定量 RT2PCR( B) 分析
Fig15 The quantitative dot hybridization ( A, exposure of
144 h) and RT2PCR ( B) of leaf RNAs from different
cultivars or lines
1 ,5 :陕 2A ;2 ,6 :陕 2B ;3 ,7 :垦 C1 ;4 ,8 :Topas ;
图 52B 的泳道 1～4 :36 循环 ;泳道 5～8 :42 循环。
1 ,5 :Shaan 2A ;2 ,6 :Shaan 2B ;3 ,7 : Ken C1 ;4 ,8 :Topas ;
Lane 1 - 4 in Fig1 52B :36 cycles ;lane 5 - 8 :42 cycles1
3 　讨论
NAD2IDH是一个核编码的线粒体酶 ,在细胞核
内转录成 mRNA ,在细胞质中翻译成蛋白质 ,最后被
转运到线粒体中发挥作用。NAD2IDH 比活力的比
较发现 ,不同发育时期花粉与种子的酶比活力都明
显高于叶片的 ,这暗示与叶片相比 ,花粉与种子发育
过程中需要更多的NAD2IDH ,需要更高的能量代谢。
这与前人报道的花药细胞对能量的需求量远远大于
植物营养生长时期的结论[15 ]一致。
不同发育时期的花粉或种子 NAD2IDH 比活力
显著不同 ,但共同遵循着抛物线的变化规律 ,即随着
发育的推进 ,酶比活力逐步提高 ,到某一个时期 (花
粉在三胞期 ,种子在 213～312 mm 角果时期) 达到最
高 ,然后再逐渐降低。由于 NAD2IDH 是三羧酸循环
中的限速酶 ,因此推测在花粉与种子发育过程中 ,其
能量代谢呈现一个由弱转强、再转弱的进程。RNA
定量斑点杂交和定量 RT2PCR 研究发现 ,酶比活力
的这种抛物线变化规律与基因 Bnidh12C mRNA 量
的变化规律一致。换句话说 ,在花粉与种子发育过
程中 ,NAD2IDH 是由 mRNA 控制的 ,由于 NAD2IDH
各亚基基因是单拷贝的[7 ] ,Topas 和垦 C1 又是正常
可育的材料 ,因此我们推测正常可育油菜的花粉与
种子 NAD2IDH亚基 1 基因的表达不受转录后机制
所制约。这与在油菜种子萌发 2～3 d 时 NAD2IDH
基因表达的规律相一致[9 ] ,即 NAD2IDH 的表达受
mRNA 水平调控 ,而与黄瓜种子萌发过程中 NAD2
IDH基因表达的规律不同[9 ] 。
然而 ,当笔者将不育系陕 2A 和相应保持系陕
2B 的叶片 NAD2IDH与正常可育的 Topas 及垦 C1 的
叶片 NAD2IDH一起比较 ,发现品种 (系) 间酶比活力
存在明显差异 ,但其亚基 1 基因 mRNA 定量分析结
果几乎没有区别。也就是说 ,品种 (系) 间 NAD2IDH
亚基 1 基因 mRNA 量与酶比活力间没有相关性 ,即
其 NAD2IDH的表达受转录后水平调控 ,这与油菜幼
苗发育过程中 NAD2IDH基因表达规律相一致 [9 ] ,而
且这种花粉、种子和叶片 NAD2IDH 基因调控机制的
差异与前人报道结果一致[9 ] 。在能量代谢旺盛的组
织中 ,其 NAD2IDH 的表达受 mRNA 水平调控 ;而在
能量代谢较低或者光合作用的组织中 ,其 NAD2IDH
的表达受转录后水平调控。NAD2IDH 的转录后水
平调控是限制三羧酸循环中碳类物质通过脱羧途径
代谢的机制之一[9 ] 。
248 　　　　作 　　物 　　学 　　报 第 31 卷 　

另外 ,前文[8 ]中笔者发现 ,陕 2A、陕 2B、垦 C1
与拟南芥 NAD2IDH在氨基酸组成上存在差异 ,但其
体外表达的酶比活力并无差异 ,由此推测品种 (系)
间 NAD2IDH比活力的差异不是其氨基酸序列的差
异所致 ,而是由 NAD2IDH亚基 1 基因 mRNA 异常引
起。所以 ,尽管陕 2A 和陕 2B 的 mRNA 量与垦 C1
和 Topas 的差异不大 ,但由于陕 2A 和陕 2B 的亚基 1
基因 mRNA 中存在高达 14 %～33 %的缺失突变 ,而
这些缺失仅发生在几个碱基中[8 ] ,因此 mRNA 在
RNA 定量斑点杂交中能与探针正常杂交 ,在定量
RT2PCR 后的电泳条带中也不会表现差异 ,但缺失突
变的亚基却不能表现正常功能 ,从而导致活性 NAD2
IDH减少 14 %～33 % ,影响细胞内能量代谢。由于
叶片需要的能量和三羧酸循环代谢产物相对较少 ,
因此 ,不影响叶片的正常发育。但对于需要更多能
量和代谢产物的花粉或种子而言 ,也许这种异常转
录对其发育的影响是致命的 ,这可能是引起植物雄
性不育或花而不实的原因之一。由于雄性不育或花
而不实的植物没有可供研究的花粉或种子 ,因此本
结论仅仅是推测 ,需要更多的实验来验证。
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