全 文 ：第 26 卷 第 6 期 作　物　学　报 V o l. 26, N o. 6
2000 年 11 月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA N ov. , 2000
芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性X
甘　莉　孟金陵XX
(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室, 湖北 武汉 430070)
提　要　用已知的拟南芥抗病性基因的 8 对引物对 60 个芸薹属作物和 1 份拟南芥品系进行了遗传多
样性分析, 除GPA 1, PR 1 外, 其他 6 对引物的同源片段都被检测到。其中与A tlox l1, B GL 2, R PS 2
及 PG11 四个基因同源的片段检出率较高, 分别为 62. 5% , 94. 7% , 87. 5%及 100%。用这些同源片段
估计了甘蓝型油菜抗耐菌核病材料中油 821、中R 783、中R 888、宁R S21 之间的遗传距离。聚类分析
结果表明, 中R 783 与中R 888 的遗传距离较近, 为 0. 0323。中R 783, 中R 888 与宁 R S21 三个抗病品
系之间的遗传距离为 0. 1007。这三个品系与中油 821 的遗传距离为0. 2463, 与拟南芥的遗传距离为
0. 4979。由于籍以进行聚类分析的遗传标记是与抗病有关基因同源的DNA 序列, 因此, 四个甘蓝型油
菜抗病品系间的遗传距离应当或多或少反应了它们之间在抗病性遗传基础上的差别。从 61 份DNA 样
品中扩增出与B GL 2 和 R PS 2 同源的多态性片段的数据合并作聚类分析, 在这两个基因同源序列的多
样性上, 芸薹属作物与拟南芥相似性为 44% , 60 份芸薹属作物供试材料在 56% 的水平上聚为一类。在
相似性为 70% 的水平上可将这些材料分为 5 个组: É . 包括 1 个黑芥品种和所有参与测试的 6 个甘
蓝, 1 个埃芥品系和 23 个甘蓝型油菜品种。˚ . 1 个埃芥品系和 14 个甘蓝型油菜品种。¸ . 有 7 个甘
蓝型油菜品种。Ì . 含 4 个甘蓝型油菜品种。˝ . 含 3 个甘蓝型油菜品种。值得注意的是, 两个甘蓝型
抗病品系中R 888 和中R 783 仍聚在一起, 而中油 821 和宁R S21 却分别聚在第 3 组和第 4 组。
关键词　油菜; 拟南芥; 抗病性基因; 扩增片段
Genetic D ivers ity Ana lys is of B rass ica Genus for the L oc i
Hom ologous to the D isea se Resistan t Genes
CAN L i　M EN G J in2L ing
(N ationa l K ey L abora tory C rop Genetic Imp rovem en t, H uaz hong A g ricu ltu ra l U niversity , W uhan 430070)
Abstract　　T he genet ic d iversity of loci hom o logou s to d isease resistan t genes w as ana lyzed
in B rassica genu s u sing eigh t pa irs of p rim ers designed from know n disease resistan t genes of
A rabid op sis tha liana. DNA fragm en ts hom o logou s to 6 of 8 genes had been detected in 60
cu lt ivars o r lines of B rassica crop s, m ain ly B . nap us, and one line of A rabid op sis. T he
detect ing efficiency fo r the hom o logou s loci to A tlox l1, B GL 2, R PS 2 and PG11 w ere h igh,
62. 5% , 94. 7% , 81. 5% and 100% respect ively. T he hom o logou s fragm en ts w ere a lso
am p lif ied from fou r S clerotin ia sclerotiorium resistan t lines, Zhongyou821, ZhongR 2783,
ZhongR 2888 and N ingR S21. C lu st ana lysis show ed tha t the genet ic d istance betw een
ZhongR 2783 and ZhongR 888 is as sho rt as 0. 0323, w h ile the d istance betw een the tw o and
N ingR S21 is 0. 1007. Zhongyou821 and A rabid op sis have a rela t ively la rge genet ic d istance
X
XX 通讯联系人, E2m ail: jm eng@public. w h. hb. cn
收稿日期: 1999209227, 接受日期: 2000203208
国家 863 高技术项目和国家自然科学基金项目资助

w ith the th ree resistan t lines, 0. 2463 and 0. 4979 respect ively. Since the genet ic m arkers
app lied in clu st ana lysis are the DNA sequences hom o logy to the d isease resistan t genes, the
above data m o re o r less rep resen t the d ifference of genet ic background invo lving disease
resistance. T he clu st ana lysis w as a lso conducted u sing the com b ined data derived from the
am p lif ied po lym o rph ic fragm en t hom o logy to B GL 2 and R PS 2 from 61 DNA sam p les. It
dem on stra ted tha t the sim ila rity betw een B rassica genu s and A rabid op sis w as 44%. 60
accession s from B rassica can be gathered in to one group at the sim ila rity level of 56% , and
in to five group s a t the sim ila rity level of 70%. T he five group s are: Group É , includ ing 1
cu lt ivar of B rassica n ig ra , a ll six lines of B . oleracea accession s, 1 line of B . ca rina ta and 23
cu lt ivars B . nap us. Group ˚ , 1 line of B . ca rina ta and 14 cu lt ivars of B . nap us. Group ¸ ,
7 cu lt ivars of B . nap us. Group Ì , 4 cu lt ivars of B . nap us. Group ˝ , 3 cu lt ivars of B .
nap us.
Key words 　 　B rassica nap us; A rabid op sis tha liana; Sequence hom o logou s to d isease
resistan t genes; Am p lif ied fragm en ts
植物在进化过程中, 经受着各种病原体的侵害, 在长期抵抗侵染的相互作用及其进化
中, 逐渐获得了对不同病原体的不同抗性。这种抗病性资源是抗病育种的宝贵材料。随着现
代生物技术的广泛应用, 对抗病的分子基础已有了认识。近年来通过分子标记定位于染色体
上的抗病基因已经逾百。截止 1997 年, 至少已有 14 个抗病基因被克隆[ 1 ]。从已有克隆基因
的序列分析表明, 几乎所有的抗病基因均存在丰富亮氨酸重复序列 (L eucine2rich repea t,
L RR ) [ 2 ] , 许多基因同时还存在核苷酸结合位点 (nucleo t ide2b ind ing site, NBS) 或丝氨酸2苏
氨酸激酶 (serine2th reon ine k inase, ST K) 等同源序列。这种序列广泛存在于植物抗病基因中
的结构域, 很可能决定着寄主与病原的特异性识别、信号传导、蛋白激酶[ 3 ]的磷酸化或自磷
酸化等[ 4, 5 ]。另外, 植物在遭受各种类型病原入侵时, 可以诱导一些与抗病性有关的防卫基因
( defen se genes) 的表达, 产生多种形式的防卫反应来拮抗[ 6 ]。如: 产生植物防卫素 (p lan t
defen sin s) [ 7 ]、几丁质酶[ 8 ]、葡聚糖酶、蛋白质抑制剂等病原相关蛋白来限制病菌的进一步侵
入。抗病基因和抗性相关基因 (本文中将这两类基因统称为抗病性基因) 的克隆以及各类克隆
在不同植物DNA 序列的保守性, 不仅为采用同源法寻找并克隆新的抗性基因开拓了新途
径[ 9 ] , 也为估计这些基因的遗传变异提供了新的工具。
拟南芥 (A rabid op sis tha liana ) 具有生育期短、染色体数目少和基因组小等特征, 一直被
用来作为植物遗传研究的模式植物, 已有一系列抗病基因及与抗病有关的基因被克隆[ 10 ]。大
量研究表明, 生物的基因组之间存在不同程度的相似性[ 11 ] , 而在各种作物中, 芸薹属作物与
拟南芥的关系最近, 同属芸薹族 (B rassiceae) , 有 86% 的编码蛋白质的DNA 序列在这两类植
物之间是保守的[ 12 ]。Robert 报道, 芸薹属A、B、C 三个基因组分别表现为大小是拟南芥基因
组三倍的复合体, 复合体的每一个组成部分不仅在基因组大小上和拟南芥相似, 且R FL P 分
子标记的排序也相当接近[ 13 ]。Kow alsk 等用芸薹属和拟南芥DNA 片段作探针, 检测到拟南
芥和甘蓝基因组之间存在着 11 个保守区域, 这些保守区覆盖了拟南芥基因组的 24. 6% 和甘
蓝基因组的 29. 9% [ 14 ]。T eu ton ico 和O sbo rn 在白菜与拟南芥中也检测到某些连锁保守性[ 15 ]。
因此, 人们可望率先在芸薹属作物中利用拟南芥的遗传信息。芸薹属中的甘蓝型油菜是我国
的主要油料作物, 种植面积约 6 百余万公顷, 但常年由于病害所造成的损失达 10%～ 20% ,
1566 期　　　　　　　　甘　莉等: 芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性　　　　　　　　　　　

而且还造成籽粒品质的严重下降。我国的科学工作者在发掘抗病性油菜品种资源方面做了大
量的工作, 但至今收效不大, 仅筛选到了几份抗性材料。本研究以拟南芥中已克隆的 8 个抗
病性基因保守序列设计的特异性引物, 对以甘蓝型油菜为主的芸薹属作物品种资源的DNA
为模板成功地进行了 PCR 扩增, 并依据 PCR 产物的凝胶电泳片段大小进行了遗传多样性分
析, 为油菜抗病性资源的开拓提供借鉴。
1　材料与方法
1. 1　选用了 61 份品种或材料, 其中甘蓝型油菜 (B rassica nap us) 51 份, 甘蓝 (B rassica
oleracea) 6 份、埃芥 (B rassica ca rina ta ) 2 份, 黑芥 (B rassica n ig ra)和拟南芥各 1 份。这些材料
主要来源于中国, 也包括加拿大、瑞典、英国、波兰、德国、法国、日本、澳大利亚等国的材
料。其来源见表 1。
表 1　　实验材料的编号及来源
Table 1　　The accession s of cultivars and l ines
编　号
N um ber
种　名
Species
基因组
Genom e
品种 (系)名
Strain o r cu lt ivars
来　源
Source
1 拟南芥 A rabid op sis tha liana T 拟南芥 A rabid op sis 英国 England
2 黑芥 B . n ig ra B Giebra 瑞典 Sw eden
3 甘蓝 B . olercea. botry tis C Greenia
4 甘蓝 B . olercea cap ita ta C A 12D ttd 英国 England
5 甘蓝 B . olercea cap ita ta C 甘蓝 2 号 Ganlan2 中国 Ch ina
6 甘蓝 B . olercea cap ita ta C 甘蓝 12 号 Ganlan12 中国 Ch ina
7 甘蓝 B . olercea cau lorap e C 苤蓝 P ielan 中国 Ch ina
8 甘蓝 B . olercea cau lorap e C 青苤蓝 Q ingp ielan 中国 Ch ina
9 甘蓝型油菜 B . nap us A C A pex GD S. DL F
10 甘蓝型油菜 B . nap us A C Bok. W okb 美国 U SA
11 甘蓝型油菜 B . nap us A C B risto l 法国 F rance
12 甘蓝型油菜 B . nap us A C Bullet
13 甘蓝型油菜 B . nap us A C B9225666 中国 Ch ina
14 甘蓝型油菜 B . nap us A C ECN 不育 ECNBuyu 中国 Ch ina
15 甘蓝型油菜 B . nap us A C Exp ress 德国 Germ any
16 甘蓝型油菜 B . nap us A C 甘油 5 号 Ganyou5 中国 Ch ina
17 甘蓝型油菜 B . nap us A C GT 2212 中国 Ch ina
18 甘蓝型油菜 B . nap us A C 华 1H ual 中国 Ch ina
19 甘蓝型油菜 B . nap us A C 黄籽 821 H uangzi821 中国 Ch ina
20 甘蓝型油菜 B . nap us A C 黄籽双低 H uangzishuangdi 中国 Ch ina
21 甘蓝型油菜 B . nap us A C 华油 8 号 H uayou8 中国 Ch ina
22 甘蓝型油菜 B . nap us A C 华油 11 号 H uayou11 中国 Ch ina
23 甘蓝型油菜 B . nap us A C 华油 12 号 H uayou12 中国 Ch ina
24 甘蓝型油菜 B . nap us A C 华油 14 号 H uayou14 中国 Ch ina
25 甘蓝型油菜 B . nap us A C 沪农早 H unongzao 中国 Ch ina
26 甘蓝型油菜 B . nap us A C Janus 瑞典 Sw eden
27 甘蓝型油菜 B . nap us A C Karat 加拿大 Canada
28 甘蓝型油菜 B . nap us A C Kunto 加拿大 Canada
29 甘蓝型油菜 B . nap us A C Kw 30 日本 Japan
30 甘蓝型油菜 B . nap us A C 老红甘 L aohonggan 中国 Ch ina
31 甘蓝型油菜 B . nap us A C 凉油 4 号 L iangyou4 中国 Ch ina
32 甘蓝型油菜 B . nap us A C L ibra 波兰 Po land
33 甘蓝型油菜 B . nap us A C L ipo rta 德国 Germ any
34 甘蓝型油菜 B . nap us A C L iraw ell 加拿大 Canada
256　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

续表 1　
编　号
N um ber
种　名
Species
基因组
Genom e
品种 (系)名
Strain o r cu lt ivars
来　源
Source
35 甘蓝型油菜 B . nap us A C M ajo r 法国 F rance
36 甘蓝型油菜 B . nap us A C M andarin (WO SR )
37 甘蓝型油菜 B . nap us A C M andarin
38 甘蓝型油菜 B . nap us A C M arnoo 澳大利亚 A ustralia
39 甘蓝型油菜 B . nap us A C M ars
40 甘蓝型油菜 B . nap us A C 宁RS21N ing RS21 中国 Ch ina
41 甘蓝型油菜 B . nap us A C 日本君脂油菜 R iBen junzh iyoucai 日本 Japan
42 甘蓝型油菜 B . nap us A C 胜利清梗 Shengliqinggeng 中国 Ch ina
43 甘蓝型油菜 B . nap us A C Sponso r
44 甘蓝型油菜 B . nap us A C Stellar 瑞典 Sw eden
45 甘蓝型油菜 B . nap us A C 铁杆青 T ieganqing 中国 Ch ina
46 甘蓝型油菜 B . nap us A C Topo s 加拿大 Canada
47 甘蓝型油菜 B . nap us A C 皖油早W anyouzao 中国 Ch ina
48 甘蓝型油菜 B . nap us A C W esbrook 澳大利亚 A ustralia
49 甘蓝型油菜 B . nap us A C W esw ay 澳大利亚 A ustralia
50 甘蓝型油菜 B . nap us A C 杏黄花 X inghuanghua 中国 Ch ina
51 甘蓝型油菜 B . nap us A C 油光叶 Youguangye 中国 Ch ina
52 甘蓝型油菜 B . nap us A C 云油 5 号 Yunyou5 中国 Ch ina
53 甘蓝型油菜 B . nap us A C 早熟胜利油菜 Zao shushengliyoucai 中国 Ch ina
54 甘蓝型油菜 B . nap us A C 中油 821 Zhongyou821 中国 Ch ina
55 甘蓝型油菜 B . nap us A C 中R 2888 ZhongR 2888 中国 Ch ina
56 甘蓝型油菜 B . nap us A C 中R 2783 ZhongR 2783 中国 Ch ina
57 甘蓝型油菜 B . nap us A C 中油 324 Zhongyou 中国 Ch ina
58 甘蓝型油菜 B . nap us A C 中油 333 Zhongyou 中国 Ch ina
59 甘蓝型油菜 B . nap us A C 922166 中国 Ch ina
60 埃塞俄比亚芥 B . carina ta BC 1016721 埃塞俄比亚 E th iop ia
61 埃塞俄比亚芥 B . carina ta BC 1016722 埃塞俄比亚 E th iop ia
1. 2　在 5～ 8 片真叶期, 从每个品种 (系) 的 5 个单株上采集幼嫩真叶, 混合, 保存于- 70℃
冰箱, 用李佳等[ 16 ]的方法提取并纯化DNA。
1. 3　英国东英格兰大学的肖顺元博士提供了根据拟南芥抗病性基因保守序列设计的 8 对特
异性引物。与引物扩增有关的基因名称及 PCR 反应条件见表 2。25 LL PCR 反应体积中, 含
40～ 60 ngDNA 模板, 1～ 2 U T aq DNA 聚合酶, 2～ 3 mm o lö L M gC l2, 160～ 200 Lm o lö L
dN T P, 参照廖玉才等[ 17 ] 的方法另外加入 0. 01% gela t ion, 2 Lm o lö L 四甲基氯化铵
(TM A CL )。PCR 反应条件为 94℃变性 2分钟 , 然后 94℃变性 30～ 45 秒, 52～ 61℃复性
30～ 45 秒, 34 个循环最后 72℃延伸 2 分钟。每对引物均有不同的复性温度, 不同的变性与
复性时间。其条件如表 2。1. 4% A garo se 电泳 (TA E 系统) , EB 染色, 紫外透射仪观察、照
相并记录结果。
1. 4　记录各样本中产生的多态性条带, 同一位点上有条带记为 1, 无电泳条带记为 0。输入
计算机。根据V irk 和 Fo rd2loyd (1995)的公式计算遗传距离[ 18 ] , 该计算公式为:
GD = ∑[A i - B i ] ö n
　　其中GD (Genet ic d istance)为遗传距离, A 、B 为不同的样本数, i 为扩增位点数, n 为某
一引物扩增位点总数。
3566 期　　　　　　　　甘　莉等: 芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性　　　　　　　　　　　

表 2　　基因及 PCR 扩增的条件
Table 2　　Genes and PCR condition s for amplify ing
据以设计引物的基因名称
T he nam e of genes related
to the specific p rim ers
复性温度
Renaturation
temperature (℃)
变性与复性时间
D enaturation and
renaturation tim e (s)
脂氧化酶基因
L ipoxygenase A tlox 1
61 45
葡聚糖基因
Beta gluco sidase B GL 2
53 45
连接蛋白基因
L ink p ro tein gene C trl1
53 30
编码 G 蛋白A 亚基基因
G p ro tein alpha subunit gene GPA 1
55 45
抗麦类核腔菌基因
Resistan t to Py rem op hora g ram inea PG11
52 30
病程相关蛋白 1 基因
Pathogenesis2related p ro tein 1 PR 1
55 30
抗表达毒性的假单胞杆菌基因
avrRpm l R PM 1
60 45
抗假单胞杆菌基因
Resistan t to P selld om onas sy ring R PS 2
60 45
　　根据上述公式用计算
机计算每个基因片段在群
体内的遗传距离, 并用
N T SYS 软件统计分析, 根
据 U PGM A (U nw eigh ted
pair group m ethod w ith
arithm et ic m ean) 方法构建
表征树。
2　结果与分析
2. 1　用拟南芥抗病性基因
特异性引物扩增芸薹属作
物D NA 模板的 PCR 产物
特征
我们用 8 对特异性引物
在拟南芥DNA 中都扩增出
了相应的DNA 序列片段,
其片段长度与该基因相应区段的长度相符。用B GL 2、R PM 1 和R PS 2 基因有关的引物扩增的片
段各达到3 条, 似乎表明了基因家族的存在。当以芸薹属作物DNA 作模板, 用这8 对引物测试油
菜的遗传多样性时, 除 GPA 1, PR 1 外, 其它 6 对引物均扩增出了多态性片段。其中用与
A tlox 1, B GL 2, R PS 2 及 PG11 四对基因有关的引物扩增时, 在较多的油菜品种中
获得了PCR 产物, 分别占供试品种数的62. 5% , 94. 7% , 87. 5% 及100%。当用某个拟南芥
表 3　　特异性引物在拟南芥和芸薹属作物中扩增的D NA 片段的特征
Table 3　　Character istic of PCR products amplif ied from A rabidop s is and B rass ica crops with the spec if ic pr imers
据以设计引物
的基因名称
T he nam e of
genes
related to
the specific
p rim ers
在拟南芥中
扩增的片段
Bands
amp lified
from
A rabid op sis
在油菜等芸薹属作物中扩增的片段
Bands amp lified from rapeseed and o ther B rassica crop s
是否有与拟南芥片
段长度相同的条带
W hether there is a band
sim ilar w ith that of in
A rabid op sis on size
扩增的总
条带数
To tal
bands of
amp lified
多态性
条带数
N o. of
po lymo rph ic
bands
测试样
本　数
N o. of
samp les
tested
有条带的
样本数
N o. of samp les
w ith amp lified
bands
A tlox 1 2. 2 kb3 (1) 3 3 + 5 2 61 60
B GL 2 1. 6 kb (3) + 7 6 61 61
C trl1 130 bp (1) - 4 4 60 16
GPA 1 1. 6 kb (0) - 0 0 10 0
PG11 1. 3 kb (2) + 4 2 14 14
PR 1 1. 0 kb (0) - 0 0 30 0
R PM 1 2. 7 kb (3) + 5 3 30 10
R PS 2 2. 6 kb (3) + 8 8 61 61
　　3 所给出的片段大小为预期的该基因片段长度　　3 Bands amp lified from A rabid op sis on size
　　3 3 括号中的数字表示在拟南芥中扩增出的与预期片段长度不同的其它片段数目
　　3 3 B racket show s N o. of differen t bands in A rabid op sis on size
　　+ 表示有与拟南芥中有关基因预期片段大小相同的条带, - 表示没有相同的条带
　　+ T here is a band sim ilar w ith that of in A rabid op sis, - T here is no band in the sam e size
456　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

1 A . tha liana　2 N ing RS21　3 Zhong 　　　
R 2783　4 Zhong R 2888　5 Zhongyou 821　　　
6 KDNA ö E co R. É + H ind¸ 　　　
图 1　　以基于 PG11 的引物从 4 个抗　　　
(耐)菌核病品种 (系)中扩增的DNA 片段　　　
F ig. 1　　DNA fragm ents amp lified from 　　　
disease resistance lines of B . nap us　　　
w ith p rim ers based on PG11　　　
1 A . tha liana　2. Zhong R 2783　3. Zhong R 2888　　
4 N ing RS21　5 Zhongyou 821　　
图 2　甘蓝型油菜 4 个抗病品种 (系)的聚类图　　
F ig. 2　D endrogram of 4 disease resistance 　　
cu lt ivars ( lines) of B . nap us　　
　
　　
表 4　　四份抗病材料与拟南芥中抗病相关位点扩增的片段特征
Table 4　　Character istic of amplif ication loc i of A. tha liana resistance disease related in four l ines of B. nap us
据以设计引物的基因名称
T he nam e of genes related
to the specific p rim ers
项目　 Item
中油 821
Zhongyou
821
中R 2783
Zhong
R 2783
中R 2888
Zhong
R 2888
宁RS21
N ing
RS21
A tlox 1 2. 2 kb3 - - - -
油菜特异条带 Characterist ic - + + +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 0 1 1 1
B GL 2 1. 6 kb3 - - - -
油菜特异条带 Characterist ic + + + +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 1 4 4 4
C trl1 130 bp3 - - - -
油菜特异条带 Characterist ic - - - +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 0 0 0 2
PG11 1. 3 kb3 - + + +
油菜特异条带 Characterist ic + + + +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 2 4 4 4
R PM 1 2. 7 kb3 - - - -
油菜特异条带 Characterist ic - + + +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 0 2 2 2
R PS 2 2. 6 kb3 + + + +
油菜特异条带 Characterist ic + + + +
band in B . nap us
多态性条带 Po lymo rph ic 5 6 6 5
　　3 指以拟南芥DNA 为模板时扩增的特异性片段
　　3 T he bands w hen using A . tha liana DNA as model characterist ic
5566 期　　　　　　　　甘　莉等: 芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性　　　　　　　　　　　

抗病性基因特异性引物在芸薹属作物中检测到有关片段时, 往往既检测到与拟南芥扩增片段
分子量相同的片段, 又有片段长度上的多态性变异, 这似乎表明这些基因同样以基因家族的
形式存在于芸薹属作物中 (表 3)。
2. 2　以拟南芥抗病性基因特异性引物的扩增片段估计甘蓝型油菜抗耐菌核病材料间的遗传
距离
中油 821、中R 783、中 R 888 和宁 R S21 是我国培育和筛选的抗菌核病品种或品系。用
A tlox l1, B GL 2, C trl1, PG11, R PM 1 和R PS 2 等 6 个抗病性基因的特异性引物, 从上述四
份材料的DNA 中均扩增出了相关片段 (图 1)。其中用 PG 11 和R PS 2 的两个特异性引物分别
在 3 个和 4 个品种 (系)中扩增出与拟南芥特异性片段大小相同的片段, 其余四对抗病性基因
特异性引物仅扩增出了油菜所特有的片段 (表 4)。
根据这些扩增片段的信息, 对这 4 个抗病品种及拟南芥进行了聚类分析。结果表明, 中
R 2783 与中R 2888 的遗传距离较近, 为 0. 0323。中R 2783, 中R 2888 与宁R S21 三个抗病品系
之间的遗传距离仅为 0. 1007。这 3 个品系与中油 821 的遗传距离为 0. 2463, 它们与拟南芥的
遗传距离为 0. 4979 (图 2)。由于籍以进行聚类分析的遗传标记是与用抗病性基因特异性引物
扩增的DNA 序列, 因此, 4 个甘蓝型油菜抗病品系间的遗传距离应当或多或少反应了它们之
间在抗病性遗传基础上的差别。
1～ 12, 14～ 25 为油菜品种 (系) , 13 KDNA ö E coR É + H ind¸
图 3　　以基于B GL 2 的引物从油菜中扩增的DNA 片段
F ig. 3　　DNA fragm ents amp lified from rapeseeds w ith p rim ers based on B GL 2
1～ 8, 10～ 20 为油菜品种 (系) , 9 KDNA ö E coR É + H ind¸
图 4　　以基于R PS 2 的引物从油菜中扩增的DNA 片段
F ig. 4　　DNA fragm ents amp lified from rapeseeds w ith p rim ers based on R PS 2
656　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷

2. 3　用BGL 2 和RPS 2 的特异性引物在芸薹属作物品种资源中检测到的遗传多样性
用B GL 2 和R PS 2 特异性引物在所有 61 个供试材料的DNA 样品中均扩增出了片段 (图
3, 4)。其中用B GL 2 的特异性引物扩增出了 6 个不同长度的片段, 分子量变化在 2000 bp 到
100 bp 之间, 用R PS 2 的特异性引物扩增出的 8 个不同片段的分子量大小在 3000bp 到 100bp
图 5　　油菜品种聚类图。各品种编号代表的品种名称见表 1
F ig. 5　　D endrogram of cu lt ivars of rapeseeds.
T he num bers rep resen t cu lt ivars show n in tab le 1.
之间, 这似乎表明在芸薹属作物中与
R PS 2 位点有关的遗传变异大于B GL 2。
　　将用B GL 2 和R PS 2 特异性引物从上
述 61 份DNA 样品中扩增出的多态性片
段的数据合并作聚类分析。结果表明, 在
这两个基因的扩增序列多样性上, 芸薹属
作物与拟南芥相似性为 44% , 60 份芸薹
属作物供试材料在 56% 的水平上聚为一
类。在相似性为 70% 的水平上可将这些材
料分为 5 个组。É : 包括 1 个黑芥和所有
参与测试的 6 个甘蓝, 1 个埃芥和 23 个甘
蓝型油菜。˚ : 含 1 个埃芥和 14 个甘蓝型
油菜。¸ : 有 7 个甘蓝型油菜。Ì : 含 4 个
甘蓝型油菜。˝ : 含 3 个甘蓝型油菜。值
得注意的是, 与图 1 相比较, 两个甘蓝型
抗病材料中R 888 和中R 783 仍聚在一起,
而中油 821 和宁 R S21 却分别聚在第 3 组
和第 4 组 (图 5)。
3　讨论
植物抗病基因及其家族含有同源序
列, 已受到广泛的重视。人们已开始用抗
病基因同源序列的方法从大豆、马铃薯、
水稻中克隆了抗病基因[ 9 ]。B GL 2、R PS 2、
PG 11 等抗病基因的特异性引物在油菜抗
性品系中不仅检测出 PCR 产物在片段长
度上的多态性, 而且 3 个抗病品系还具有
其独特的片段。但这些片段是否为抗病基
因片段, 必须作进一步的克隆和测序分析
才能确定。
拟南芥 8 个抗病基因的特异性引物对
61 份油菜样本进行的测试表明, 仅
R PS 2, B GL 2, A tlox l1 和 PG 11 的同源片
段在所测试样本中存在较高的阳性率, 而
其它几个基因的同源片段检测的阳性率极低。这说明在不同的油菜样本中存在着丰富的遗传
7566 期　　　　　　　　甘　莉等: 芸薹属作物抗病性基因同源位点上的遗传多样性　　　　　　　　　　　

变异。它们含有不同扩增的DNA 序列, 所以不同的基因在不同的样本中靶序列的存在与否
是不尽相同的。
　　拟南芥抗性基因特异性引物扩增片段在油菜资源中的广泛存在, 似乎表明不论是抗病品
种还是感病品种都含有抵御病原入侵的抗性基因。植物的抗病基因不是字义上的具有抗病功
效的基因, 而是指基因对基因假说中的寄主植物中与病原无毒基因表现非亲和性互作的基
因[ 19 ] , 除此之外的使植物表现抗病性功效的基因称防卫基因, 防卫基因及其表达并不像抗病
基因那样仅抗病植株所特有, 而是感病植株也存在。植物在受到病原菌侵染时通过诱导产生
防卫反应来拮抗, 感病植株中的防卫基因相对抗病植株被激活得慢和表达微弱得多而已[ 7 ]。
在油菜中抗性基因特异性引物扩增的片段分布与油菜品种 (系)之间的亲缘关系并不完全
相同。黑芥品种 Gieb ra 与 3 个甘蓝型油菜 324, Exp ress, M ajo r 聚为一类, 但在其亲缘关系
上它们之间相差较远, Gieb ra 属B 基因组, 而另 3 个甘蓝型油菜是A C 基因组, BC 基因组的
2 个埃芥及其杂交种在 70% 的水平上分布在B 组与C 组, 6 个C 基因组的甘蓝虽然都聚在B
组, 但它们之间 (B 组内)的相似性小于组内其他甘蓝型油菜之间的相似性。
甘蓝型油菜中所发现的 3 个抗耐菌核病 (S clerotin ia sclerotiorum ) 品系, 中 R 2783, 中 R 2
888, 宁R S21, 在抗性基因特异性引物扩增的片段分析中, 分别聚类在B 组和 E 组; 中R 2783
与中R 2888 具有 95% 以上的相似性, 而宁R S21 与二者仅有 65% 的相似性, 这表明不同的抗
病品系具有明显不同的抗病遗传基础。陈爱武等应用RA PD、ST S 分析的结果表明, 来源十
分不同的 5 份抗 (耐) 菌核病材料有一定的亲缘关系, 其中中 R 2783 与中 R 2888 较近, 与宁
R S21 遗传距离较远[ 20 ] , 这与本文的结果相似。只是本文所检测到的遗传距离绝对值比陈爱
武等的要偏小些, 这可能是使用的标记类型和样本大小的不同所致。
致谢: 英国东英格兰大学肖顺元博士提供了拟南芥抗病基因特异性引物, 并对本文提出
了建设性意见。
参　考　文　献
1　赵建伟, 孟金陵. 高技术通讯, 1998, 8 (5) : 58～ 62
2　Bent A F, B N Kunkel, D D ah lbeck et al. S cience, 1994, 265: 1856～ 1860
3　M artin G B, S H B rommon schenkel, J Chunwongse et al. S cience, 1993, 262: 1432～ 1436
4　朱国峰, 瞿礼嘉, 顾红雅, 陈章良. 植物学报, 1997, 39 (6) : 561～ 169
5　张德水, 陈受宜. 植物病理学报, 1997, 27 (2) : 97～ 103
6　L am b C J , M A L aw ton, M D ron et al. Cell, 1989, 56: 215～ 224
7　B rokaert W F, F R G T erras, B P A Camm ue et al. P lan t P hy siol, 1995, 108: 1353～ 1358
8　Chang M M , D , Ho rovitz D Culley et al. P lan t M ol B iol, 1995, 28: 105～ 111
9　王石平, 刘克德, 王江, 张启发. 植物学报, 1998, 40 (1) : 42～ 50
10　M elan M A , X Dong, M E Endara et al. P lan t P hy siol, 1993, 101: 441～ 450
11　汪向明. 武汉大学学报 (自然科学版) , 1993, 6: 100～ 104
12　沈利爽, 朱立煌. 生物工程进展, 1995, 15 (2) : 23～ 27
13　Robert L S, F Robson, A Sharpe, D L ydiate et al. P lan t M ol B iol, 1998, 37 (5) : 763～ 772
14　Kow alsk i S P, T H L an, K A Feldm ann et al. Genetics, 1994, 138: 499～ 510
15　T euton ico R A , T C O sbo rn. T heor A pp l Genet, 1994, 89: 885～ 894
16　李佳, 沈斌章, 韩继祥, 甘莉. 华中农业大学学报, 1994, 13 (5) : 521～ 523
17　廖玉才, 李和平. Rainer F ischer. 遗传, 1997, 19 (2) : 1～ 4
18　V irk P S, B V Fo rd2loyd. H ered ity , 1995, 74: 170～ 179
19　Dong X, M , M indrino s K R D avis et al. P lan t Cell, 1991, 3: 61～ 72
20　陈爱武, 赵建伟, 甘莉, 孟金陵. 中国油料作物学报, 1999, 21 (3) : 10～ 14
856　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　　 　　　　　　　　26 卷