全 文 ：Vol131 , No12
pp1 159 - 164 　Feb1 , 2005作 　物 　学 　报ACTA AGRONOMICA SINICA第 31 卷 第 2 期2005 年 2 月 　159～164 页
拟南芥 rd29A 基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用
张　宁　司怀军　王　蒂 3
(甘肃农业大学农学院 ,甘肃兰州 730070)
摘 　要 :从拟南芥 ( Arabidopsis thaliana)基因组中用 PCR 技术分离了 rd29A 基因上游 824 bp 的调控序列 ,序列分析表明 ,该
片段与已报道的 rd29A 启动子有 99139 %的同源性 ,包括缺水诱导表达元件 DRE、ABA 作用元件 ABRE等顺式作用元件。
将此片段与 GUS 基因连接构建了植物表达载体 pBIrd ,用农杆菌介导法获得了转基因马铃薯植株。对转基因植株进行
GUS 基因 Northern 杂交和 GUS 活性组织染色的分析结果是一致的 ,未受诱导处理的转基因植株 GUS 基因有微弱表达 ,
而 4 ℃低温逆境、100μmolΠL ABA、缺水和 250 mmolΠL NaCl 胁迫处理 24 h 均可诱导 GUS 大量表达 ,且 rd29A 启动子驱动的
GUS 基因表达无组织特异性。
关键词 :拟南芥 ; rd29A 基因启动子 ;转基因马铃薯 ;低温 ;ABA ;缺水 ;NaCl
中图分类号 : S532 ,Q78
Cloning of rd29A Gene Promoter from Arabidopsis thaliana and Its Application in
Stress2resistance Transgenic Potato
ZHANG Ning ,SI Huai2Jun ,WANG Di 3
( College of Agronomy , Gansu Agricultural University , Lanzhou 730070 , Gansu , China)
Abstract :The 824 bp upstream regulatory region of rd29A gene from Arabidopsis thaliana genome was amplified by PCR
technique1 Sequence analysis showed that this cloned fragment shared 99139 % identity with the reported rd29A promoter
and contained several cis2acting elements including dehydration responsive elements (DRE) and ABA responsive elements
(ABRE) 1 The plant expression vector pBIrd was constructed with this fragment linked up with GUS gene controlled by
rd29A promoter , which was transferred to potato plants by Agrobacterium tumefaciens system1 Both Northern blotting and
histochemical analysis of GUS activity revealed very similar results that GUS gene expressed weakly with untreated
transgenic potato while the level of GUS mRNA increased steadily after 24 h exposure to 4 ℃, 100μmolΠL ABA ,desiccation
and 250 mmolΠL NaCl1 Moreover , the expression of GUS gene under the control of rd29A promoter was not tissue2specific1
Key words : Arabidopsis thaliana ; rd29A gene promoter ;Transgenic potato ;Low temperature ;ABA ;Desiccation ;NaCl
　　植物在遭受干旱、低温和高盐等逆境条件胁迫
时 ,会有一系列的生理和生长发育代谢过程的改变。
干旱和高盐会导致植物细胞脱水 ,从而引发细胞抗
逆境胁迫的各种生理和生化反应。已报道有很多基
因的表达受缺水和低温条件所诱导[1～3 ] , Yamaguchi2
Shinozaki 等[4 ,5 ] 从拟南芥中克隆的 rd29A 基因对缺
水的反应十分敏感 ,并且该基因具有干旱、高盐、低
温和 ABA 诱导表达相关的顺式作用元件。笔者从
拟南芥中克隆了 rd29A 基因上游 5′2端序列的 824
bp 片段 ,并在转基因马铃薯植株中鉴定了该启动子
在缺水、高盐、ABA 和低温逆境胁迫时 ,诱导下游基
因超量表达的功能 ,旨在为作物抗逆基因工程的研
究提供理论与应用的依据。
1 　材料与方法
111 　酶和试剂
　　T4 DNA 连接酶、各种限制性内切酶和 PyrobestTM
DNA 聚合酶购自 TaKaRa 公司 ;DNA 凝胶回收试剂
盒购自上海生物工程公司 ;DIG Northern 杂交及检测
试剂盒购自 Roche 公司。其他生化试剂为 Sigma 公
繱基金项目 : 国家高技术研究发展计划 (863 计划)项目 (2001AA241132)资助。
作者简介 : 张宁 ,女 ,博士 ,副教授。E2mail :zhangningsi @yahoo1com1cn 3 通讯作者 :王蒂 ,教授 ,博导。Tel :093127631140 , E2mail :wangd @
public1lz1gs1cn
Received(收稿日期) :2003212219 ,Accepted(接受日期) : 20042042041

司产品或国产分析纯。
112 　拟南芥 DNA提取及 PCR扩增
拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) (Columbia 生态型)
种子萌发及生长条件见文献 [ 4 ]。用 CTAB 法[6 ] 提
取其幼叶总 DNA。根据 Yamaguchi2Shinozaki 等[5 ] 发
表的 rd29A 基因的 5′2端序列 ,设计了一对特异引物
( P3 : 5′2CGACTCAAAACAAACTTACG23′和 P4 : 5′2
AATCAAACCCTTTATTCCTG23′) ,由上海生物工程公
司合成。PCR 扩增反应体积为 25 μL ,包括 1 μL
DNA 模板 ,215μL 10 ×buffer ,215μL dNTPs (2 mmolΠ
L) ,1μL 引物 P3 (10 mmolΠL) ,1μL 引物 P4 (10 mmolΠ
L) ,013μL Pyrobest TM DNA 聚合酶 ,1617μL ddH2O。
反应条件为 94 ℃预变性 3 min ;94 ℃,45 s ,55 ℃,40 s ;
72 ℃,1 min ;35 个循环后于 72 ℃保温延伸 5 min。
113 　载体构建及重组子鉴定
该扩增产物为平端片段 ,经 1 %琼脂糖凝胶电
泳分离后用 DNA 凝胶回收试剂盒回收纯化。平端
连接到 Sma Ⅰ切开的 pBluescript SK( + ) 克隆载体 ,
得到 pSKrd 重组质粒 ,送交上海博亚公司完成 DNA
测序。由上海生物工程公司合成 pBluescript SK( + )
载体上的 T7、T3 启动子序列 ,将它们分别与引物 P3
和 P4组合扩增重组载体 ,鉴定 rd29A 启动子插入方向。
用 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ双酶切 pSKrd 质粒 ,将切
下的 rd29A 启动子插入用 Hind Ⅲ和 BamH Ⅰ切去
CaMV 35S启动子的 pBI121 表达载体中 ,得到 rd29A
启动子驱动基因的植物表达载体 pBIrd。用 Hind Ⅲ
和 Bam H Ⅰ双酶切鉴定该重组体后 ,采用冻融法导
入农杆菌 LBA4404。
114 　马铃薯的遗传转化
采用农杆菌介导的马铃薯试管薯薄片转化方
法[7 ] ,对马铃薯四倍体栽培品种大西洋进行遗传转
化。转化马铃薯的再生筛选培养基为 MS 附加 110
mgΠL IAA、012 mgΠL GA3 、015 mgΠL BA、210 mgΠL ZT、
75 mgΠL 卡那霉素和 400 mgΠL 羧苄青霉素。诱导生
根培养基为 MS 附加 50 mgΠL 卡那霉素和 200 mgΠL
羧苄青霉素。
115 　转基因马铃薯植株 PCR检测
按 Edwards 等[8 ] 的方法从马铃薯叶片中提取总
DNA。用转化植株的总 DNA 为模板 ,未转化植株作
为阴性对照 ,以 rd29A 启动子的特异性引物 P3 和
P4 进行 PCR 扩增 , PCR 扩增条件为 94 ℃, 3 min ;
94 ℃,45 s ;50 ℃,45 s ;72 ℃,1 min ;35 个循环 ;72 ℃延
伸 5 min。预期扩增片段大小为 824 bp。
116 　GUS 基因表达的 Northern 杂交分析
对同一转基因株系进行组培扩繁 ,生根后给予
4 组胁迫处理 ,并设 1 组不作处理的转基因植株对
照。(1)试管苗从 24 ℃移至 4 ℃低温条件 ; (2) 试管
苗从培养基移至 100μmolΠL ABA 水溶液中 ; (3)试管
苗从培养基移至 250 mmolΠL NaCl 水溶液中 ; (4) 将
试管苗从培养基中取出 ,置空培养皿中进行缺水处
理。胁迫时间均为 24 h。用异硫氰酸胍法[9 ] 分别抽
提上述胁迫处理的转基因马铃薯以及阴性对照植株
的总 RNA ,进行 Northern 杂交分析。采用 Roche 公
司生产的 DIG RNA Labeling Kit (SP6ΠT7) 试剂盒标记
GUS 基因的 RNA 探针 ,杂交、洗膜及检测方法按
Roche 公司的试剂盒说明书进行。
117 　GUS 活性的组织染色
将待 测 材 料 的 叶 片 和 茎 段 放 入 115 mL
Eppendorf 管 ,加入 GUS 染色液 ( X2Gluc 45 mg ,氯霉
素 5 mg , 011 molΠL NaH2 PO4 25 mL , Triton2100 015
mL ,10 %甲醇 10 mL ;加水至 50 mL) ,于 37 ℃保温 12
h。茎段可直接进行观察 ,叶片染色后需用 70 %乙
醇脱色至阴性对照为白色。
2 　结果与分析
211 　rd29A 启动子 5′2端序列的扩增与克隆
　　以拟南芥总 DNA 为模板 ,本实验设计的特异引
图 1 rd29A 基因 52′端片段的 PCR扩增结果
Fig. 1 The PCR fragments of 5′2flanking region of rd29A gene
M:ΦX174 Hae Ⅲdigested DNA marker ;
1 :PCR 扩增产物。1 :Amplified product by PCR.
物期望扩增到大约 824 bp 大小的片段 ,电泳结果表
明 , Pyrobest TM DNA 聚合酶扩增的产物与预期片段大
小一致 (图 1 ) 。利用 Sma Ⅰ单酶切位点得到
pBluescript SK( + ) 克隆载体的平末端 ,将扩增产物
连接入该位点。利用 pBluescript SK( + ) 载体上的
T7、T3启动子序列 ,分别与特异引物P3、P4组合 ,确
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图 3 PCR扩增鉴定 pSKrd 载体上克隆片段插入方向
Fig. 3 Identification of inserting direction of the clone
in pSKrd vector by PCR amplification
M:ΦX174 Hae Ⅲdigested DNA marker (TaKaRa) ;
1 :引物 T7 和 P3 扩增结果 ;2 :引物 T7 和 P4 扩增结果 ;
3 :引物 T3 和 P3 扩增结果 ;4 :引物 T3 和 P4 扩增结果。
1 :Result of amplification by T7 and P3 primes ;
2 :Result of amplification by T7 and P4 primes ;
3 :Result of amplification by T3 and P3 primes ;
4 :Result of amplification by T3 and P4 primes.
图 2 pSKrd 载体上引物组合扩增正向插入片段示意图
Fig. 2 Diagram of amplification of the direct insertion fragment
in pSKrd vector by different combined primes
图 4 pSKrd 克隆中 rd29A 基因 5′2端序列与已公布序列( D13044)的比较
Fig14 The nucleotide sequence of rd29A 5′2flanking sequence in pSKrd and comparison with the published sequence ( D13044)
- symbol for identical nucleotides ; N symbol for different nucleotides ; The putative TATA2box , CCAAT2box , ABRE ,
DRE and the initiation codens are underlined ; Transcriptional initiation site was marked by asterisk1
定扩增片段插入的方向 (图 2) 。扩增结果表明 , T7
+ P4、T3 + P3 引物组合扩出了 824 bp 片段 ,而 T7 +
P3、T3 + P4引物组合扩增不到目的片段 (图 3) ,说明该
目的片段为正向插入到了 pBluescript SK( + )载体中。
212 　PCR扩增片段的序列分析
克隆片段的 DNA 序列分析结果显示 ,该扩增产
物为拟南芥 rd29A 基因 5′2端序列 (图 4) 。该序列与
已发表的 rd29A 基因 5′2端序列 ( GenBank accession
D13044) [10 ] 有 99139 %核苷酸序列同源性。从该序
列特征推测 TATA2box 的可能位置在 - 34 bp ,CAAT2
box和 GC 丰富区在相互较近的区段内 (图 4) 。在
- 167 bp 和 - 224 bp 区域有 20 bp 的正向重复序列 ,
其中的保守区 TACCGACAAT 被公认为是基因受水
分诱 导 表 达 所 必 需 的 DRE 元 件 ( dehydration
responsive element ) [11 ] 。此 外 , 根 据 ABA 所 作 用
ABRE 元件 ( ABA responsive element ) 的保守序列
ACGT[11 ] ,推测该片段共含有 4 个ABRE ,位置分别为
- 63、- 92、- 315 和 - 412 bp。由此表明 ,所克隆的
rd29A 基因上游 5′2端片段为完整包含各种作用元
件的 rd29A 启动子。
161　第 2 期 张 　宁等 :拟南芥 rd29A 基因启动子克隆及其在马铃薯抗胁迫转基因中的应用 　　　

213 　植物表达载体构建
利用双酶切将 pSKrd 中的 rd29A 启动子替换
pBI121 中的 CaMV35S组成型启动子 ,构建 rd29A 启
动子驱动的 GUS 报告基因表达载体 pBIrd (图 5) 。
其中 , GUS 基因的起始密码子为位于 rd29A 启动子
转录起始位点下游的第一个起始密码子。
图 5 植物表达载体 pBIrd 结构示意图
Fig. 5 Diagram of plant expression vector pBIrd
214 　转基因马铃薯的 PCR检测
如前文献所述 ,利用农杆菌介导的基因转化方
法 ,可以快速、高效得到转化再生植株。转基因马铃
薯植株 PCR 鉴定结果显示 ,所选 5 个转化株系为能
扩增出 824 bp 的阳性植株 (图 6) 。
图 6 转基因马铃薯的 PCR分析
Fig. 6 PCR analysis of transgenic potato
M: DNA 分子量标记 ;1 :pBIrd 质粒阳性对照 ;
2 :未转基因植株阴性对照 ;3～7 :转基因植株。
M:ΦX174 Hae Ⅲdigested DNA marker (TaKaRa) ;
1 :Positive control of plasmid pBIrd ;
2 :Negative control of non2transformed plant ;
3 - 7 :Putative transgenic plants.
215 　不同诱导条件下 GUS 基因表达的 Northern 杂
交分析
　　对转 rd29A 启动子驱动的 GUS 基因马铃薯进行
Northern 杂交分析的结果表明 ,在未转基因的马铃薯
体内 ,检测不到 GUS mRNA的转录。在没有经过胁
迫处理的转基因马铃薯中 , GUS mRNA 被转录 ,但含
量微弱。在 4 种逆境分别胁迫下 ,高盐和缺水条件
诱导的 GUS mRNA 表达很强 ;ABA 和低温条件诱导
的 GUS mRNA 表达较强 (图 7) 。表明 rd29A 启动子
是典型的受缺水、高盐、ABA 和低温等条件引发的
诱导表达型启动子。
图 7 转基因马铃薯 GUS 基因表达的 Northern 杂交分析
Fig. 7 Northern blotting analysis of GUS gene expression
in transgenic potato
1 :未转基因植株阴性对照 ;2 :未胁迫的转基因植株 ;
3～6 :分别用 100μmolΠL ABA ,4 ℃,缺水和
250 mmolΠL NaCl 处理 24 h 的转基因植株。
1 :Negative control , non2transformed plant ;
2 :Untreated transgenic plant ;
3 - 6 :Transgenic plant under 100μmolΠL ABA ,4 ℃, desiccation ,
and 250 mmolΠL NaCl for 24 h ,respectively.
216 　不同诱导条件下 GUS 活性的组织染色分析
GUS 活性的组织染色显示 (图 8) ,对于未转基
因马铃薯 ,无论是茎段还是叶片 ,组织均不能呈现蓝
色 ;而转基因马铃薯经组织染色后 ,在无任何诱导条
件下茎段和叶片染色较浅 ;ABA、缺水和 NaCl 处理
的组织蓝色较深 ,但 4 ℃低温诱导比 ABA、盐和水分
胁迫下的组织染色较浅。在胁迫处理条件下 ,茎段
和叶片两种组织的颜色反应具有一致性 ,并且在盐
胁迫的转基因植株的根中也表现出 GUS 活性 ,说明
rd29A 启动子驱动的 GUS 基因表达无组织特异性。
3 　讨论
利用 pBluescript SK( + )克隆载体上 T7、T3 启动
子核酸序列 ,可以很方便地对各种插入该载体的克
隆片段进行序列分析和方向鉴定。本实验将 T7、T3
引物与特异片段的左右引物 P3、P4 分别组合 ,组合
中 2 条引物在同方向者扩增不到所需片段 ,例如 T7
和 P3 组合、P4 和 T3 组合 ;而 2 条引物若分布在插
入片段的两侧且方向相反时 ,例如 T7 和 P4 组合、P3
和 T3 组合 ,即可特异性地扩增出目的大小的片段 ,
并由此推断所选克隆的正确性和插入方向。应用这
一扩增技术可以快速鉴定出目的片段在载体中的插
入方向。
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图 8 转基因马铃薯中 GUS 组织化学染色结果
Fig. 8 Results of histochemical localization of GUS activity in transgenic potato
A :叶片的 GUS活性 X2Gluc 染色。1 :未转基因植株 (阴性对照) ;2 :未处理的转基因植株 ;
3～6 :分别用 4 ℃、100μmolΠL ABA、缺水和 250 mmolΠL NaCl 处理 24 h 的转基因植株。B :茎段的 GUS活性 X2Gluc 染色。
1～6 :同 A 图所示。C:根的 GUS活性 X2Gluc 染色。1 :未转基因植株 ;2 :250 mmolΠL NaCl 处理 24 h 的转基因植株。
A :X2Gluc staining of GUS activity in leaves. 1 : Non2transformed plant (negative control) ;2 : Untreated transgenic plant ;
3 - 6 :Transgenic plant treated with 4 ℃, 100μmolΠL ABA ,desiccation , and 250 mmolΠL NaCl for 24 h ,respectively.
B :X2Gluc staining of GUS activity in stem segments. 1 - 6 :Same as shown in Fig. A. C : X2Gluc staining of GUS activity in roots.
1 : Non2transformed plant ;2 : Transgenic plant treated with 250 mmolΠL NaCl for 24 h.
　　受高盐、干旱和低温诱导表达的基因及其诱导
表达机理的研究已十分广泛。研究发现 ,许多上述
逆境诱导的基因所具有的启动子调控元件包括
ABRE ( PyACGTGGC ) 、G2BOX ( CACGTG ) 、DRE
( TACCGACAT ) 、MYBRS ( PyAACPyPu ) 、MYCRS
(CANNTG)等 ,并且还有很多结合调控元件的调控
蛋白诸如 bZIP , MYB、MYC、VP1、MAPK 和 RSK
等[11 ,12 ] 。所以 ,缺水、高盐和低温诱导作用引起的基
因表达机理是十分复杂的 ,其中也包含了复杂的信
号感受和传导途径 ,ABA 在这一传导过程中起了重
要的作用。笔者克隆的 rd29A 基因上游序列中也包
括了若干对 ABA 和缺水应答的 ABRE、DRE 等顺式
作用元件。对启动子序列各种作用元件的分析可
知 ,该启动子有效的诱导作用位点大多集中在 - 400
bp 范围内。
rd29A 启动子虽然同时受高盐、干旱、ABA 和低
温的诱导 ,但在诱导 24 h 条件下 ,4 种胁迫诱导 GUS
基因表达的量仍有所差异 ,250 mmolΠL NaCl 和缺水
能够强烈诱导其表达 ,4 ℃低温的诱导能力与前两者
相比较弱。Northern 杂交和 GUS 活性组织染色在转
录和酶蛋白水平上都显示了相似的研究结果。并
且 ,尽管 rd29A 启动子为诱导型启动子 ,但在不被诱
导的转基因马铃薯体内 , GUS 染色时叶片和茎段着
色较浅 ,Northern 杂交结果同时表明 , GUS 基因也有
微弱的表达量。实验所选取的叶片和茎段两种组
织 ,在 GUS诱导表达水平上 ,具有相同的实验结果 ,
并且在盐胁迫的转基因植株的根中也表现出 GUS
活性 ,说明 rd29A 启动子驱动的 GUS 基因表达无组
织特异性。
Yamaguchi2hinozaki 等[5 ,13 ] 将 rd29A 基因的 + 81
bp 到 - 880 bp 片段界定为 rd29A 启动子 ,并与 GUS
构建了融合基因 ,通过转基因烟草与转基因拟南芥
研究了 rd29A 启动子控制下游基因表达的情况 ,结
果表明该启动子受高盐、干旱、ABA 和低温等条件
诱导表达。在本实验中 ,以马铃薯为实验材料研究
了 rd29A 启动子 + 48 bp 到 - 776 bp 的序列调控
GUS 基因在转基因马铃薯中的诱导表达情况。结
果表明 ,在转基因马铃薯中 , rd29A 启动子驱动的
GUS 基因同样能够被高盐、缺水、ABA 和低温等条件
诱导表达。说明在马铃薯中可能存在 rd29A 启动子
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诱导表达所需的相应的反式作用因子 ,该启动子可
进一步用于马铃薯抗逆基因工程的研究。
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