全 文 ：第27卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 27, N o. 3
2001 年5月 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA M ay, 2001
水稻Xa-5基因在水稻和玉米中的比较物理定位Ξ
覃　瑞　魏文辉　金危危　宋运淳ΞΞ
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 湖北武汉 430072)
提　要　比较基因组分析证明, 玉米和水稻基因组间存在广泛的同线性和共线性。对水稻和玉米基因
的原位杂交定位可以揭示禾本科植物基因组结构的共同特点和进化规律。用与 X a25连锁的R G556及
R G556筛选出的BA C 克隆44B 4作探针对水稻广陆矮四号和玉米自交系黄早四进行了原位杂交, 在水
稻第5号染色体短臂和玉米第8号染色体长臂检出了杂交信号, 信号与着丝粒百分距离分别为48. 85、
47. 35、63. 05。BA C2F ISH 信号检出率 (41% ) 大大高于R FL P 探针 R G556 (8% ) 的检出率。BA C2F ISH
需要Cot21 DNA 的封阻。取材于稻兜的根尖经低温处理后能促进姊妹染色单体的分开, 有助于水稻染
色体双点的检测。
关键词　BA C F ISH; 原位杂交X a25; 比较物理定位
Compara tive Physica l L oca tion of R ice X a-5 Gene in R ice and M a ize
Q IN R ui　W E IW en2H ui　J IN W ei2W ei　SON G Yun2Chun
(Center of D epartm ental B iology , W uhan U niversity , W uhan 430072, China)
Abstract　　Comparative genom e analyses have demonstrated that there w ere w ideso read syn te2
n ies and co linearities of the genes among rice and m aize. A nalysis of rice and m aize genom e by
ISH w ill reveal the basic evo lutionary un its of cereal genom es. In our study, w e used R G556 and
a BA C clone 44B4 w h ich linked to the gene X a25 as p robe in ISH. T he tested p lan t w ere O. sati2
va subsp. ind ica cv.“Guang L u A i 4”and the inbred line of Z ea m ay s cv. In rice the X a25 w as lo2
cated in the sho rt arm of the ch romosom e 5, the percen t distance from the cen trom ere to the sig2
nalw as about 48. 85. In m aize, one hybridized sitesw as detected on the long arm of the ch romo2
som e 8. It suggested that the homologous sequences of X a25 ex ist in m aize. By BA C2F ISH tech2
n ique, the detection rate of signal w as over 40% , m uch h igher than that by F ISH w ith R FL P
p robe, on ly 8%. It demonstrated the feasibility and advan tage of BA C2F ISH techn ique in gene
comparative physical location. T he roo t tip com e from rice in field w as dealed w ith 4℃ can im 2
p rove the detection rate of double singal on ch romosom e.
Key words　　BA C2F ISH; in situ hybridition; X a25; Comparative physicalm ap
水稻和玉米是禾本科中研究得最为广泛的两种作物。由于水稻基因组小 (0. 45 pg) , 已成
为禾本科植物基因组研究的模式植物; 根据 S. A hn (1993)等人对水稻和玉米R FL P 分子标记
连锁图的比较研究表明, 水稻约72% 单拷贝序列在玉米中是多拷贝序列[ 1 ] , 从而推断玉米是ΞΞΞ 通讯联系人
收稿日期: 1999212212, 接受日期: 2000205204
Received on: 1999212212, A ccep ted on: 2000205204国家自然科学基金和国家教委博士点基金资助项目 (批准号: 39870423)

古老的多倍体。近年来, 植物比较基因组研究已成为当前的热点之一, 对玉米和水稻基因组
的比较研究将揭示禾本科植物基因的结构的共同特点和进化规律方面的信息, 为将整个禾本
科作为一个统一遗传系统进行研究提供理论依据。在本研究中, 我们选用与白叶枯病显性抗
性基因 X a25紧密连锁的R FL P 标记R G556及其筛选出的BA C 克隆[ 2 ]作为探针用于原位杂交
定位, 确定X a25在水稻和玉米染色体上的具体区域并比较了它们的物理位置。
1　材料和方法
1. 1　植物材料和染色体制片
供试材料为水稻广陆矮四号 (O ry za sativa L. subsp. ind ica) 和玉米自交系黄早四 (Z ea
m ay s L. )。水稻和玉米染色体制片分别参阅 Yan 等[ 3 ]和R en 等[ 4 ]的方法。
1. 2　水稻 BAC 克隆及探针标记
供试BA C 克隆为44B 4 (137kb) , 由 R G556筛选得到[ 2 ] , R G556 (1. 5kb) 由美国康奈尔大
学Bald 博士提供。
碱裂解法[ 5 ]抽提BA C 克隆质粒和 R G556质粒。提纯质粒DNA 用切刻平移法标记。50ΛL 反应液中有 dA T P、dCT P、dGT P、bio tin2112dU T P、D naseÉ、DNA 聚合酶É、0. 5Λg 质
粒探针DNA , 15℃下标记2. 5h 后加5ΛL 0. 2 molöL ED TA (pH 8. 0) 终止反应, Sepharose CL 2
6B (Sigm a) 纯化, 用加链亲和辣根过氧化物酶 (BRL , L ife T echno logies) 的点印记法检测标记
效果。
1. 3　原位杂交及检测
标记的探针的染色体杂交分别参阅 Song [ 6 ] J iang [ 7 ]等程序并稍加修改。每张染色体制片
所用杂交液含50ng 标记的探针DNA , 50% 去离子甲酰胺, 8% 硫酸葡聚糖, 2×SSC, 0. 5 Λg
鲑鱼精子DNA , 1 Λg 水稻Cot21DNA (100 bp21kb) , 37℃杂交过夜。
杂交信号的荧光检测: 42℃ 2×SSC 漂洗5 m in, 依次加入10 ΛgömL F ITC2A vidin
(Sigm a) , 5 ΛgömL A nti2avidin (Sigm a) , 10ΛgömL F ITC2A vidin, 50 ΛgömL P I复染, O lympus
BH 22型显微镜观察, Kodak T echn ical Pan2415彩色胶卷照相。
2　实验结果
为了确证BA C 克隆44B 4在水稻染色体上的物理位置, 我们在用44B 4作为探针进行染色
体原位杂交的同时, 使用用于筛选44B 4的R FL P 分子标记R G556作为探针用于染色体杂交。
实验结果见表1。
表1　探针44B4和 RG556杂交的水稻和玉米染色体的平均臂比和信号位置
Table 1　Average arm ratios and signal location of the r ice and ma ize chromosomes hybr idizaed by probe 44B4 and RG556
材料
M aterial
探针
P robe
染色体数
No. of
chrom som es
鉴别细胞数
No. of
detected cells
长短臂比
Ratio of long
to short arm
杂交信号与着丝粒的百分距离
Percent distance from
the signal to the
centrom ere
R ice 44B4 5 145 1. 73±0. 073 48. 85±3. 40
RG556 5 98 1. 80±0. 04 47. 35±1. 98
M aize 44B4 8 79 2. 87±0. 12 63. 05±5. 43
　　3 标准差 (Standard deviation)
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从水稻遗传图已知 X a25位于第五连锁图[ 2 ] , 根据表1的实验结果, BA C 克隆44B 4 (见图
A , B )和R G556 (见图 E)均在第5号水稻染色体的短臂上检测到杂交信号, 信号与着丝粒的百
分距离分别为48. 85±3. 40和47. 35±1. 98, 结果基本上一致。它们在晚前期和前中期分裂相
细胞中的杂交信号检出率分别为41. 25% 和8% , 前者比后者要高的多, 而且检测到了双点
(见图A ) , 44B 4的间期核信号检出率达80% 以上 (图C) , 也高于 R G556的13% (图 F)。44B4
对玉米染色体的 F ISH , 一共观察了79个分裂相, 在第8号染色体长臂上检出杂交信号 (见图 G
和 F, 杂交信号与着丝粒的百分距离为63. 05±5. 43, 检出率为44. 5%。水稻和玉米染色体识
别采用国内外同类研究所采用的方法[ 4, 6 ]。
在杂交液中, Co t21 DNA 与探针44B4为2. 5 Λg÷50 ng (即50÷1) 时, 在多条水稻染色体上
观察到杂交信号。我们认为, 这是由于BA C 克隆44B 4片段较长 (137 kb) , 含有丰富的重复序
列, Co t21 DNA 的浓度不足以充分封阻探针中的重复序列, 从而造成探针中的DNA 与染色
体发生非特异性杂交, 产生假阳性信号。在Cot21 DNA 与44B 4为5 Λg÷50 ng (即100÷1)时, 由
于封阻充分, 只在第五号染色体上观察到信号点。
3　讨论
根据Ronald [ 8 ]和 Song [ 9 ]等的研究, 我们知道各种单子叶植物的抗病基因具有相近的结构
域。在玉米第8号染色体上检测到 X a25的位点与水稻和玉米比较连锁图分析的结果是一致
的[ 1 ] , 这也说明在水稻和玉米存在同源序列。虽然玉米没有白叶枯病, 根据结构和功能的一
致性, 同源序列的存在可能也有同样的功能或其它的重要生理功能。这种情况的出现, 很有
可能是由于在水稻和玉米的祖先本来就存在某些同源序列, 在漫长的进化过程中, 虽然发生
分歧但仍然保留下来。
在水稻中, 姊妹染色单体信号不容易观察到, 这可能与分裂相多为早中期或晚前期, 姊
妹染色单体尚未分开有关。在我们的实验中, 采用从稻兜取根尖用于染色体制片, 因为稻兜
根尖比种子发芽的根尖要嫩、饱满、细胞分裂旺盛, 容易掌握酶解和根据根尖大小取材的时
间。所取根尖冰水处理5～ 12小时后用于染色体制片可以得到较多含有姊妹染色单体分开的
分裂细胞, 从而增加姊妹染色单体上同源序列与探针的结合的机率, 这可能是由于低温处理
可以促进姊妹染色单体分开的缘故。
在植物基因组研究中, 原位杂交技术原主要用于对DNA 重复序列和多拷贝基因家族作
图[ 10 ]。植物单或低拷贝基因常为一至数 kb 小片断DNA , 其探针与靶DNA 序列相遇的机会
较小, 杂交信号检出率低。BA C (bacterial artificial ch romosom e) [ 11 ]克隆的外源片段一般为100
kb 左右。因此采用BA C 克隆作为探针进行染色体原位杂交较单或低拷贝小片段DNA 序列
更为容易, 而且准确可靠, 从根本上克服了过去单拷贝DNA 杂交的困难, BA C 克隆与荧光
原位杂交技术结合, 无疑将大大促进植物基因组的研究。目前, 用BA C 克隆已将抗白叶枯病
基因X a221[ 6 ] , 棉花 rRN A 基因[ 12 ] , 抗稻瘟病 P i25 ( t) , 抗绿叶蝉基因 G lh 和抗水稻黄萎病
R T SV [ 3 ]成功地定位到染色体上, 我们的实验结果也证明了BA C2F ISH 这种新技术的应用前
景。随着该技术不断发展及完善, BA C2F ISH 将成为植物基因组研究中一种重要技术。
BA C2F ISH 的高效精确的定位效果, 亦必将大大促进植物的比较染色体图的发展与完
善。目前世界上已经构建了水稻[ 13～ 16 ]、高粱[ 17 ]、拟南芥菜[ 18 ]的BA C 文库。M oore 等人通过
1995年和1997年的工作[ 19, 20 ] , 比较了水稻与小麦、玉米、谷子、甘蔗和高粱等植物间的基因
9633期　　　　　　　覃　瑞等: 水稻X a25基因在水稻和玉米中的比较物理定位　　　　　　　　　　　

组同源性, 已初步建立了禾本科祖先基因组的基本骨架。由于BA C 克隆本身携带外源DNA
片段的高容量特性, 无疑将进一步完善植物基因组比较染色体图, 揭示植物在进化上的来龙
去脉, 促进重要的农作物的遗传育种研究。
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