全 文 ：　　
第28卷 第3期 作　物　学　报 V ol. 28, N o. 3
2002 年5月　 359～ 362页 A CTA A GRONOM ICA S IN ICA pp. 359～ 362　M ay, 2002
谷子抗除草剂“拿捕净”基因的AFLP 标记Ξ
牛玉红1, 2　黎　裕1, 3 　石云素1　宋燕春1　马峙英2　王天宇1, 3 　H D arm ency3
(1中国农业科学院作物品种资源研究所, 北京 100081; 2 河北农业大学, 河北保定 071001; 3 法国国家农业科学院第戎中心)
摘　要　对由一对显性核基因 (S rf ) 控制的谷子抗除草剂拿捕净 (Sethoxydim ) 种质抗性进行了分子标记的研究。通过
采用 F 2代群分法, 在谷子 F 2代抗感池间随机筛选了330对A FL P 引物, 找到了与谷子抗除草剂基因连锁的两个A FL P
标记A P1284 (M 55ö15) 和A P2350 (M 55ö14)。它们位于抗除草剂基因的一侧, 与该基因的遗传图距分别为6. 3 cM 和2. 9
cM。二者间的遗传距离为3. 4 cM。该标记可以用于分子标记辅助选择, 对抗除草剂育种及抗除草剂种质环境释放后准
确快速检测抗除草剂基因的田间漂移具有重要的现实意义。
关键词　谷子; 除草剂; 分子标记
中图分类号: S515　　　文献标识码: A
AFL P M apping for the Gene Conferr ing Sethoxydim Resistance in Foxta il M illet
(Seta r ia ita lica (L. ) Beauv. )
N IU Yu2Hong1, 2　L I Yu1　SH I Yun2Su1　SON G Yan2Chun1　M A Zh i2Ying2　WAN G T ian2Yu1
H D arm ency3
(1 Institu te of C rop Germ p lasm R esources, Chinese A cad em y of A g ricultural S ciences, B eij ing 100081; 2 H ebei A g ricultural U niversity , B aod ing
071001, H ebei Ch ina; 3L abo d e M alherbolog ie et A g ronom ie, IN RA , D ijon, F rance)
Abstract　H eibicide resistance to sethoxydim in fox tail m illet (S etaria italica (L. ) Beauv. )w as con tro lled by a
nuclear, dom inan t gene (S rf ). Bulked segregan t analysis from F 2 w as used to iden tify A FL P m arkers linked to
the S rf gene of fox tail m illet. DNA bands amp lified from 330 random A FL P p rim ers w ere screened. T he
po lymorph ic bands A P1284 and A P2350 w ere found linked to the S rf locus on the sam e side w ith the genetic
distance of 6. 3 cM and 2. 9 cM , respectively, w ith 3. 4 cM betw een the two m arkers. T he A FL P m arkers
would facilitate selection on the herbicide resistan t lines in fox tailm illet.
Key words　Fox tailm illet; H erbicide; M olecular m arker
　　谷子种子粒小苗弱, 谷田除草难度大。为了解
决这一难题, 国内外一些学者曾先后开展了广泛的
谷子品种或除草剂的筛选工作。近年来, 王天宇等
人将选择出的野生资源青狗尾草 (S etaria v irid is) 中
的抗除草剂“拿捕净”(Sethoxydim ) 基因导入到栽培
谷子, 研究了这些新种质抗性性状的遗传规律与抗
性水平, 继后通过杂交、回交育种获得了抗性基因
表达完全、遗传稳定、达到实用水平的抗除草剂
“拿捕净”的谷子新种质[ 1 ]。在此基础上, 育成了达
到实用水平的系列抗除草剂新品系, 提出了利用不
同抗除草剂材料的抗性基因在提高杂种优势利用水
平、以及在提高各类基础研究用目的群体构建的效
率与准确性等方面综合利用的系列方案[ 2 ]。
深入地解析所创制出的抗除草剂谷子在分子水
平上的遗传机制, 不仅对指导抗除草剂谷子育种实
践、检测抗除草剂谷子新品种应用时抗性基因的动
态具有重要的现实意义, 而且也是抗除草剂基因的
克隆、并将其应用于更广泛的作物研究工作的基Ξ 基金项目: 本项目得到欧盟项目 (ERB IC18CT98 0391)和国际原子能机构项目 (10757)资助, 在农业部作物种质资源和生物技术重点实
验室完成。
第一署名作者: 牛玉红 (19742) , 女, 河北农业大学修完基础课程派往中国农业科学院作物品种资源研究所完成学位论文, 合作培养硕
士生, 研究方向: 作物遗传育种。
　3 通讯联系作者。
Received on (收稿日期) : 2001203202, A ccep ted on (接受日期) : 2001204220
础。本实验利用扩增片段长度多态性 (Amp lified
F ragm en t L ength Po lymorph ism , 即 A FL P ) 技术,
结合群分法寻找与谷子抗除草剂拿捕净基因紧密连
锁的分子标记。
1　材料和方法
1. 1　材料来源
抗感除草剂近等基因系是由抗除草剂谷子新种
质 SR 3522与谷子雄性不育系 SDA 21杂交, 又用雄
性不育系作轮回亲本回交8次, 后经自交结合使用
除草剂鉴定, 得到的抗、感除草剂近等基因系。
作图群体 F 2是由抗除草剂谷子新品系制1与已
育成的谷子雄性不育系1066A 拓建而成。
1. 2　抗性鉴定
将抗感近等基因系、F 2群体及亲本 SR 3522、
SDA 21、制1和1066A 种植在中国农科院品资所隔
离网室内, 在植株长出5片叶时, 分别剪取4个亲
本, 近等基因系和 F 2群体中单株的新鲜叶片, 按
Sharp (1988)改进的酚2氯仿提取法提取DNA [ 3 ]。待
叶片复壮后喷除草剂“拿捕净”(由日本N isso 株式
会社生产, 有效成分含量为12. 5% ) , 浓度为推荐
浓度。喷除草剂半个月后, 调查亲本及近等基因系
和 F 2各单株情况。本研究中, 死亡的单株为感除草
剂, 而正常的单株为抗除草剂。由于 S rf 基因为显
性核基因, 因此用正常单株的成熟种子进行发芽,
发芽基质中含推荐浓度的“拿捕净”, 用以检测 F 2个
体的基因型杂合性。
1. 3　AFL P 扩增
本次实验采用 Zabeau 和V os(1993) [ 4 ]的A FL P
程序, 但略有修改, 即采用各3个单位的两种酶
(M se É 和 E coR É ) 酶切150 ng 的基因组 DNA ,
37℃条件下酶切1. 5小时。酶切完成后, 酶切液不
变性而直接加入连接酶和 dN T P s, 37℃下连接过
夜。其余步骤同 Zabeau 和V os(1993) [ 4 ]。
扩增产物在5% 的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳;
银染显色观察。
1. 4　统计分析
用M apM anager 软件进行连锁分析[ 5 ]。
2　结果与分析
2. 1　谷子 F2群体的分子检测
随机选取10个A FL P 引物组合对 F 2作图群体
的抗、感亲本进行多态性筛选。发现所有引物组合
均能揭示1066A 及制1间的多态性, 说明两亲本的
遗传背景存在较大的差异。因此, 本实验采用群分
法 (bulked segregan t analysis, BSA ) , 用 F 2抗、感单
图1　用M 55öE15的A FL P 引物组合对谷子 F2分离群体部分个体的扩增结果。R 为抗除草剂单株,
S 为感除草剂单株, M 为M arker, P r 为抗性亲本, P s 为感病亲本, B r 为抗池, B s 为感池。
F ig. 1　The amp lification p rofile of a part of F2 individuals using A FL P p rim er com bination of M 55öE15. R resistant individuals,
S suscep tible individuals, M m arker, P r resistant parent, P s suscep tible parent, B r resistance pool, B s suscep tible pool
063　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　作　　物 　　学　　报　　　　　　　 　　　　　　　　　　　　28卷
2. 9 cM
3. 4 cM
　A P2350
　S rf
　A P1284
图2　两个A FL P 标记与抗性基因 S rf 的连锁图,
遗传距离由M apM anager 软件算出
F ig. 2　L inkage relationsh ip of the two A FL P m arkers
(A P1284 and A P2350) and the sethoxydim
resistance gene, S rf , w ith genetic distance
calculated using the softw are‘M apM anager’
株分别建立抗感池 (poo l)筛选引物[ 6 ]
2. 2　与 S rf 位点相连锁的AFL P 分子标记选择
随机选择330对A FL P 引物组合对 F 2群体的抗
除草剂基因池和感除草剂基因池进行A FL P 分析,
每个引物组合均可扩出稳定、清晰的条带, 平均每
对引物扩出50条带, 扩增片段长度50～ 1000 bp。有
22对引物组合的扩增产物在 F 2抗感基因池间揭示
出多态性, 但只有引物M 55öE15和M 55öE14能够
在亲本及抗感池间扩增出稳定的多态性带。引物组
合M 55öE15在抗除草剂池中扩增出分子量分别为
248 bp 的带 (A P1284 ) , 而在感除草剂池中没有该
带。引物组合M 55öE14在抗除草剂池中扩增出一
条分子量为350 bp 的带 (A P2350) , 而在感除草剂池
中没有该带。随之对该群体的90个个体进行了分析
(图1为部分个体的扩增结果)。分析表明, A P1284和
A P2350与抗除草剂基因 S rf 连锁, 但连锁的程度不
同。A P1284标记与 S rf 连锁关系较远, 遗传距离为
6. 3 cM ; A P2350标记与 S rf 连锁较紧密, 遗传距离
为2. 9 cM ; A P1284和A P2350位于 S rf 的一侧, 遗传
距离为3. 4 cM (图2, 图中无长、短臂的方向指示)。
3　讨论
3. 1　抗除草剂拿捕净基因的研究
不同的除草剂作用于不同的靶标。除草剂拿捕
净属环乙烯二酮类、单一靶标类除草剂。作用靶标
是植株叶绿体中的乙酰辅酶A 羧化酶 (A CCase) ,
通过抑制了丙二酸单酰辅酶A 合成, 阻碍脂肪酸合
成。在玉米中, A CCase 由两个不同的基因编码, 分
别是A cc1和A cc2[ 7 ]。A cc1位于玉米第2号染色体,
是一个半显性核基因, 负责编码玉米叶片、胚乳和
胚中的大部分A CCase。A cc2位于玉米第10号染色
体, 负责编码玉米叶片中约15% 的A CCase。任一
基因的特定位点的突变, 均有可能使植株具有抗
性。如在玉米中发现一个部分显性核基因突变体编
码抗性[ 8 ]。谷子中的拿捕净抗性基因 S rf 来自谷子
近缘种青狗尾草的一突变株, 已证实该除草剂抗性
由一显性单核基因控制[ 9 ]。基因组学研究表明, 相
同功能基因在不同作物间具有一定的保守性。推测
谷子中该基因与玉米中已知突变基因可能有同源
性, 但还有待进一步证实。根据这种同源性, 可以
较方便地克隆谷子中的 S rf 基因。
3. 2　AFL P 标记研究
已有一些利用A FL P 标记对目标基因进行作
图的例子。例如, Co lw yn 等 (1995) 通过对 F 2群体
进行群分法 (BSA ) , 从42, 000个A FL P 标记中找到
了3个与西红柿 Cf 29抗性基因连锁并表现为共分离
的A FL P 标记, 并以这些标记为起点, 通过M BC
方法已将 Cf 29基因克隆[ 10 ]; V an der V orrt (1997)
等采用A FL P 技术定位了土豆孢囊线虫的抗性基
因[ 11 ]; 何光华等 (2000) 对 F 2群体进行分群分析寻
找到了一个与野败型杂交水稻恢复基因相连锁的
A FL P 标记[ 12 ]。
群分法与A FL P 技术相结合大大提高了与目
的基因相连锁的分子标记的筛选效率。本实验采用
群分法与A FL P 技术相结合, 筛选到两个与抗除草
剂基因连锁的标记, 其中标记A P1284与谷子抗除草
剂基因连锁关系较远, 遗传距离为6. 3 cM ; 标记
A P2350与谷子抗除草剂基因连锁较紧密, 遗传距离
为2. 9 cM。与抗除草剂基因紧密连锁的DNA 分子
标记在抗除草剂基因的标记辅助选择中具有广阔的
应用前景。(1)、对A FL P 标记的直接利用。可直接
利用A FL P 标记对后代进行鉴别, 具有抗性特异带
的有抗除草剂基因, 不具有抗性特异带的不具有抗
性基因。但由于A FL P 程序较为复杂, 可进一步把
A FL P 标记转换成 SCA R 标记, 即把所扩增出的
A FL P 特异片段回收、克隆, 测序后, 根据两端序
列设计20～ 23 bp 的核苷酸引物, 筛选 PCR 标记。
若所筛引物在 F 2群体中的分离分析结果与原来各
自的A FL P 标记相同, 则此片段即为 SCA R 标记,
可用于分子标记辅助育种。 (2)、把A FL P 特异片
段用作R FL P 探针, 与谷子基因组杂交, 再应用相
关策略和技术可把该除草剂基因克隆出来, 用于基
因工程。(3)、利用谷子A FL P 图谱, 将此基因定位
1633期　　　　　　　　　　　　　　　牛玉红等: 谷子抗除草剂“拿捕净”基因的A FL P 标记　　　　　　　　　　　　　　
于染色体上, 并根据图谱寻找与抗除草剂基因连锁
更紧密的标记, 最好为共显性标记 (如微卫星标
记)。这样, 既可用于育种选择, 又可转化为更便捷
的 PCR 标记, 从而方便、快速、高效的应用于标记
辅助选择。
3. 3　抗除草剂基因释放后田间漂移的准确快速检
测
目前, 从大田杂草防治研究来看, 通过遗传改
良使作物获得或提高抗除草剂特异性已成为新的研
究热点[ 13 ]。然而, 通过转基因等现代生物技术使作
物获得外源抗性基因, 这种抗性基因从栽培种向相
关野生种的流动 (Gene flow ) 可能性也倍受人们的
关注[ 14 ] , 这不仅影响新种质有效使用同类除草剂的
时间, 而且使种间自然的异交有可能产生“超级杂
草”(Super w eeds) , 增加杂草在农田的生存力和竞
争力, 最终导致野生种群落生态平衡的变化。谷子
是典型的自花授粉作物, 它的几种近缘野生种均为
农田主要杂草, 因此, 在新种质应用后, 有必要对
抗性基因的漂移进行准确快速的检测, 并制定相应
的长期安全应用的措施。我们已成功地创制出谷子
抗除草剂新种质, 并组织了全国抗除草剂育种协作
组。培育出的抗除草剂新品种在生产上安全、有效
地应用是一个重要的课题。目前我们的工作除了研
究使用抗除草剂新种质的具体操作技术, 还研究监
测抗性基因从栽培种向野生种的基因流频率、范
围、积累速率和影响因素, 评估大面积推广应用后
可能产生的生态后效研究, 并以此为模型, 评价今
后转基因谷子应用的生态安全性。我们已完成了谷
子群体间基因流的研究, 取得了谷子与其主要近缘
野生种基因流研究的数据 (另文发表)。本抗除草剂
基因A FL P 分子标记可成为检测抗除草剂种质释
放后抗性基因漂移准确快速检测的一个有效的工
具, 正在成为制定与修订安全、合理、有效利用谷
子抗除草剂品种措施的分子证据基础。安全和有效
地应用抗除草剂谷子品种可使人们盼望的谷子精量
播种不间苗、免中耕除草成为现实。
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