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Asymbiotic Seed Germination and in vitro Seedling Rapid Development of Paphiopedilum spicerianum

白旗兜兰种子非共生萌发与试管苗快速繁育



全 文 :白旗兜兰种子非共生萌发与试管苗快速繁育∗
陈  莹1ꎬ2ꎬ 范旭丽1ꎬ 高江云1∗∗
(1 中国科学院西双版纳热带植物园综合保护中心ꎬ 云南 勐腊  666303ꎻ 2 中国科学院大学ꎬ 北京  100049)
摘要: 对我国极小种群野生植物白旗兜兰的种子非共生萌发与试管苗快速繁育开展研究ꎬ 对比了不同培养
基、 预处理、 种子成熟度及光照对种子萌发的影响ꎮ 白旗兜兰种子萌发的最适条件是授粉后 270 d 的种子ꎬ
在 1 / 4MS+10%椰汁培养基上ꎬ 用 1% NaOCl溶液处理种子 40 min并在播种后的前 4周进行黑暗培养ꎮ 最适
合原球茎转化幼苗的培养基是 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+1􀆰 0 mg􀅰L-1 NAA+0􀆰 5 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆ꎬ 而最佳幼
苗生根壮苗的培养基是 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+1􀆰 0 mg􀅰L-1 NAA+1􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+0􀆰 5 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆ꎮ
关键词: 白旗兜兰ꎻ 种子非共生萌发ꎻ 极小种群物种ꎻ 兰科植物保护ꎻ 试管苗快繁
中图分类号: Q 945              文献标志码: A              文章编号: 2095-0845(2015)05-611-05
Asymbiotic Seed Germination and in vitro Seedling Rapid
Development of Paphiopedilum spicerianum
CHEN Ying1ꎬ2ꎬ FAN Xu ̄li1ꎬ GAO Jiang ̄yun1∗∗
(1 Center for Integrative Conservationꎬ Xishuangbanna Tropical Botanical Gardenꎬ the Chinese Academy of Sciencesꎬ
Menglaꎬ Yunnan 666303ꎬ Chinaꎻ 2 University of Chinese Academy of Sciencesꎬ Beijing 100049ꎬ China)
Abstract: In this paperꎬ we studied the asymbiotic seed germination and seedling development of Paphiopedilum
spicerianumꎬ a wild plant with extremely small populations (PSESP) in China. By analogizing the influences of dif ̄
ferent mediaꎬ seed maturityꎬ pretreatments and lights on the seed germinationꎬ the results showed that the best ger ̄
mination condition is using the seeds at 270 days after pollinationꎬ pretreating with 1% NaOCl for 40 minꎬ on the 1 /
4MS+10% coconut water medium under 24 hours darkness for 4 weeks. For seedling formationꎬ 3􀆰 0 g􀅰L-1 Hyponex
No 1 medium with 1􀆰 0 mg􀅰L-1 α ̄naphthlene acetic acidꎬ 0􀆰 5 g􀅰L-1 activated charcoal and 10% banana homogenate
was the most effective. For seedling developmentꎬ the same medium used for seedling formation with supplemented
1􀆰 0 g􀅰L-1 6 ̄benzyladenine was most suitable.
Key words: Paphiopedilum spicerianumꎻ Asymbiotic seed germinationꎻ Wild Plants with Extremely Small Popula ̄
tionsꎻ Orchid conservationꎻ in vitro seedling rapid production
  我国目前唯一已知的白旗兜兰 (Paphiopedi ̄
lum spicerianum) 种群ꎬ 是 2003 年在云南省普洱
市发现的仅残留 10 余株的成年植株 (叶德平和
罗毅波ꎬ 2006)ꎮ 该种群生长在一个外来移民村
村口小河沟边陡峭的河岸上 (图 1: A)ꎬ 此处土
质松软ꎬ 河岸极易因大雨冲刷或小河涨水而崩
塌ꎬ 小河周围是咖啡种植园ꎬ 河水已被咖啡加工
厂的废料严重污染ꎬ 其生长环境十分恶劣ꎮ 目前
白旗兜兰已被列入由国家林业局和国家发改委联
合印发的 «全国极小种群野生植物拯救保护工程
规划 (2011-2015 年)» 目录中ꎮ 鉴于白旗兜兰
现状ꎬ 就地保护 ( in situ conservation) 已经很难
对现有种群进行有效保护ꎬ 在开展迁地保护 (ex
situ conservation) 的基础上ꎬ 通过人工扩繁种苗ꎬ
植 物 分 类 与 资 源 学 报  2015ꎬ 37 (5): 611~615
Plant Diversity and Resources                                    DOI: 10.7677 / ynzwyj201515012

∗∗
基金项目: 国家自然科学基金 (31470450)
通讯作者: Author for correspondenceꎻ E ̄mail: gjy@xtbg􀆰 org􀆰 cn
收稿日期: 2015-01-22ꎬ 2015-05-12接受发表
作者简介: 陈莹 (1988-) 女ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要研究兰科植物种子的非共生萌发与组培扩繁ꎮ
再进行野外回归 ( reintroduction) 是拯救白旗兜
兰的唯一途径ꎮ
兜兰属是兰科中种子非共生萌发最为困难的
属之一ꎬ 种子无菌萌发技术难度较大 (Arditti 和
Ernstꎬ 1993)ꎮ 但在本研究中我们将对白旗兜兰种
子非共生萌发、 原球茎转化幼苗以及幼苗生根壮苗
方面开展系统的研究ꎬ 以获得白旗兜兰种苗快速扩
繁的完整技术ꎬ 为开展白旗兜兰的回归奠定基础ꎮ
1  材料与方法
1􀆰 1  材料
白旗兜兰 (Paphiopedilum spicerianum (Rchb. f.) Pfitzer)
为地生或半附生兰科植物ꎬ 花期为 10-12 月 (图 1: B)ꎮ
本研究所用的白旗兜兰种子来自迁地保护于中国科学院
西双版纳热带植物园的 5 株白旗兜兰植株ꎬ 于 2012 年
11月 17日进行人工异交授粉ꎬ 分别在授粉后不同时期
采集成熟度不同的蒴果ꎮ
1􀆰 2  方法
采集的蒴果放入无水氯化钙的干燥器内ꎬ 一天后取
出ꎬ 经常规消毒后ꎬ 用无菌滤纸擦拭干净ꎬ 纵向切开蒴
果ꎬ 取出种子待用ꎮ 根据相关文献ꎬ 选取 1 / 4MS (大量元
素化合物的用量降低至 1 / 4ꎬ 其余不变ꎬ 其中蔗糖 30 g􀅰
L-1ꎻ Murashige和 Skoogꎬ 1962)、 1 / 4MS+100 ml􀅰L-1椰子
汁 (MSCW) 、 RE (其中果糖 20 g􀅰L-1ꎻ Ardittiꎬ 1982) 和
RE+100 ml􀅰L-1椰子汁 (RECW) 4种培养基进行种子萌发
的预实验ꎬ 播种 30天后ꎬ 按兰科植物种子萌发和原球茎发
育常用分级方法统计种子萌发率 (Stewart和 Zettlerꎬ 2002)ꎮ
1􀆰 2􀆰 1  培养基、 种子成熟度、 种子预处理和光照对种子
萌发率的影响  培养基为预实验时筛选出的具有较高种
子萌发率的 MSCW 和 RECW 培养基ꎻ 采集授粉后 180、
270和 360 d的蒴果ꎻ 将每次获得的种子平均放入到 4个
针管内ꎬ 吸取 8 mL 1% NaOCl 溶液ꎬ 分别浸泡 5、 40、
60和 80 minꎬ 然后用无菌水清洗 5次ꎬ 再将针管内的种
子分别打入 4瓶无菌悬浮液 (1 g􀅰L-1 (琼脂 /纯水)) 里
混匀ꎬ 用无菌移液枪吸取 1 mL的种子悬浮液放入培养瓶
播种ꎬ 封口后分为 2组ꎬ 一组先在黑暗条件下培养 4周ꎬ
另一组直接在 12 / 12 h (光照 /黑暗) 光周期 (荧光灯 200
μmol m-2 s-1) 下进行生长ꎮ 播种 90 d后统计每瓶培养基内
种子的萌发率 (萌发率 (%)= (每瓶萌发的种子数 /每瓶的
播种量)×100%)ꎮ 根据兰科植物种子萌发常用的标准ꎬ
当种胚膨大ꎬ 产生根状物即视为萌发 (Ardittiꎬ 1967)ꎮ
1􀆰 2􀆰 2  不同培养基对白旗兜兰原球茎转化幼苗的影响
播种 100 d后将绿色健康原球茎移栽到以下 4 种不
同培养基内ꎬ 观察不同添加物对原球茎转化幼苗的影
响ꎮ (1) 1 / 2MS+0􀆰 2 mg􀅰L-1 IBA+2􀆰 0 g􀅰L-1活性炭ꎻ (2)
3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号 (美国花宝公司) +1􀆰 0 mg􀅰L-1 NAA+
0􀆰 5 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆ꎻ (3) MS+1􀆰 0 mg􀅰L-1
NAA+0􀆰 2 mg􀅰L-1 IBA+0􀆰 5 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆ꎻ
(4) 2􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+2􀆰 0 g􀅰L-1蛋白胨+1􀆰 0 mg􀅰L-1
NAA+1􀆰 0 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆ꎮ 每个培养瓶内转
移 10个健康的原球茎ꎬ 每个处理重复 10 次ꎮ 三个月后
统计幼苗的形成情况ꎬ 以长出嫩叶芽为标准ꎮ
1􀆰 2􀆰 3  不同培养基对白旗兜兰幼苗生根壮苗的影响
将得到的幼苗转移到加有 6 种不同添加物的培养基
中ꎬ 观察幼苗长叶和生根的情况 (表 3)ꎮ 每瓶移栽 3
棵ꎬ 每个处理重复 8 次ꎬ 4 个月后测量每瓶内最大植株
的最长叶的叶长生长率 (叶长生长率 (%)= (最终测量
的叶长长度-最初测量的叶长长度 /最初测量的叶长长
度)×100%) (张铭光等ꎬ 1994) 以及生根状况 (以生根
的数量评估: 0条为差ꎻ 1~2条为中ꎻ 3~5条为好)ꎬ 来
评估最适合幼苗生长的培养基ꎮ
1􀆰 3  数据分析
种子的萌发率用广义线性模型 (Sileshiꎬ 2012) 和二
项分布函数对 4个因素的影响进行处理ꎬ 并用 Tukey 检
验来对各个处理内的影响进行多重比较ꎻ 植株生长速率
用一般线性混合模型来处理ꎬ 并用 Tukey 检验中的单一
自由度来比较不同培养基对植株生长的影响ꎬ 所有数据
都在 3􀆰 1􀆰 1版本的 R统计软件中进行分析ꎮ
2  实验结果
2􀆰 1  培养基、 成熟度、 预处理和光照对种子萌
发率的影响
表 1数据表明ꎬ 培养基、 成熟度、 预处理和
光照 4个因素对白旗兜兰种子的萌发都有极显著
的影响ꎬ 其中预处理的作用最大ꎬ 其次是成熟
度ꎬ 培养基和光照ꎮ
黑暗处理能促进授粉后 270 d 和 360 d 时种
子的萌发ꎬ 但是对于前者效果不显著ꎬ 对于后者
则有显著效果ꎻ 而授粉后 180 d时的种子ꎬ 其萌
表 1  培养基、 种子成熟度、 种子预处理和光照对
白旗兜兰种子萌发率的影响
Table 1  The effects of different treatments of mediaꎬ seed
maturityꎬ seed pretreatments and lights on seed
germination of Paphiopedilum spicerianum
因素 Factor 萌发 Germination
光照 (df= 1) Light 239􀆰 6∗∗∗
培养基 (df= 1) Media 4627􀆰 4∗∗∗
成熟度 (df= 2) Maturity 4627􀆰 4∗∗∗
预处理 (df= 3) Pretreatment 5431􀆰 8∗∗∗
∗∗∗P < 0􀆰 0001ꎻ∗∗P < 0􀆰 01ꎻ∗P < 0􀆰 05ꎻ df为自由度
216                                  植 物 分 类 与 资 源 学 报                            第 37卷
发率几乎为零ꎬ 黑暗处理对其萌发没有显著作用
(图 2: A)ꎮ 40 min 的预处理能显著提高种子的
萌发率 (25􀆰 66 ± 2􀆰 28)%ꎬ 60 min (8􀆰 36 ± 1􀆰 27)%
与 5 min (8􀆰 04 ± 1􀆰 18)%预处理之间种子的萌发
率没有显著差异ꎬ 80 min 预处理时萌发率最低
(0􀆰 22 ± 0􀆰 10)% (图 2: B) 与其他三个处理间
有显著差异ꎮ
从种子成熟度来看ꎬ 授粉后 270 d 时采集的
种子萌发率最高 (17􀆰 72 ± 2􀆰 00)%ꎬ 但是与 360 d
(13􀆰 29 ± 1􀆰 25)%之间没有显著性差异ꎬ 而 180 d
时采集的种子萌发率最低 (0􀆰 48 ± 0􀆰 07)% (图
2: C)ꎮ 培养基对授粉后 180 d时采集的种子的萌
图 1  白旗兜兰的生境、 花和种子非共生萌发体系ꎮ A. 白旗兜
兰的生境ꎻ B. 白旗兜兰的花ꎻ C. 不同培养基中形成的原球茎ꎻ
D. 褐化死亡的幼苗ꎻ E. 健康的幼苗ꎻ F. 形成的幼根ꎻ G. 健壮的
根ꎮ a. RECW培养基中形成的白色原球茎ꎻ b. MSCW 培养基中
形成的健康绿色原球茎
Fig􀆰 1  The habitatꎬ flower and seed asymbiotic germination system of
P􀆰 spicerianum. A. The habitat of P􀆰 spicerianumꎻ B. The flower of
P􀆰 spicerianumꎻ C. The protocorms in different mediaꎻ D. The dead
seedlingsꎻ E. The healthy seedlingsꎻ F. The radiclesꎻ G. The big
roots. a. The white protocorm in RECW mediumꎻ b. The healthy pro ̄
tocorm in MSCW medium
发率没有显著影响ꎬ 但对 270 d 和 360 d 的种子
有显著性影响ꎬ RECW培养基里的种子萌发率明
显比MSCW培养基里的高 (图 2: D)ꎻ 但 RECW
培养基上形成的原球茎为白色ꎬ 继续培养会褐化
死亡 (图 1: C: a)ꎬ 而 MSCW 培养基里的原球
茎健康 (图 1: C: b)ꎮ
2􀆰 2  白旗兜兰原球茎转化幼苗及生根壮苗
在 4种原球茎转化幼苗的培养基中ꎬ 只有 2
号培养基中原球茎顺利转化成幼苗ꎬ 且幼苗生长
良好 (图 1: E) ꎬ 其他 3种培养基中的原球茎或
形成的幼苗都在后期褐化死亡 (图 1: D)ꎮ
图 2  光照、 种子预处理、 种子成熟度和培养基对白旗兜兰种
子萌发率的影响ꎮ A: 不同成熟度时光照处理对种子萌发率的影
响ꎻ B: 种子预处理对种子萌发率的影响ꎻ C: 种子成熟度对种子
萌发率的影响ꎻ D: 不同成熟度时培养基对种子萌发率的影响ꎮ
不同小写字母代表差异显著 (P < 0􀆰 05)
Fig􀆰 2  The effects of different treatments of lightsꎬ pretreatmentsꎬ
seed maturity and media on seed germination ratios of P􀆰 spicerianum.
A. The effects of lights on seed germination in different maturityꎻ B.
The effects of pretreatments on seed germinationꎻ C. The effects of
seed maturity on seed germinationꎻ D. The effects of media on seed
germination in different maturity. Different letters on column present
significant difference (P < 0􀆰 05)
3165期                        陈莹等: 白旗兜兰种子非共生萌发与试管苗快速繁育                         
    白旗兜兰幼苗移植 4个月后ꎬ 在 6种培养基
中ꎬ HYPO4、 MS_NAAO 和 HYPO3 培养基中的
幼苗生长显著快于其他 3 种培养基ꎬ 在 HYPO4
培养基上的叶长生长率最快 (283 ± 29)%ꎬ 而在
HYPO2培养基上的叶长生长率最慢 (表 2)ꎮ 另
外ꎬ 花宝培养基中幼苗叶子的颜色都呈绿色ꎬ 而
在 MS培养基中的幼苗叶颜色发黄ꎬ 6 种培养基
中幼苗的根都生长良好ꎬ 每个幼苗均生长出 3 条
以上根 (图 1: Fꎬ Gꎻ 表 2)ꎮ
3  讨论
在预实验中我们发现添加椰汁能够有效促进
种子的萌发ꎬ 这可能与椰汁中富含玉米素等植物
生长调节剂有关 (曾宋君等ꎬ 2007)ꎮ 王莲辉等
(2009) 在研究长瓣兜兰 (P􀆰 dianthum) 时也发
现添加 100 ml􀅰L-1的椰汁能够有效促进种子萌
发ꎬ 与我们的研究结果相似ꎮ 光照能显著影响兜
兰属种子的萌发ꎬ 黑暗处理的时间长短能影响彩
云兜兰 (P􀆰 wardii) 的种子萌发ꎬ 45 d 的黑暗处
理时种子萌发率最高 (Zeng 等ꎬ 2012)ꎬ 在我们
的研究中ꎬ 黑暗处理能显著促进白旗兜兰种子的
萌发ꎬ 这可能与白旗兜兰的地生习性有关ꎬ 种子
播种后ꎬ 必须经历类似土壤中的黑暗环境才能萌
发ꎮ 用 NaOCl 溶液对种子进行预处理可以提高
兰科种子的萌发率ꎬ NaOCl可以破坏种皮ꎬ 增加
种皮的渗透性或消除一些抑制物质 (Rasmussenꎬ
1995ꎻ Lee等ꎬ 2007)ꎮ 在该研究中ꎬ 白旗兜兰的
种子在预处理 40 min 时萌发率最高 (图 2: B)ꎮ
培养基也影响兜兰属种子的萌发 (刘其府等ꎬ
2012ꎻ Nhut等ꎬ 2005)ꎮ Long等 (2010) 在研究 4
种兜兰时发现ꎬ 种子的萌发率在 KC 培养基上最
高ꎻ 陈之林等 (2004) 研究杏黄兜兰 (P􀆰 armeni ̄
acum) 和硬叶兜兰 (P􀆰 micranthum) 时发现在 R
培养基上的萌发率最高ꎬ 但部分萌发的种子出现
褐死现象ꎬ 这与我们的研究结果相似ꎮ 种子的成
熟度也对种子的萌发率有很大影响ꎬ 研究发现未
成熟的种子比成熟的种子更好萌发ꎬ 因为种子在
成熟期间种皮上的覆盖物会越来越多导致种子的
不透水性增加 (Ramsay 和 Stewartꎬ 1998ꎻ Kauth
等ꎬ 2008)ꎬ 或是完全成熟的种子进入休眠或产
生某些抑制种子萌发的物质 (陈之林等ꎬ 2004)ꎮ
在原球茎转化成幼苗阶段ꎬ 我们发现与 MS
培养基相比ꎬ 花宝培养基更适合幼苗形成和生
长ꎮ 曾宋君等 (2006) 在研究带叶兜兰 (P􀆰 hirsu ̄
tissimum) 时用了 3 种培养基进行原球茎分化和
成苗诱导ꎬ 发现 1􀆰 5 g􀅰L-1花宝 1 号+1􀆰 5 g􀅰L-1
花宝 2号+2 g􀅰L-1活性炭+2􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+0􀆰 2
mg􀅰L-1 NAA培养基上的形成的幼苗最为健壮ꎮ
不同的培养基会显著影响幼苗的生长ꎮ 本研
究中ꎬ 与 MS培养基相比ꎬ 花宝 1 号培养基里的
幼苗生长得更好ꎻ Dutra 等 (2009) 研究 Cyrtopo ̄
dium punctatum时发现ꎬ 在初始阶段KC培养基上
的幼苗生长最好ꎬ 而到了后期 P723培养基则最适
合幼苗生长ꎮ 另外ꎬ 幼苗的生长也受到添加物的
影响ꎬ 在该研究中ꎬ 香蕉匀浆对幼苗的生长有促
进作用ꎬ 这在其他研究中也有发现 (曾宋君等ꎬ
2006ꎻ 周丽等ꎬ 2012)ꎮ 植物激素对促进兰科植物
幼苗的生长具有重要作用ꎬ 但不同的植物种类最
适合的植物激素浓度也不相同 (Roy 等ꎬ 2011ꎻ
Abraham 等ꎬ 2012ꎻ Suzuki 等ꎬ 2012ꎻ Bektas 等ꎬ
2013)ꎮ 在该研究中添加 1􀆰 0 mg􀅰L-1 NAA 和 1􀆰 0
mg􀅰L-1 6 ̄BA 时白旗兜兰幼苗生长最好ꎬ 同时在
所用的 6种培养基中植株的根都生长良好 (表 3)ꎮ
本研究筛选出了极小种群植物白旗兜兰种子
非共生萌发的最适培养基ꎬ 并对培养基、 种子成
熟度、 种子预处理和光照对白旗兜兰种子萌发率
表 2  不同培养基对白旗兜兰幼苗生长和生根的影响
Table 2  The effects of different media on seedling development and root formation of Paphiopedilum spicerianum
缩写
Abbreviation                         培养基组成 Media content
叶长生长率
Leaf length
growth rate / %
生根
状况
Roots
HYPO1 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+0􀆰 5 mg􀅰L-1 NAA+1􀆰 0 g􀅰L-1活性炭 158 ± 16b 好
HYPO2 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+2􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+0􀆰 5 mg􀅰L-1 NAA+1􀆰 0 g􀅰L-1活性炭 91 ± 13b 好
HYPO3 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+3􀆰 0 g􀅰L-1蛋白胨+0􀆰 2 mg􀅰L-1 NAA+2􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+1 g􀅰L-1活性炭 166 ± 19ab 好
HYPO4 3􀆰 0 g􀅰L-1花宝一号+1􀆰 0 mg􀅰L-1 NAA+1􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+0􀆰 5 g􀅰L-1活性炭+10%香蕉匀浆 283 ± 29a 好
MS_NAAO MS+0􀆰 2 mg􀅰L-1 NAA+2􀆰 0 mg􀅰L-1 6 ̄BA+2􀆰 0 g􀅰L-1活性炭 144 ± 26ab 好
MS_IBAO MS+0􀆰 2 mg􀅰L-1 IBA+0􀆰 2 mg􀅰L-1 6 ̄BA+2􀆰 0 g􀅰L-1活性炭 174 ± 16b 好
416                                  植 物 分 类 与 资 源 学 报                            第 37卷
的影响进行了综合研究ꎬ 同时优化了幼苗生根壮
苗的培养基和培养条件ꎬ 把白旗兜兰的种子萌发、
幼苗形成到幼苗的健壮生长整个过程减缩到一年ꎬ
实现了白旗兜兰种苗快速扩繁的目的ꎬ 形成了较
为完善的白旗兜兰种子非共生萌发和种苗快速扩
繁的技术体系ꎬ 为极小种群物种白旗兜兰的有效保
护提供了技术支撑ꎬ 同时也为其他兜兰属植物的种
子非共生萌发和种苗扩繁提供了借鉴ꎮ
〔参  考  文  献〕
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