全 文 ：植物环蛋白的结构 ?
唐 军1 , 2 , 谭宁华1
??
, 许文彦1 ,2 , 嵇长久1 , 2 , 潘蓄林1 ,
Conan Wang3 , Norelle L . Daly3 , David J . Craik3
(1 中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室 ,
云南 昆明 650204; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049;
3 Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, QLD 4072 , Australia)
摘要 : 简要介绍了植物环蛋白的定义、结构特点、研究历史、分布、提取分离方法、化学合成与生物合
成、生物活性与生物功能。并主要以从紫花蔓地丁 ( Viola labridorica) 中分离得到的六个环蛋白之一 , cy-
cloviolacin O2 为例介绍通过还原酶解 - 质谱与二维核磁共振谱结合鉴定环蛋白结构的研究方法。
关键词 : 紫花蔓地丁 ; 堇菜科 ; 环蛋白 ; cycloviolacin O2
中图分类号 : Q 946 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 02 - 232 - 07
Structure of Cyclotide : Cycloviolacin O2 *
TANG Jun
1 , 2
, TAN Ning-Hua
1 * *
, XU Wen-Yan
1 , 2
, J I Chang-Jiu
1 , 2
, PAN Xu-Lin
1
,
Conan WANG3 , Norelle L . DALY3 , David J . CRAIK3
(1 State KeyLaboratory of Phytochemistry and Plant Resources in West China, Kunming Instituteof Botany, Chinese Academy
of Sciences, Kunming 650204 , China; 2 Graduate University of ChineseAcademy of Sciences, Beijing 100049 , China;
3 Institute for Molecular Bioscience, University of Queensland, Brisbane, QLD 4072 , Australia)
Abstract: Herein we briefly introduced definition, structural characteristic, history, distribution, extraction and isolation,
synthesis and biosynthesis, bioactivity and biofunctionof cyclotides . Thenwe gavecycloviolacin O2 as an example, one of
six cyclotides isolated from Viola labridorica, to introduce structural determination methods for cyclotides with reduction-
enzyme digestion-mass spectra and two-dimensional nuclear magnetic resonance spectra .
Key words: Viola labridorica; Violaceae; Cyclotides; Cycloviolacin O2
植物环蛋白 ( Tan and Zhou, 2006 ) 也称堇菜
科类型环 肽 ( cyclotides, Violaceae-type cyclopep-
tides, macrocyclic peptides, circular proteins, cyclic
mini-proteins 或 cyclic proteins) , 当 1999 年 David
J . Craik用 cyclotides这一名词来反映其环状多肽
本质时 ( Craik 等 , 1999) , 环蛋白即被正式确认
为一类新的植物蛋白家族。它是植物体内一类富
含二硫键 , 由 28 至 37 个氨基酸残基通过肽键首
尾连接的大环肽。其分子中除了含有首尾相连的
环状骨架外 , 还存在六个非常保守的半胱氨酸残
基 , 它们两两之间形成三对二硫键 , 其中的两对
二硫键和环状骨架形成一内环 , 而第三对二硫键
则穿过这一内环形成一独特的环状胱氨酸结
(cyclic cystine knot, CCK )。植物环蛋白的 CCK 结
构特征使其特别稳定 , 能耐常规的酶解和酸解。
最早的植物环蛋白报道为上世纪 70 年代早
期关于非洲热带茜草科植物 Oldenlandia affinis的
报道 , 挪威医生 Lorents Gran 发现了非洲扎伊尔
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (2) : 232～238
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : nhtan@ mail .kib. ac. cn
收稿日期 : 2007 - 09 - 06 , 2007 - 09 - 30 接受发表
作者简介 : 唐军 ( 1977 - ) 男 , 在读博士研究生 , 主要从事植物环蛋白化学研究。 ?
基金项目 : 中国科学院西部之光项目 , 国家自然科学基金 ( 30725048) 及中澳科技合作特别基金项目
等地妇女临产前常饮用该植物煎制的茶来催生 ,
后经其研究从该植物的沸水提取物中发现了一种
具有子宫收缩作用的多肽 (即 kalata B1) ( Gran,
1973a) 。当时通过氨基酸分析只确定了其大多数
氨基酸残基和环状特性 , 直到 1995 年才由 David
J . Craik 等人通过二维核磁共振谱和距离限制模
拟退火计算分析 ( distance-restrained simulated an-
nealing) 解析出其氨基酸序列、环状骨架和三维
结构 ( Saether 等 , 1995 )。1994 年人们用不同的
生物活性筛选模型进行活性追踪 , 相继发现了
circulin A 与 B (Gustafsan等 , 1994 ) 和 cyclopsych-
otride A (Witherup等 , 1994) 。至今人们已从堇菜
科、茜草科和葫芦科等 10 多种植物中发现了近
百个环蛋白分子 ( Tan and Zhou, 2006; Simonsen
等 , 2005) 。
1998 年 Per Claeson等 (1998) 提出了植物环
蛋白成分的提取分离方法。其思路是先用二氯甲
烷脱脂后再用 50% 乙醇冷浸提取 , 提取液浓缩
至一定体积后以聚酰胺柱除去单宁类成分 , 再用
正丁醇萃取 ; 正丁醇萃取部分经 Sephadex-G10 进
行分子排阻色谱除去小分子类成分 , 然后用 RP-
18 反相材料进行固相萃取除去多糖类和盐类成
分 , 至此得到总环蛋白的组分。该组分经 LH-20
及 RP-HPLC 反复纯化可得到植物环蛋白。
植物环蛋白具有广泛而多样的生物活性 , 如
子宫收缩 ( Gran, 1973a, b)、抗 HIV ( Gustafsan
等 , 1994 )、神经紧 张素抑制剂 ( Witherup 等 ,
1994)、抗微生物活性 ( Tam等 , 1999a) 、胰蛋白
酶抑 制剂 ( Hernandez 等 , 2000 )、细胞毒 活性
(Tam等 , 1999a) 和杀虫活性 ( Jennings等 , 2001)
等。基于环蛋白在堇菜科堇菜属植物中具有组织
特异性表达的特点 , Craik 等 ( 2004 ) 认为环蛋
白在植物体内可作为防御性多肽而起杀虫和抗菌
的作用 , 提出环蛋白可能是一类新的植物防御多
肽家族。目前研究认为其作用机制可能是通过调
节生物膜通透性而起作用的。环蛋白一方面由于
其内在的活性可能被直接用作药物或作为新药研
究的先导结构 ; 另一方面由于其精确的三维结
构、高稳定性和其中一些环 ( loop) 中氨基酸残
基的可变性 , 可连接其它活性新颖的物质而可能
成为在多肽药物设计上非常有用的骨架结构 , 目
前已有研究证明这一稳定结构连接其它活性成分
的可行性。最为诱人的是环蛋白具有强杀虫活
性 , 可能作为天然的杀虫剂在植物保护上应用。
植物环蛋白三对二硫键形成的 CCK 及其所
具有的广泛多样的生物活性 , 激起了人们对于它
的合成和折叠这一极具挑战性研究的兴趣。环蛋
白的有机合成研究不仅在环蛋白结构和二硫键连
接的验证有着重要作用 , 而且使经修饰后的环蛋
白在医药和农业上应用成为可能。David J . Craik
等 ( Daly 等 , 1999 ) 使用两种方法合成了 kalata
B1 , 一种方法是先氧化形成二硫键然后环合 ,
另一种方法是先环合后氧化形成二硫键 , 而且后
一种方法更好。Tam等 ( 1999b) 用 thio-zip环合
方法合成了 circulin B 和 cyclopsychotride A。环蛋
白分子的生物合成与那些小的环肽抗生素的生物
合成有着明显的区别 , 后者是微生物经非核糖体
途径通过多肽合成酶合成的间接基因产物 , 常具
有经过修饰的氨基酸残基和非肽键存在 , 而环蛋
白则是真正的基因产物 , 由基因编码的一个较大
的前体蛋白经剪切环合而来。Marilyn Anderson等
( Jennings等 , 2001 ) 从 Oldenlandia affinis 分离得
到编码 kalata B1 及其系列环蛋白的 cDNA 克隆。
这些 cDNA 克隆编码一段带有 20 个氨基酸残基
的信号肽序列和由 46～68 个氨基酸残基组成的
N 末端前体序列及被约 25 个氨基酸残基分隔开
的 1 至 3 个环蛋白结构域的原前体肽。
由于环蛋白所具有的环状主链与 CCK 结构
而具有对酶解和酸解很强的抗性 , 要想对它们的
结构进行研究首先就需要对其进行还原或还原烷
基化后酶解或部分酸水解后再进行测序。具体的
方法包括氨基酸组成分析、蛋白酶消化还原或还
原烷基化后的 PEC 衍生物、部分酸水解、Edman
降解、FAB-MS、ESI-MS、MALDI-TOF MS、二维
核磁共振谱法 (DQF-COSY、HOHAHA、TOCSY、
NOESY 和 ROESY 等 ) 以及 LC-MS 和 tandem MS。
1995 年 Craik 等通过二维核磁共振谱与距离限制
模拟退火计算分析方法获得了 kalata B1 在溶液
中的三维结构 , 结果表明其主要是以小转角连接
的β折叠构成 (Saether 等 , 1995 ) 。除 kalata B1
外人 们 还对 circulin A、MCoTI-Ⅱ、 palicourein、
vhr1 和 cycloviolacin O1 溶液中的三维结构进行了
测定 (Tan and Zhou, 2006 )。通过对环蛋白结构
的分析 , 将其分为三个亚家族即 Bracelet 亚族、
3322 期 唐 军等 : 植物环蛋白的结构
Moebius 亚族 和 TI 亚 族 ( Tan and Zhou, 2006;
Craik 等 , 1999) 。
本研究组长期从事植物环肽研究 , 近年新开
展植物环蛋白研究 , 目前正在开展堇菜科紫花蔓
地丁 ( Viola labridorica)、三色堇 ( V. tricolor ) 和
如意草 ( V. hamiltoniana) 以 及葫 芦科 木鳖 子
( Momordica cochinchinensis) 和 苦 瓜 ( M. char-
antia) 5 种植物的环蛋白研究工作。现已从紫花
蔓地丁中分离得到六个环蛋白 , 其中 3 个环蛋白
已通过还原酶解 - 质谱和二维核磁共振谱确定其
结构 , 均为已知环蛋白 , 分别为 cycloviolacin O2
( Craik 等 , 1999)、kalataB1 (Saether等 , 1995) 和
vary peptide A ( Claeson等 , 1998) 。另外 3 个从质
谱数据推测可能是新的环蛋白。本文将主要以
cycloviolacin O2 的结构研究为例介绍植物环蛋白
的结构研究方法。
1 材料与方法
1 .1 紫花蔓地丁的采集与提取分离
2005 年 11 月于中国科学院昆明植物研究所园区内
采集紫花蔓地丁全草 , 晒干后经适当粉碎 ( 10 kg) , 用
氯仿冷浸 3 次除去脂溶性成分 , 然后用 50%的乙醇冷浸
提取 , 提取液浓缩至一定体积经聚酰胺柱层析脱单宁后
以正丁醇萃取得到总环蛋白部分。总环蛋白部分在 RP-
18 材料上固相萃取以除去非肽类成分 , 最后在高效液相
色谱 (HP1100 , ZORBAX Eclipes XDB-C18 ( 4.6×150 mm) )
上以含 0 .1% TFA 的水与乙腈系统进行分离纯化得到 cy-
cloviolacin O2 (16 mg) , kalata B1 和 vary peptide A 混合物
(9 mg)。
1 .2 Cycloviolacin O2 的核磁共振谱测试
将 cycloviolacin O2 样品 16 mg溶于 500μl 溶剂中 ( 50
μl CD3 CN + 400μl H2 O+ 50μl D2 O) , 在 Bruker DRX600 仪
器上测定样品的1 H NMR、TOCSY、ROESY。
1 .3 Cycloviolacin O2 的质谱检测
取约 20μg的 cycloviolacin O2 的干样溶于 20μl 含 100
mmol?L 碳酸氢铵的缓冲溶液 ( pH 8 .1) 中 , 加新配制的
含 100 μmol?L 三羧 乙 基膦 ( tris-carboxyethyl phosphine,
TCEP) 的溶液后于 55℃下反应 30 min。反应结束后 , 将
之等分为两份各 10μl , 分别装入 eppendorff 管中 , 其中一
管加 5μl 含 40μg?ml 的胰蛋白酶 ( trypsin) 和 5μl 含 40
μg?ml 的内切蛋白酶 GluC (TE) , 另一管加入 5μl 含 40μg?
ml的糜蛋白酶 (chymotrypsin) 和 5μl 含 40μg?ml 的内切
蛋白酶 GluC (CE) , 于 37℃下进行 3 h消化。
消化结束后采用微量移液器吸头微量固相萃取脱盐
及除去加入的消化蛋白酶。即用 50μl 含 1%甲酸的 70%
乙腈溶剂反复吸取 20 次以活化微量移液器吸头内的固相
萃取材料 , 再以 50μl 含 1%甲酸溶液 (平衡液 ) 反复吸
取 20 次平衡固相萃取材料。同法吸入消化好的样品再分
步洗脱 , 首先用 20μl 平衡液和 20μl 含 1%甲酸的 5 %乙
腈溶剂反复洗脱 , 最后以 10μl 含 1 %甲酸的 80%乙腈溶
剂将消化好的的样品洗脱下来即为供检液 , 进行 MALDI-
TOF MS和 MS?MS 分析。
1 .4 KalataB1 和 vary peptide A 混合物的结构测定方法同
cycloviolacin O2。
2 结构分析与讨论
2 .1 Cycloviolacin O2 二维核磁共振谱图解析
通过 TOCSY 二维核磁谱图 (图 1) 可识别出
样品中所含的 27 个氨基酸残基的质子自旋系统 ,
分别为一个丙氨酸残基 ( A )、六个半胱氨酸残
基 ( C)、一个谷氨酸残基 ( E )、三个甘氨酸残
基 (G) 、三个异亮氨酸残基 ( I )、二个赖氨酸残
基 (K )、五个丝氨酸残基 (S)、二个缬氨酸残
基 ( V) 、一个精氨酸残基 ( R) 、一个色氨酸残
基 ( W)、一个酪氨酸残基 (Y ) 和一个门冬酰胺
残基 (N)。另外在高场区的信号还显示了一个
异亮氨酸残基 ( I ) 和两个脯氨酸残基 ( P) 的质
子自旋系统。表 1 给出了该分子 30 个氨基酸残
基的质子化学位移。
通过 ROESY 谱图 (图 2) 中前一个氨基酸残
基的α碳上的氢与后一个氨基酸残基中氮上的氢
的相关峰把不同的氨基酸残基连接成两个大的片
段 , 分 别 为 CGESCVWI 和 SSAIGCSCKSKV-
CYRNGI。
至此分子只剩下 4 个氨基酸残基 ( P、P、
C、I ) 的连接及通过 ROESY 推测出的两个片段
如何连接的问题未解决。而从以上分析推测 , 该
样品可能是 cycloviolacin O2。
2 .2 Cycloviolacin O2 质谱数据分析
样品还原前与还原后的质谱 ( MALDI-TOF
MS) 如图 3、4 所示 : 从图中可以看出样品分子
中的三对二硫键经三羧乙基膦 ( TCEP) 还原后 ,
其分子量增加了 6 个单位 , 反应完全。
通过对样品进行胰蛋白酶和内切 蛋白酶
GluC 的专一性酶切降解和 MALDI-TOF MS 分析 ,
TE 质谱图显示有分子量为 3163、 2493、1972、
1757、1211 的酶解片段峰存在。而通过对样品用
432 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 1 Cycloviolacin O2 的 TOCSY 谱图
Fig . 1 TOCSY spectrum of cycloviolacin O2
图 2 Cycloviolacin O2 的 ROESY 谱图
Fig . 2 ROESY spectrum of cycloviolacin O2
糜蛋白酶和内切蛋白酶 GluC 的专一性酶切降解
和 MALDI-TOF MS 分 析 , CE 则 显 示 有 3163、
2337、1862 的酶解片段峰存在。将质谱上所显示
的峰与环蛋白数据库中用相同方法处理的 cyclov-
5322 期 唐 军等 : 植物环蛋白的结构
iolacin O2 所得到的质谱数据进行比对 , 这些酶
解片段序列分别确定为 :
TE: 3163 (SCVWIPCISSAIGCSCKSKVCYRNGIPCGE)
2493 (SCVWIPCISSAIGCSCKSKVCYR)
1972 (SCVWIPCISSAIGCSCKSK )
1757 (SCVWIPCISSAIGCSCK )
1211 (VCYRNGIPCGE)
CE: 3163 (SCVWIPCISSAIGCSCKSKVCYRNGIPCGE)
2337 (SCVWIPCISSAIGCSCKSKVCY )
1862 ( IPCISSAIGCSCKSKVCY )
表 1 Cycloviolacin O2 分子中 30 个氨基酸残基的质子化学位移
Table 1 Proton chemical shifts of 30 amino acid residues in cycloviolacin O2
氨基酸
残基
Amino acid
residues
质子
Proton
化学位
移值
δH
氨基酸
残基
Amino acid
residues
质子
Proton
化学位
移值
δH
氨基酸
残基
Amino acid
residues
质子
Proton
化学位
移值
δH
氨基酸
残基
Amino acid
residues
质子
Proton
化学位
移值
δH
C1 ?HA 4 D. 556 I8 !HA 4 .757 I15 HB 1 .915 V23 HN 7 ?. 971
C1 ?HB2 ;3 D. 081 I8 !HB 1 .870 I15 HG12 1 .181 V23 QG1 *0 ?. 669
C1 ?HB3 ;3 D. 197 I8 !HG12 1 .021 I15 HG13 1 .430 C24 HA 5 ?. 124
C1 ?HN 8 D. 493 I8 !HG13 1 .421 I15 HN 7 .455 C24 HB2 *2 ?. 663
G2 ?HA1 =3 D. 639 I8 !HN 7 .505 I15 QG1 0 .851 C24 HB3 *3 ?. 083
G2 ?HA2 =4 D. 065 I8 !QG1 0 .834 I15 QG2 1 .181 C24 HN 7 ?. 730
G2 ?HN 8 D. 771 I8 !QG2 0 .959 G16 HA1 3 .742 Y25 HA 5 ?. 135
E3 ?HA 4 D. 622 P9 )HA 4 .423 G16 HA2 4 .242 Y25 HB2 *2 ?. 675
E3 ?HB2 ;1 D. 687 P9 )HB2 2 .401 G16 HN 8 .184 Y25 HB3 *2 ?. 771
E3 ?HB3 ;1 D. 933 C10 >HA 4 .312 C17 HA 4 .814 Y25 HN 9 ?. 694
E3 ?HN 7 D. 532 C10 >HB2 2 .747 C17 HB2 2 .546 R26 HA 4 ?. 742
E3 ?QG 2 D. 407 C10 >HB3 2 .936 C17 HB3 3 .388 R26 HN 9 ?. 291
S4 ?HA 4 D. 718 C10 >HN 8 .320 C17 HN 7 .772 N27 HA 4 ?. 361
S4 ?HB2 ;3 D. 896 I11 3HA 4 .104 S18 HA 4 .713 N27 HB2 *2 ?. 851
S4 ?HB3 ;4 D. 028 I11 3HB 1 .890 S18 HN 9 .479 N27 HB3 *3 ?. 117
S4 ?HN 8 D. 737 I11 3HN 8 .197 S18 QB 3 .829 N27 HN 9 ?. 559
C5 ?HA 5 D. 300 I11 3QG1 1 .188 C19 HA 4 .698 G28 HA1 ,3 ?. 474
C5 ?HB2 ;3 D. 198 S12 9HA 4 .373 C19 HN 8 .801 G28 HA2 ,4 ?. 150
C5 ?HB3 ;3 D. 281 S12 9HN 8 .701 C19 QB 3 .125 G28 HN 8 ?. 505
C5 ?HN 8 D. 123 S12 9QB 4 .032 K20 HA 4 .647 I29 }HA 4 ?. 802
V6 ?HA 3 D. 393 S13 9HA 4 .531 K20 HN 9 .590 I29 }HB 2 ?. 098
V6 ?HB 1 D. 545 S13 9HB2 3 .825 S21 HA 3 .995 I29 }HG12 >1 ?. 318
V6 ?HN 7 D. 961 S13 9HB3 3 .957 S21 HN 9 .184 I29 }HG13 >1 ?. 587
V6 ?QG1 ;0 D. 102 S13 9HN 7 .808 S21 QB 3 .927 I29 }HN 8 ?. 034
V6 ?QG2 ;0 D. 887 A14 @HA 4 .371 K22 HA 3 .485 I29 }QG1 *0 ?. 937
W7 ?HA 4 D. 817 A14 @HN 8 .366 K22 HN 8 .117 I29 }QG2 *1 ?. 051
W7 ?HB2 ;3 D. 093 A14 @QB 1 .391 V23 HA 4 .221 P30 HA 4 ?. 139
W7 ?HB3 ;3 D. 416 I15 3HA 4 .095 V23 HB 1 .966 P30 HB2 *2 ?. 149
W7 ?HN 8 D. 169
图 3 样品还原前 MALDI -TOF MS 质谱图
Fig . 3 MALDI -TOF MS spectrum before reduction of cycloviolacin O2
图 4 样品还原后 MALDI-TOF MS质谱图
Fig . 4 MALDI -TOF MS spectrum after reduction of cycloviolacin O2
632 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 5 CE 酶解片段中 1862 峰的 MS?MS 谱
Fig . 5 MS?MS spectrum of the 1862 fragment of CE digested products of cycloviolacin O2
从比对结果中可以找到分子中剩余的 4 个氨
基酸残基 ( P、P、C、I ) 的可能连接及由 ROE-
SY 推测出的两个片段是如何连接的。对其中能
提供结构信息的酶片段进一步做 MS?MS 分析即
可推测其结构 , 如通过对 CE 酶解片段中分子量
为 1862 片段进行 MS?MS 的分析 , 如图 5 所示 ,
即可证实有 IPCISSAIGC 片段的存在。
2 .3 Cycloviolacin O2 结构确定
二维核磁共振谱图 ( ROESY ) 所建立的两个
片段、环蛋白数据库质谱数据比对及对酶解片段
的 MS?MS 分析确定该环蛋白为 cycloviolacin O2
(Craik等 , 1999 ) , 含 30 个氨基酸残基 , 分子量
为 3141 , 其结构如下 (图 6) :
图 6 Cycloviolacin O2 的模拟结构
Fig . 6 Structureof cycloviolacin O2
7322 期 唐 军等 : 植物环蛋白的结构
2 .4 ?Vary peptide A 和 kalata B1 的结构测定与
确定
样品通过与 cycloviolacin O2 相同处理方法进
行结构测定 , 从其质谱图上可以看到两个分子离
子峰 , 分子量分别为 2878 和 2892 , 比列约为 2∶
1。这两个分子的 TOCSY、ROESY 谱图很相似 ,
唯一不同的是第 16 个氨基酸残基在分子量为
2878 的分子中为丝氨酸 ( Ser) , 而在分子量为
2892 的分子中为苏氨酸 (Thr)。由于这两个氨基
酸残基在其分子氨基酸序列中所处的位置一样 ,
它们的化学位移相差很小 , 但它们的质子自旋系
统不同 , 因此在 TOCSY、ROESY 谱图上可以将
其区分开来。最后综合其质谱和二维核磁 TOC-
SY、ROESY 谱图中所得到的信息与环蛋白数据
库中的数据进行比对 , 分别将其结构确定为 Vary
peptideA (1) (含 29个氨基酸残基 , 分子量为 2878)
(Claeson等 , 1998) 和 kalata B1 (2) ( 含 29 个氨基
酸残基 , 分子量为 2892 ) (Saether等 , 1995 )。
致谢 澳大利亚 Queensland大学分子生命科学研究所在
样品结构测定中所给予帮助 ; 何敏及本组成员在样品采
集及实验过程中给予帮助。
〔参 考 文 献〕
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