全 文 ：一个控制拟南芥小孢子发育基因的定位?
冯丹丹 , 吴玉婷 , 张 帆 , 张 森 , 杨仲南 , 高菊芳??
(上海师范大学生命与环境科学学院 , 上海 200234)
摘要 : 通过 EMS诱变、背景纯化与遗传分析 , 从拟南芥突变群体中分离到一株单隐性核位点控制的雄性
部分不育突变体 pms15-16-2-3。细胞学观察表明 , 突变体在花药发育的过程中 , 中层细胞延迟降解 , 绒毡
层细胞形态分化异常 , 出现异常的四分体 , 导致最终只能形成少量的花粉。利用图位克隆的方法对该基因
进行了定位 , 结果表明 PMS15-16-2-3 基因位于拟南芥第 3 条染色体 BAC 克隆 T24C20 上的 28 kb区间内。目
前该区间内尚未见到控制小孢子发育基因的报道 , 因此该基因是一个控制小孢子发育的新基因。本研究结
果对目的基因的克隆及其在花粉发育中的功能研究奠定了基础。
关键词 : 拟南芥 ; 雄性不育 ; 小孢子 ; 图位克隆 ; 定位
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 04 - 471 - 06
Mapping of an Arabidopsis Gene Involved
in Microspore Development *
FENG Dan-Dan, WU Yu-Ting, ZHANG Fan, ZHANG Sen,
YANG Zhong-Nan, GAO Ju-Fang* *
( College of Lifeand Environment Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai 200234 , China)
Abstract : An Arabidopsis partial male-sterilemutant was isolated fromalibraryof mutants mutagenized by enthyl methane
sulfonate ( EMS) treatment . Genetic analysis indicated that the mutant was controlled by a single recessive nuclear gene
named PMS15-16-2-3 . Cytological observations of the anther development of pms15-16-2-3 mutant and the wild-type plant
showed that themutant middle layer degenerated later, both the tapetal cell morphology and the tetrads were abnormal,
which resulted in few fertile pollengrains formed in theanther . Themutant PMS15-16-2-3 genewas mapped to aregion of
28-kb in BAC T24C20 on chromosome 3 using a map-based cloning strategy . No genes involved in microspore formation
were reported in this region, so we believe that PMS15-16-2-3 gene could be a new gene controlling microspore develop-
ment in Arabidopsis . This work provides thebasisfor further molecular cloningandfunctional analysis of this gene in Ara-
bidopsis pollen development .
Key words: Arabidopsis thaliana; Male sterile; Microspore; Map-based cloning; Mapping
雄性生殖发育异常导致可遗传的完全不育或
育性降低是被子植物十分显著的现象 ( Kaul ,
1988)。近年来 , 花药发育研究所取得的进展得
益于模式植物遗传学的发展 , 特别是拟南芥花药
发育突变体的分析。此外 , 随着分子生物学技术
的进步 , 克隆了许多花药特异表达基因 , 对理解
花药发育的机理提供了必不可少的资料。
花药发育的细胞学研究已经详细了解了花药
发育过程中各个时期所发生的重要的细胞学事件
( Regan and Moffatt, 1990; Smyth等 , 1990; Bowman
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (4) : 471～476
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.07314
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : gaojufan@ shnu. edu. cn
收稿日期 : 2008 - 01 - 04 , 2008 - 04 - 16 接受发表
作者简介 : 冯丹丹 (1982 - ) 女 , 在读硕士研究生 , 主要从事植物基因功能研究工作。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金项目 (30530100 , 30671127 ) 资助
等 , 1991; Goldberg等 , 1993 )。拟南芥花药发育
从雄蕊原基发生到花药开裂脱落可划分为 15 个
时期 (Sanders等 , 1999)。在第 1～4 期 , 花药原
基开始细胞分裂形成各种组织 , 逐渐形成四角结
构 , 包含成熟药室的腔、壁、连接细胞和导管区
域。在第 5 期 , 四角结构中的孢子体细胞逐渐分
化形成了药室内壁层、中层、绒毡层和小孢子母
细胞。小孢子母细胞经过第 6～7 期的减数分裂
形成含有单倍体小孢子的四分体 , 四分体外包裹
有一层厚厚的胼胝质层 , 中层细胞开始退化直至
消失。第 8 期小孢子从四分体中释放出来 , 并在
9～12 期经过两次有丝分裂形成三核花粉粒 , 绒毡
层在第 11 期降解 , 第 12 期隔膜细胞开裂 , 花药
分为两个药室。第 13 期花药在裂缝处开裂 , 花粉
粒释放。第 14 期雄蕊开始衰老 , 细胞与花药结
构收缩。第 15 期雄蕊从衰老的花中脱落下来。
绒毡层是一层独特的分泌细胞层 , 位于花药
药室壁四层孢子体细胞的最内层 , 与配子体直接
相连。由于绒毡层细胞与发育的小孢子或花粉之
间存在着这种直接接触的关系 , 当这种正常的交
流出现紊乱时 , 就会导致雄性不育。雄性不育的
发生与绒毡层正常的发育途径受干扰有关。已有
许多控制拟南芥绒毡层细胞发育命运的相关基因
被克隆 , 如 MS1 ( Wilson 等 , 2001; Ito and Shi-
nozaki, 2002 )、 EMS1 ( Zhao 等 , 2002 )、 AtGPT1
(Zheng等 , 2003 )、TPD1 (Yang等 , 2003a)、AMS
(Sorensen等 , 2003)、DYT1 (Zhang等 , 2006) 等 ,
当这些基因发生突变时 , 都因绒毡层发育异常而
不能形成正常的花粉粒 , 造成雄性不育。
减数分裂是配子体发生过程中的重要事件。
目前 , 在拟南芥中已报道的与小孢子减数分裂有
关的基因有 MMD1 , 该基因编码 PHD-finger 转录
因子 , 该转录因子负责调控减数分裂时的基因表
达 , 其 突变 将导 致 性母 细 胞死 亡 ( Yang 等 ,
2003b) ; SYN1 基因编码一个 RAD21 相关蛋白 ,
该蛋白在染色体浓缩和姐妹染色单体配对的过程
中起作用 (Bai 等 , 1999; Cai 等 , 2003) ; ASK1 基
因的突变造成染色体减数分裂Ⅰ后期染色体分裂
不均一 ( Yang 等 , 1999; Yang 等 , 2006 ) ; MS5?
Pollenless3 基因则调控着减数分裂Ⅱ期的分裂过
程 (Glover 等 , 1998) ; MEI1 基因与染色体重组
修复相关 , 该突变体的四分体异常 , 经常形成 5
～8 个不均匀的小孢子的四分体 ( He and Mas-
carenhas, 1998) 。
本文通过 EMS ( ethyl-methae sulfonate) 诱变
处理野生型拟南芥群体 , 分离得到一株雄性部分
不育突变体 pms15-16-2-3。遗传分析表明该突变
体的性状是由单个隐性核基因控制的。该突变体
花药发育的细胞学观察表明 , 突变体花药在中层
细胞退化 , 绒毡层细胞形态分化及小孢子母细胞
减数分裂等方面出现异常 , 造成大量小孢子形态
不正常 , 最后仅形成少量可育花粉 , 部分果荚中
结少量种子。我们利用图位克隆的方法对突变基
因进行了定位 , 结果表明 , PMS15-16-2-3 基因位
于第 3 条染色体上 BAC 克隆 T24C20 内的 28 kb
区间内。这些结果为基因的克隆及研究该基因的
功能奠定了基础。
1 材料与方法
1 .1 植物材料
拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) 分别以 Landsberg erecta
(Ler) 和 Columbia (Col ) 为遗传背景 , 拟南芥雄性部分不
育突变体 pms15-16-2-3 由本实验室经 EMS 诱变获得。种
植方法同易君等 (2006)。
1 .2 方法
1 .2 .1 遗传分析 以野生型 Ler为父本 , 突变体为母本
进行杂交得到 F1 代 , F1 代自交得到 F2 代。种植 F2 代 ,
观察 F2 代表型 , 统计 F2 代中可育植株与不育植株的比
例。
1 .2 .2 雄性部分不育基因的定位 收集用野生型 Col 作
为父本与突变体杂交所得到的 F2 遗传群体中的突变体用
于基因定位。基因初定位的方法及所用分子标记同易君
等 (2006) , 一旦找到了连锁的分子标记 , 就在该分子标
记附近设计新的分子标记 (表 1) , 用高通量提取 DNA 的
方法 (Xin等 , 2003 ) 提取大批 F2 遗传群体中的突变体
单株 DNA , 对这些植株进行基因型分析 , 对目的基因进
行进一步定位。
1 .2 .3 DNA 提取 拟南芥基因组 DNA 的提取参照 Sun
等 (2000 ) 的方法。
1 .2 .4 PCR 反应 PCR 反应参照 Sun等 (2000 ) 的方法。
分 子 标 记 T32N15 、 F13I23、 F1P2、 T24C20、 T8P19、
F24M12、T22E16 等是根据网站 www. arabidopsis.org 上公
布的拟南芥基因组多态性数据库 , 采用软件 Primer pre-
mier 5 .0 设计的。引物的序列由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。用 2 .5% 的琼脂糖凝胶进行电泳验
证 2 个亲本 Ler和 Col 之间的多态性。
274 云 南 植 物 研 究 30 卷
1 .2 .5 花药发育的光学显微镜观察 野生型与突变体植
株的花序在 FAA 固定液中固定 12～ 24 小时后 , 用 50%
乙醇洗 2～ 3 次 , 常规脱水 , spurr 树脂包埋 , 切片 , 片
厚 1μm, 1% 甲苯胺蓝染色后在显微镜下观察并拍照
(Zhang等 , 2007)。
1 .2 .6 花粉粒的扫描电镜观察 在解剖镜下分离野生型
和突变体植株 13 期的花药 , 置于金属台上 , 真空干燥后
喷金 , 扫描电镜观察并拍照记录 (Zhang等 , 2007)。
2 结果与分析
2 .1 突变体 pms15-16-2-3 的表型分析
突变体 pms15-16-2-3 是经化学诱变剂 EMS 诱
导拟南芥野生型 Ler筛选得到的。突变体在生长
过程中表现出正常的营养生长和花的发育 ( 图
1: A) , 而且正反杂交的实验证明其雌蕊是完全
可育的 ( 数据未显示 )。但是 , 与野生型植株比
较 , 突变体的多数果荚生长缓慢且短小、萎缩 ,
成熟后不含种子 , 只有少数会产生含种子的果荚
(图 1: B)。将这些种子种下 , 后代会产生同样
的表型 , 说明突变体的花粉育性下降 , 属于部分
雄性不育突变体。
图 1 野生型和突变体 pms15-16-2-3 植株形态和果荚比较
野生型植 株具有正常的果荚 , 且果 荚内种子数量多 ( A 左 , B
左 ) ; 突变体植株具有短小的果荚 , 果荚内只有少量种子或无种
子 ( A 右 , B 右 ) 。A 中标尺 = 2 cm; B 中标尺 = 1 cm。
wt: 野生型 , mu: 突变体
Fig . 1 Morphology comparison of the wild-type and
pms 15-16-2-3 mutant plant
A wild-type plant showing normal seedpods which contains many seeds
( left of A and B) ; a mutant plant with small seedpods with no or a few
seeds ( right of A and B) . Bar in A = 2 cm; Bar in B = 1 cm
为了进一步分析突变体 pms15-16-2-3 部分雄
性不育的原因 , 我们采用树脂半薄切片观察花药
横切面以及扫描电镜观察花粉粒外貌的方法 , 比
较了野生型和突变体花药发育的过程。观察表
明 , 在花药发育的前 5 个时期 , 突变体的花药和
野生型的花药在花药形态建成过程中没有明显的
差异 , 都能形成形态完整的四个药室 ( 数据未显
示 )。但从花药发育第 6 个时期开始可以看到突
变体花药与野生型的明显不同的现象 : 在花药发
育的第 6 期 , 野生型中层细胞开始衰退 , 细胞变
成细长型 , 在中层与药室内壁以及中层与绒毡层
之间出现空隙 ( 图 2: A) , 而突变体的中层细胞
仍保持扁圆形 , 但细胞内空泡化 , 仅残留细胞
壁 , 分别与绒毡层和药室内壁紧贴 ( 图 2: E) ;
第 7 期早期野生型小孢子母细胞减数分裂完成 ,
形成了含有四个小孢子的四分体 , 中层细胞进一
步退化 ( 图 2: B) , 晚期绒毡层细胞紧贴药室内
壁 , 分化为分泌型细胞 , 分泌胼胝质酶分解四分
体周围的胼胝质 ( 图 2: C) , 而突变体有的药室
中的小孢子母细胞减数分裂不正常 , 会出现含 5
～6 个小孢子的四分体 , 中层细胞在 7 期早期仍
保留第 6 期的形状 , 晚期在药室内壁与绒毡层之
间形成一条着色很深的细线 , 并且绒毡层细胞彼
此之间的细胞界限清晰 , 尚未形成分泌型绒毡层
(图 2: F , G) ; 第 8 期野生型药室中层细胞消
失 , 小孢子从胼胝质包裹的四分体中释放出来
(图 2: D) , 突变体药室此时与野生型的主要不
同是有些绒毡层细胞体积明显增大 ( 图 2: H) ;
第 9～10 期野生型花粉外壁形成 , 小孢子细胞内
开始积累营养物质 (图 2: I ) , 但突变体此时药
室中不仅绒毡层细胞形态与野生型的不同 , 而且
大量小孢子细胞内容物消失 , 仅残留花粉外壁
(图 2: M) ; 第 11～13 期野生型花药药室绒毡层
细胞开始退化并消失 , 小孢子经两次有丝分裂形
成三核花粉粒 , 花药开裂释放花粉粒 ( 图 2: J ,
K ) , 扫描电镜观察成熟花粉粒 , 形态正常 ( 图
2: L) , 突变体花药药室绒毡层细胞、药室隔膜
细胞及裂缝细胞在第 11～13 期的发育过程与野
生型类似 , 只是仅有少量发育正常的花粉粒 ( 图
2: N, O, P)。
上述结果表明 , 突变体中层细胞退化异常、
绒毡层细胞在 7～10 期形态异常以及减数分裂异
3744 期 冯丹丹等 : 一个控制拟南芥小孢子发育基因的定位
图 2 野生型和 pms15-16-2-3 突变体花药发育的比较
1 . 野生型第 6 期花药横切 ; 2 . 野生型第 7 期早期花药横切 , 小孢子母细胞完成减数分裂 , 形成四分体 , 箭头所指为残留中层细胞 ;
3 . 野生型第 7 期晚期花药横切 , 中层细胞消失 ; 4 . 第 8 期野生型绒毡层细胞和小孢子形态 ; 5 . 突变体第 6 期花药横切 , 箭头所指
为中层细胞 ; 6 . 突变体第 7 期早期花药横切 , 箭头所指为中层细胞 , 其形状与第 6 期的相同 ; 7 . 突变体第 7 期晚期花药横切 , 残
留的中层细胞形成着色深的细线位于绒毡层细胞和药室内壁细胞之间 , 箭头所指为不正常的四分体 ; 8 . 第 8 期突变体绒毡层细胞
和小孢子形态 ; 9 . 野生型第 9 期花粉外壁形成 ; 10 . 野生型第 11 期 ; 11 . 野生型第 12 期花药横切 ; 12 . 野生型 13 期花粉呈长椭圆体 ,
外观饱满 , 外壁纹饰结构和萌发沟清晰 ; 13 . 突变体第 9 期花粉外壁 , 但小孢子内容物少 ; 14 . 突变体 ( N) 的第 11 期 , 花药绒毡
层开始退化 , 箭头所指为绒毡层 ; 15 . 突变体第 12 期花药横切 ; 16 . 突变体 13 期花粉少数与野生型的相似 , 但多数为瘪的。
表皮细胞 ( E )、药室内壁细胞 ( En)、中层细胞 (ML )、绒毡层细胞 (T ) 、四分体 ( Tds)、小孢子母细胞 ( MMC) 、小孢子 (Msp)
以及花粉粒 ( PG)。标尺 = 10 微米。
Fig . 3 Comparison of wild-type and pms15-16-2-3 mutant anther development
1 . Stage 6 wild-type anther; 2 . Early stage 7 wild-type anther . Microspore mother cell finishing meiosis, tetrads are formed . The arrow indicates the
remnants of middle layer cells; 3 . Late stage 7 wild-type anther . The middle layer disappeared; 4 . Stage 8 wild-type anther . 8 ; 5 . Stage 6 mutant an-
ther . The arrow points to the middle layer cell ; 6 . Early stage 7 mutant anther . The arrow shows the middle layer cells similar to thoseof stage 6; 7 .
Late stage 7 mutant anther . Heavily stained remnants of middle layer exist between tapetum and endothelium . The arrow shows an abnormal tetrad; 8 .
Stage 8 mutant anther . The microspores are released as thewild-type, but the sizeof microspores and the shapeof tapetal cells aredifferent fromthat of
wild-type; 9 . Stage 9 wild-type anther; 10 . Stage 11 wild-type anther; 11 . Stage 12 wild-type anther; 12 . The released wild-typepollen gains are full-
shaped, with sculptured exine walls, and visible apertures; 13 . Stage 9 mutant anther . The exine wall of microspores formed, while some microspores
are devoid of intracellular substances; 14 . Stage 11 mutant anther . The arrow shows tapetum degenerated . Only few pollen grains accumulate nutrients
and stained deeply; 15 . Stage 12 mutant anther; 16 . Only few released mutant pollen grains are normal . Most are collapsed . E , epidermis; En,
endothecium; ML , middle layer; T, tapetum; Tds, tetrads; MMC , microspore mother cell ; Msp, microspore; PG, pollen grains . Bars= 10μm .
474 云 南 植 物 研 究 30 卷
常 , 造成了大多数小孢子不能正常发育 , 最终仅
形成少量正常成熟的花粉。说明 PMS15-16-2-3 基
因会影响小孢子母细胞的减数分裂过程以及影响
中间层细胞和绒毡层细胞的正常发育过程。
2 .2 突变体 pms15-16-2-3 的遗传分析
为了确定 pms15-16-2-3 突变体是否由单个基
因控制 , 将野生型 Ler 作为父本 , 突变体作为母
本杂交得到 F1 代 , F1 代自交得到 F2 代种子。种
植 F2 代 , 观察 F2 代表型 , 统计 F2 代中可育植株
与部分不育植株的比例。一共种植了三盆 , F1 代
植株全为可育的野生型表型 , 而 F2 代中可育植株
与部分不育植株为 268∶88 , 经卡方检测 , χ2 [ 1 ] >
0.0039 , P < 0 .95 其实际比例和理论比例没有明显
差异 , 表明该突变体表型是隐性单基因控制的。
2 .3 突变体 pms15-16-2-3 的遗传定位
为了进一步研究 pms15-16-2-3 突变体并最终
克隆该基因 , 我们进行遗传定位以确定该突变基
因在染色体上的位置。首先 , 我们选用了在拟南
芥基因组五条染色体上分布均匀的 20 对分子标
记 ( 引物序列见易君等 , 2006) 进行了基因的初
定位连锁分析。这 20 对分子标记在野生型 Ler
和 Col 之间具有序列的多态性。以这些分子标记
进行 PCR , 结果表明突变基因 PMS15-16-2-3 与第
3 条染色体上分子标记 CIW4 连锁。利用新设计
的分子标记 ( 表 1 ) 结合用高通量 PCR 方法
(Xin 等 , 2003 ) , 最终将基因 PMS15-16-2-3 定位
在第 3 条染色体 BAC 克隆 T24C20 上 28 kb 区间
内 ( 图 3 )。
表 1 基因定位所涉及的分子标记引物序列
Table 1 The sequences of molecular markers involved in gene mapping
Marker Forward primer ( 5 ?′-3′) Reverse primer ( 5′-3′)
CIW11 lCCCCGAGTTGAGGTATT GAAGAAATTCCTAAAGCATTC
T32 ?N15 CTTTGATCATGAATGGTAGTGTT AATTGCTTAGCTAATGAAAGTGAC
F13 ?I12 ACAGCAGGAAACAAGAAGC TTGAGTGCTTGAAAGGGAT
F1 ?P2 ATGTTGTGATGAGCGGGTAG GCGTTTGCGGTATCGTTT
T23 ?J 7 TCGTCTAGTTTTTCGAGGCTC CACATCCACAAAGGGTTAGAG
T24 ?C20-1 AGGAGGAGTAACCGAAGC TACCACGGAAATGACAATC
T24 ?C20 CATAATCTAATGGTTCGTTTGG GGAATGGGTTCAGGGTTT
T8 ?P19 ATGAGAACACGCAAAAGGA TGAAAACACTTCCAGCGAT
T22 ?E16 GAACTCCAAATCAAGCAA AAATTTCGATGGAGCATA
3 讨论
小孢子母细胞在第 6～7 期完成减数分裂、
中层细胞在第 6 期开始衰退以及绒毡层细胞从第
8 期开始分化为分泌型细胞是花药发育过程中的
图 3 PMS15-16-2-3 基因定位在第 3 条染色体 BAC 克隆
T24C20 上 28 kb 内。━━代表基因定位的区间位置
Fig . 3 Genetic mapping of gene PMS15-16-2-3
━━ Location of the gene PMS15-16-2-3
关键事件 , 一旦出现异常 , 可能造成雄性不育
( Goldberg 等 , 1993; Sanders 等 , 1999; Yang 等 ,
2003a, b; Bai 等 , 1999; Cai 等 , 2003; Yang 等 ,
1999; Yang等 , 2006; Glover等 , 1998; He and Mas-
carenhas, 1998)。我们在观察花药的横切面时发
现 , 突变体 pms15-16-2-3 有些小孢子母细胞会发
生不正常减数分裂 , 形成含有 5～6 个小孢子的四
分体。我们进一步用压片法观察用荧光染料 DAPI
染色的突变体 6～7 期的花药 , 发现大多数的四分
体含有四个小孢子 , 仅少数四分体中含有 5～6 个
小孢子 (数据未显示 )。上述结果提示 PMS15-16-
2-3 基因的功能可能涉及减数分裂过程。
许多研究已经表明 , 植物通过细胞壁的胞间
通讯 , 可能在形成位置效应、决定细胞分化命运
上具有重要的意义 ( Berger 等 , 1994; Wolpert,
1996; Ding, 1997; Strauss, 1998 )。在拟南芥药室
壁的四层结构中 , 中层细胞与绒毡层细胞紧密相
连。野生型花药的中层细胞在发育的第 6 期开始
退化 , 至第 8 期消失 , 而绒毡层细胞在中层细胞
消失后分化为分泌型细胞 , 这两个事件关系密
切 , 如果中层细胞不能正常退化 , 将改变绒毡层
细胞的发育命运。已报道的控制拟南芥绒毡层细
胞发育 命运的 相关基 因如 AMS ( Sorensen 等 ,
2003) 和 DYT1 (Zhang等 , 2006) , 当这些基因发
生突变时 , 中层细胞都不能正常退化 , 其结果绒
毡层细胞的发育命运也发生了改变。我们在观察
花药横切面时还发现突变体 pms15-16-2-3 中层细
胞的退化以及绒毡层细胞分化为分泌型细胞的过
程出现了异常 , 这一结果提示 PMS15-16-2-3 基因
的功能可能与花药中层细胞和绒毡层细胞发育命
运有关。
生物信息学分析表明在定位区间内有 8 个基
因 , 其中没有被克隆的不育基因的报道 , 因此
5744 期 冯丹丹等 : 一个控制拟南芥小孢子发育基因的定位
PMS15-16-2-3 基因是一个新的控制小孢子发育的
基因。目前 , 我们在购买候选基因的突变体 , 做
等位分析和遗传互补实验 , 准备克隆基因并对基
因功能进行进一步的研究。
〔参 考 文 献〕
Yi J ?un ( 易君 ) , Gao JF (高菊芳 ) , ZhangZB (张在宝 ) et al. , 2006 .
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