全 文 ：pFGC5941 的改造及拟南芥 NAC1 和 SIP1 双基因反义
表达载体的构建和遗传转化*
梁摇 鹏1, 孔祥翔2, 王春涛2, 查向东1**, 胡向阳2**
(1 安徽大学生命科学学院, 安徽 合肥摇 230031; 2 中国科学院昆明植物研究所, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 拟南芥中的 SIP1 基因编码的蛋白与拟南芥盐胁迫应答中的关键蛋白 SOS2 存在互作关系, 而 NAC1
为拟南芥中介导生长素信号促进其侧根发生的蛋白。 本研究中我们将 SIP1 基因和 NAC1 正义基因以及
SIP1 基因和 NAC1 反义基因分别整合到一个经改造的具有 2 个 35S启动子的可用于双基因表达的载体 pF鄄
GC5941S中, 构建了两个双基因表达载体 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti。 并
将这两个载体通过农杆菌介导的方法转化到野生型拟南芥中, 共获得 15 株转基因植株。 对这些转基因植
株进行盐胁迫实验发现, 在含 75 mmol·L-1 NaCl的 MS培养基上, 相比于野生型, pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄
sense转基因植株主根增长, 侧根数量明显增多, 而 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 转基因植株长势与野生型
苗相似。 由此我们推测可能只有当 SIP1 和 NAC1 同时过表达时, 才会促进盐胁迫下拟南芥侧根的发育。
关键词: NAC1 基因; SIP1 基因; 反义表达载体; 双基因表达载体; 拟南芥转化; 表型
中图分类号: Q 75, Q 943摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)04-403-06
Modification of pFGC5941 Construct and Transfer of Double Antisense
Genes of NAC1 and SIP1 into Arabidopsis thaliana
LIANG Peng1, KONG Xiang鄄Xiang2, WANG Chun鄄Tao2, ZHA Xiang鄄Dong1**, HU Xiang鄄Yang2**
(1 Institute of Life Sciences, Anhui University, Hefei 230031, China; 2 Kunming Institute of Botany,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: SIP1 encodes the protein which show interact with SOS2, the protein involving in plant responding to sa鄄
line stress while NAC1 encodes the protein which involves in auxin signal and promoting the development of lateral
root of Arabidopsis thaliana. In present study SIP1 and NAC1鄄sense and NAC1鄄anti were inserted into pFGC5941S
constructs, making the expression vectors pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense and pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti, respec鄄
tively. Fifteen transgenic A. thaliana harboring these two constructs ( pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense and pF鄄
GC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti) were then generated via Agrobacterium tumefaciens鄄mediated transformation. The pheno鄄
types of homozygous transformants which were grown on MS medium with 75 mmol·L-1 NaCl showed that compared
with wild鄄type A. thaliana, pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense transgenic plants exhibited longer main root and increas鄄
ing amounts of lateral roots, while no obvious differences were observed in pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti transgenic
plants. These results indicated that the development of A. thaliana lateral roots under salt stress was specifically pro鄄
moted by both overexpression of SIP1 gene and NAC1 gene.
Key words: NAC1 gene; SIP1 gene; Antisense鄄expession vector; Double genes鄄expession vector; Arabidopsis thali鄄
ana transformation; Phenotypes
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (4): 403 ~ 408
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11179
*
**
基金项目: The Major Science and Technology Program (110201101003鄄TS鄄03, 2011YN02 和 2011YN03)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: Huxiangyang@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2011-12-28, 2012-04-19 接受发表
作者简介: 梁摇 鹏 (1983-) 男, 在读硕士研究生, 研究方向: 植物分子遗传学。 E鄄mail: liangpanda2009@ 163. com
摇 土壤盐碱化对农作物造成的伤害严重, 导
致作物减产减收, 甚至大量的土地因此而荒废,
这已经成为世界农业生产最主要的环境限制因子
之一。 盐分能影响植物根的生长, Jbir等 (2003)
在研究盐分对植物根生长的影响时发现, 在两种
盐敏感不同的小麦中, 盐分能影响小麦根部分生
组织的大小。 Jem覾a等 (2011) 证明盐胁迫能够
抑制拟南芥侧根的伸展和根系的长度, 而在此过
程中激素 IAA 和 IBA 对其侧根发育起着有利的
作用。 在盐胁迫下, 拟南芥有着自身的耐盐机
制, 其中 SOS2 基因是拟南芥中的重要耐盐基因
之一, SOS2基因的突变极大地降低了植物在高
Na+低 K+胁迫下的忍耐力 (Zhu 等, 1998; Zhu,
2000)。 目前, 在侧根发育中 NAC1 基因被证明
是拟南芥中介导生长素信号促进侧根发生的重要
转录因子, 其表达强度与生长素浓度、 侧根原基
发生强度呈高度正相关 (Xie等, 2000, 2002)。
pFGC5941 (AY310901. 1) 是使用较多的植
物 RNA干扰载体, RNAi可以高效、 特异性地使
目的基因转录后沉默或剔除目标基因的表达, 获
得功能丧失性突变个体用于基因功能研究, 是基
因功能鉴定和分子育种的有效手段 (Travella等,
2006)。 但 pFGC5941 载体只能对一个目的基因
表达进行干扰, 对研究两基因的相互作用对植物
生长发育的影响存在着局限。
本实验室通过酵母双杂交技术筛选到了拟南
芥中与 SOS2 蛋白相互作用的未知功能蛋白基因
SIP1, 并发现 SIP1 基因在外源 IAA 作用下在原
生质体内的瞬时表达加强, 推测 SIP1 与生长素
信号相关 (待发表)。 为了研究 SIP1 基因在拟
南芥盐胁迫中的作用及对侧根发育过程中在生长
素信号途径中与 NAC1 基因的作用, 本课题组将
RNA 干扰载体 pFGC5941 进行改造, 用 NOS鄄
CaMV35S片段取代 PhChsA间隔区, 构建了含有
2 个 35S启动子的可用于双基因表达的表达载体
pFGC5941S。 同时克隆了拟南芥 NAC1 基因和
SIP1 基因, 将 NAC1 正义片段和反义片段分别插
入到 pFGC5941S 第二个 35S 启动子与终止子之
间, SIP1 插入到 pFGC5941S 第一个 35S 启动子
与终止子之间, 形成了 NAC1、 SIP1 双基因过表
达载体和 NAC1 反义、 SIP1 过表达的植物表达载
体, 并进行了遗传转化。 将转基因苗 F2 代纯合
体播种于含有 75 mmol·L-1 NaCl 的 MS 培养基上
培养, 发现 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 转基因
苗在盐平板上生长主根长于野生型, 侧根明显多
于野生型, 抗盐胁迫能力强; 而 pFGC5941S鄄SIP1鄄
NAC1鄄anti苗在盐平板上长势与野生型苗相似。 转
基因植物为进一步研究 SIP1 和 NAC1 两基因功
能及对拟南芥盐胁迫下侧根发育的调控提供了良
好的分子材料。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
哥伦比亚 (Columbia, Col) 野生型拟南芥 (Arabi鄄
dopsis thaliana) 种子, 由美国拟南芥种质资源库提供,
后由本实验室繁衍, 贮存。 大肠杆菌 (Escherichia coli)
菌株 DH5琢和根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens) 菌
株 GV3101、 RNA 干扰载体 pFGC5941 质粒、 PEGAD 载
体质粒均保存于本实验室。 pMD18鄄T 克隆载体为 Takara
(大连) 公司产品, cDNA 合成试剂盒为 Takara (大连)
公司产品。
1. 2摇 拟南芥叶片总 DNA提取及 cDNA的获得
拟南芥叶片总 DNA 的提取采用 CTAB 改良法进行
(Lv 和 Wu, 2005)。 采用 Trizol 法提取拟南芥幼苗总
RNA。 拟南芥 cDNA 合成以拟南芥幼苗总 RNA 为模板,
采用 cDNA合成试剂盒合成 cDNA。
1. 3摇 NOS鄄CaMV35S、 拟南芥 NAC1 基因正义 、 反义片
段及 SIP1 基因片段的克隆
应用引物设计软件 Oligo 6. 0, 基于 GenBank 数据库
报道的 pEGAD载体 (AF218816. 1) 上 NOS鄄CaMV35S序
列及 pFGC5941 质粒中的 PhChsA间隔区两侧的多克隆位
点, 设计引物序列如下: F: 5忆鄄ggcc ATTTAAATTAGATA
ACTGATCTCGAGGAG鄄3忆; R: 5忆鄄 ggcc GGATCCGGATCGA
CCTGCAGGTCTGTC鄄3忆 (下划线分别为 SwaI和 BamHI酶
切位点)。 以 PEGAD质粒 DNA为模板, 进行扩增。 PCR
反应体系为 50 滋L, 反应条件: 94 益预变性 4 min; 94 益
变性 30 s、 54 益退火 30 s、 72 益延伸 1 min, 30 个循环;
72 益 10 min。 经 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物。
PCR产物进行胶回收, 对其回收产物 3忆末端进行加
A反应。 加 A产物与 pMD18鄄T载体连接后用热激法转化
大肠杆菌 DH5琢感受态细胞, 经菌落 PCR和质粒 PCR初
筛, 然后经 SwaI 和 BamHI 双酶切进一步鉴定, 最后得
到的阳性重组子命名为 pMD18鄄T鄄NOS鄄CaMV35S, 送北京
六合华大基因科技股份有限公司进行序列测定。
根据 GenBank中 NAC1 基因 (AT1G56010)、 SIP1 基
因 (AT5G21940) cDNA序列和 pFGC5941S 多克隆位点,
设计 NAC1 正义序列引物 NAC1鄄senseF: 5忆鄄 ggg TCAAGA
404摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
ATGGAGACGGAAGAAGAGATGA鄄3忆和 NACI鄄senseR: 5忆鄄
ggg CCCGGGTCAGCAATTCCAAACAGTGCTT鄄3忆 (下划线
分别为 XbaI 和 SmaI 酶切位点), NAC1 基因反义序列引
物 NAC1鄄antiF: 5忆鄄 ggg CCCGGGATGGAGACGGAAGAGAT
GA鄄3忆和 NACI鄄antiR: 5忆鄄 ggg TCTAGATCAGCAATTCCAAA
CAGTGCTT鄄3忆 (下划线分别为 SmaI 和 XbaI 酶切位点)
SIP1F: 5忆鄄gcg GGCGCGCCATGGAAAATAAGCCAAGTGTTT
鄄3忆和 SIP1R: 5忆鄄 gcg ATTTAAATTCAAAACTTCAATGGTTC
TTCC鄄3忆 (下划线分别为 AscI 和 SwaI 酶切位点), 以拟
南芥 5B总 cDNA为模板, 用于扩增基因序列。 产物回收
经加 A转化、 鉴定后送测序。
1. 4摇 植物表达载体 pFGC5941 的改造
用 SwaI 和 BamHI 对 pMD18鄄T鄄NOS鄄CaMV35S 和 pF鄄
GC5941 质粒分别进行双酶切, 目的片段和载体切胶回
收后, 二者过夜连接, 将切下的 NOS鄄CaMV35S 片段插
入 pFGC5941 的相应位点, 取代了原来的 PhChsA 间隔
区, 连接产物转化大肠杆菌 DH5琢 感受态细胞, 选用
Kan (50 滋g·mL-1) 筛选转化子, 经菌落 PCR和 SwaI和
BamHI双酶切进行检测, 构建成 pFGC5941S改造载体。
1. 5摇 拟南芥 NAC1 基因正义、 反义中间表达载体的构建
用 XbaI和 SmaI对 pMD18鄄T鄄NAC1鄄sense 、 pMD18鄄T鄄
NAC1鄄anti和 pFGC5941S 质粒分别进行双酶切, 将回收
的 NAC1 基因正义、 反义片段分别与 pFGC5941S 过夜连
接、 转化、 酶切鉴定后, 分别构建成 pFGC5941S鄄NAC1鄄
sense和 pFGC5941S鄄NAC1鄄anti中间载体。
1. 6摇 拟南芥 NAC1 正义 、 反义基因和 SIP1 基因共表达
载体的构建
用 AscI 和 SwaI 对 pMD18鄄T鄄SIP1 质粒及中间载体
pFGC5941S鄄NAC1鄄sense 和 pFGC5941S鄄NAC1鄄anti 质粒分
别进行双酶切, 目的片段与载体回收后连接过夜, 将
SIP1 片段分别插入到 pFGC5941S鄄NAC1鄄sense 和 pF鄄
GC5941S鄄NAC1鄄anti第一个 35S 启动子之后, 构建成 pF鄄
GC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti
双基因表达载体。
1. 7摇 表达载体对拟南芥的遗传转化及对阳性转基因苗
的表型观察
利用电转化法将表达载体转入根癌农杆菌 GV3101
感受态细胞中, 然后进行农杆菌的扩大培养, 利用侵染
法转化拟南芥。 将收获种子通过 Basta 除草剂抗性筛选
及抗性苗基因组 DNA 的 PCR 检测鉴定阳性苗。 PCR 引
物设计参照 NAC1、 SIP1 基因内部跨内含子两端部分序
列, 引物的序列为: NAC1鄄sense / anti鄄testF: TTCCTTCTCC
AAGGATCTAT; NAC1鄄sense / anti鄄testR: AAGCAGGGTACGTG
CTCATTG。 SIP1鄄testF: AATAAGCCAAGTGTTT; SIP1鄄testR:
TCAAAACTTCAATGGTTC。 将转基因苗 F2代纯合体播种于
含 75 mmol·L-1 NaCl的MS培养基上培养, 进行表型观察。
2摇 结果
2. 1摇 NOS鄄CaMV35S、 拟南芥 NAC1 基因正义、
反义片段及 SIP1 基因片段的克隆
根据引物的退火温度, 用高保真的 Prime Star
DNA聚合酶成功扩增出 NOS鄄CaMV35S DNA 片段
(图 1: A), NAC1基因正义、 反义片段 (图 1: B,
C), 和 SIP1基因片段 (图 1: D), PCR产物大小
分别为 750 bp、 1 000 bp、 1 000 bp、 780 bp, 与理
论预测的目标 DNA长度相符。 目的片段经 T载体
克隆测序、 序列比对后获得序列正确的目的片段。
2. 2摇 植物表达载体 pFGC5941 的改造
用 BamHI 和 SwaI 双酶切 pMD18鄄T鄄NOS鄄
CaMV35S, 回收 722 bp的片段, 插入到 pFGC5941
上, 替代原来的 1 366 bp PhChsA内含子间隔区。
BamHI和 SwaI双酶切验证结果如图 2A, 酶切产
生了与预期结果一致的 722 bp 条带, 说明 NOS鄄
CaMV35S片段已定向克隆到 pFGC5941 中, 形成
了新的带有两个 CaMV35S 启动子的 pFGC5941S
载体 (图 2: B)。
图 1摇 NOS鄄CaMV35S (A)、 拟南芥 NAC1 基因正义 (B) 、 反义片段 (C) 及 SIP1 基因片段 (D) 的扩增
M: DNA Marker; 1: PCR扩增产物
Fig. 1摇 Amplification of NOS鄄CaMV35S (A)、 NAC1鄄sense (B)、 NAC1鄄anti (C) and SIP1 gene
M: DNA marker DL2000; 1: PCR products
5044 期摇 摇 摇 梁摇 鹏等: pFGC5941 的改造及拟南芥 NAC1 和 SIP1 双基因反义表达载体的构建和遗传转化摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 BamHI和 SwaI双酶切 pFGC5941S (A) 和
pFGC5941S的示意图 (B)
M: DNA marker; 1、 2: 酶切结果
Fig. 2摇 BamHI and SwaI double digestion of pFGC5941S
(A) and chart of pFGC5941S (B)
M: DNA marker; 1、 2: Digestion results
2.3摇 拟南芥NAC1基因正义、 反义中间载体的构建
用 XbaI和 SmaI 双酶切 pMD18鄄T鄄NAC1鄄sense
和 pMD18鄄T鄄NAC1鄄anti, 回收目的条带, 分别与经
XbaI和 SmaI 双酶切的 pFGC5941S 连接, 构建成
pFGC5941S鄄NAC1鄄sense 和 pFGC5941S鄄NAC1鄄anti
中间载体。 质粒 pFGC5941S鄄NAC1鄄sense 经 XbaI
和 SmaI双酶切产生了与预期结果一致的 975 bp
条带 (图 3: A); 而为了更好的验证 NAC1 片段
已经反义插入到 pFGC5941S 中, 我们根据载体
上以及 NAC1 反义片段上所具有的两个 BamHI
位点 (间隔为 392 bp, 图 2: B), 选择 BamHI酶
切验证, 酶切结果产生了与预期结果一致的 392
bp的条带 (图 3: B), 意味着载体构建成功。
图 3摇 pFGC5941S鄄NAC1鄄sense和 pFGC5941S鄄NAC1鄄anti
中间载体构建的酶切鉴定
A: XbaI和 SmaI双酶切 pFGC5941S鄄 NAC1鄄sense;
B: BamHI单酶切 pFGC5941S鄄NAC1鄄anti
M: DNA marker; 1: 酶切结果
Fig. 3摇 Endonuclease digestions in pFGC5941S鄄NAC1鄄sense
and pFGC5941S鄄NAC1鄄anti construction
A: XbaI and SmaI double digestion of pFGC5941S鄄NAC1鄄sense;
B: BamHI digestion of pFGC5941S鄄NAC1鄄anti
M: DNA marker; 1: Digestion results
2. 4摇 拟南芥 NAC1 正义、 反义基因和 SIP1 基因
共表达载体的构建
用 AscI和 SwaI 分别双酶切 pMD18鄄T鄄SIP1 和
中间载体 pFGC5941S鄄NAC1鄄sense 与 pFGC5941S鄄
NAC1鄄anti质粒, 回收目的片段与中间载体连接,
构建成 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense (图 5: A)
和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 双基因表达载体
(图 5: B)。 为了更好的简捷验证 SIP1 基因已准
确地插入到两重组载体中, 我们选择 EcoRV 内
切酶进行单酶切, 在 SIP1 基因 273 bp 处、 NOS鄄
CaMV35S 片段 622 bp 处以及载体 10 289 bp
EcoRV酶切位点, 通过计算, 酶切应产生 7 455
bp、 3 877 bp 和 1 144 bp 3 个片段, 酶切后结果
分别产生了与预期结果一致的 3 条条带 (图 4),
表明载体构建成功。
图 4摇 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense和 pFGC5941S鄄SIP1鄄
NAC1鄄anti双基因表达载体的酶切鉴定
M: DNA marker; 1、 2: EcoRV单酶切 pFGC5941S鄄SIP1鄄
NAC1鄄sense (1) 和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti (2)
Fig. 4摇 Endonuclease digestions in pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense
and pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti construction
M: DNA marker; 1、 2: EcoRV single digestion of
pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense (1) and
pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti (2)
图 5摇 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense (A) 和
pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti (B) 表达载体的示意图
Fig. 5摇 Chart of pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense (A)
and pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti (B)
604摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
2. 5摇 转基因植株的抗性筛选及 PCR鉴定
浸花法将所构建的 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense
和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 表达载体分别转
化 Col野生型拟南芥, 收获 T0 代种子, 在培养
皿中进行 Basta 抗性筛选。 采用 CTAB 法提取抗
性苗基因组 DNA, 分别以检测引物 NAC1鄄sense /
anti鄄test和 SIP1鄄test进行 PCR检测, 虽然野生型
拟南芥中也具有这两个基因, 但由于检测引物是
根据 NAC1、 SIP1 基因内部跨内含子两端序列设
计的, 所以阳性植株会得到两条带 (含基因组
条带和 cDNA条带, 且基因组条带因含有内含子
而大于 cDNA 条带), 而野生型拟南芥只能得到
一条基因组条带。 通过 PCR 检测, SIP1 基因检
测两条带大小为 546 bp 和 281 bp, NAC1 正义、 反
义基因检测两条带大小为 356 bp和 254 bp, 而非
转基因植株中则只扩增到一条带, 表明目的载体已
经成功整合到拟南芥中, 共获得了7株 pFGC5941S鄄
SIP1鄄NAC1鄄sense 转基因苗和 8 株 pFGC5941S鄄
SIP1鄄NAC1鄄anti转基因苗 (图 6: A、 B)。
2. 6摇 盐胁迫下对转基因植株侧根发育的影响
将转基因植株 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense
和 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 的 F2 代纯合体播
种于含有 75 mmol·L-1 NaCl 的 MS 培养基上, 通
过植株表型观察发现 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense
转基因苗在 75 mmol·L-1 NaCl 平板上生长主根长
于野生型, 侧根明显多于野生型, 而 pFGC5941S鄄
SIP1鄄NAC1鄄anti苗在 75 mmol·L-1 NaCl 平板上长
势与野生型苗相似。
图 6摇 拟南芥转基因植株的 PCR检测
A: 转基因植株的 NAC1 基因检测; 1: 阴性对照; 2: 阳性对照; 4 ~ 7: pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 的 NAC1鄄s PCR检测; 8 ~
10: pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 的 NAC1鄄a PCR检测; B: 转基因植株的 SIP1 基因检测; 1: 阴性对照; 2: 阳性对照; 3: 空白
对照; 4 ~ 7: pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 的 SIP1 PCR检测; 8 ~ 12: pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 的 SIP1 PCR检测
Fig. 6摇 PCR checking of transgenic plants
A: PCR checking of NAC1 gene; 1: negative control; 2: positive control; 4-7: PCR checking of NAC1 in pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense;
8-10: PCR checking of NAC1 in pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti B: PCR checking of SIP1 gene; 1: negative control; 2: positive control;
3: blank; 4-7: PCR checking of SIP1 in pFGC5941S鄄 SIP1鄄NAC1鄄sense; 7-10: PCR checking of SIP1 in pFGC5941S鄄 SIP1鄄NAC1鄄anti
图 7摇 拟南芥野生型与转基因植株在含有 75 mmol·L-1 NaCl
的 MS平板上的表型以及侧根数量统计
Fig. 7摇 Phenotypes and statistic chart of lateral roots number
of WT and transgenic plants that were germinated
on MS medium with 75 mmol·L-1 NaCl
3摇 讨论
pFGC5941是使用较多的植物 RNAi 载体, 其
特点是 T鄄DNA 区段较小 (5 151 bp), 几乎不含
重复序列, 使用 BAR 作为标记基因的筛选效率
较高。 但在研究两基因相互作用对植物生长发育
的影响上存在局限。 通过对 pFGC5941 的改造,
构建了含有 2 个 35S启动子的可用于双基因表达
的表达载体 pFGC5941S。 在 pEGAD 载体中恰好
存在着 EGFP基因的 NOS终止子和 Basta 基因的
35S启动子相连接的 NOS鄄35S序列, 可方便的用
于替代 pFGC5941 的 PhChsA 间隔区。 而在 NOS鄄
35S基因序列的两端为多克隆位点, 这样可以用
于两个基因的表达。
反义基因技术是将特定基因的 DNA 片段反
7044 期摇 摇 摇 梁摇 鹏等: pFGC5941 的改造及拟南芥 NAC1 和 SIP1 双基因反义表达载体的构建和遗传转化摇 摇 摇 摇 摇
向连接到启动子上, 然后转化植物, 使植物能产
生与该基因的 mRNA 互补的 RNA 链—反义
RNA, 可使植物中相应的 mRNA 水平大幅降低,
进而同样可以使该基因受到部分抑制或完全抑
制。 生长素在植物体的生长和发育过程中起着至
关重要的作用, 影响着包括不定根在内的整个植
物根系系统的发育。 侧根原基发生和侧根的形成
涉及特异基因的表达, 转录因子基因 NAC1 是少
数几个作用机制比较明确的、 特异性介导侧根发
生过程中生长素信号的基因之一, 其表达强度与
生长素浓度高度正相关, NAC1 转录因子作为依
赖于生长素受体 TIR1 的下游元件, 它可以决定
侧根原基的数目 ( Guo 等, 2005 )。 Jem覾a 等
(2011) 证明盐胁迫能够抑制拟南芥侧根的伸展
和根系的长度, 而在此过程中激素 IAA 和 IBA
对其侧根发育起着有利的作用。 由于 SIP1 基因
能响应生长素信号 (待发表), 那么与 SOS2 互
作的 SIP1 蛋白是否会参与拟南芥盐胁迫的调控
机制, 在盐胁迫抑制拟南芥侧根发育过程中是否
参与生长素对侧根发生的促进作用, 需要进一步
研究。 通过反义基因技术, 本研究在改造后的
pFGC5941S的基础上构建了双基因过表达载体
pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense 和 NAC1 反义、 SIP1
过表达载体 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti, 来研究
盐胁迫下 NAC1、 SIP1 两基因对侧根发育的影
响。 通过遗传转化获得的阳性转基因苗在盐平
板上 (75 mmol·L-1 NaCl) 培养发现, 过表达
NAC1, SIP1 的 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄sense转基
因苗在盐平板上生长侧根数目明显多于野生型拟
南芥, 主根也略长于野生型, 表明两基因的过表
达在盐胁迫下对拟南芥的侧根发生有促进作用,
具有一定的耐盐性; 而抑制表达 NAC1、 过表达
SIP1 的 pFGC5941S鄄SIP1鄄NAC1鄄anti 转基因苗在
盐平板上生长情况与野生型相似。 我们推测
NAC1 基因和 SIP1 基因可能位于同一条信号路径
中, 而且 NAC1 基因应该位于 SIP1 基因的上游,
调控 SIP1 基因的表达, 所以当 NAC1 基因的表
达抑制后, SIP1 基因对侧根发育的影响也随之
消失, 对于二者具体的作用机制还在进一步研究
中。 基于以上结果我们认为 SIP1 基因在盐胁迫
下对拟南芥根的发育起着一定的调控作用。 这些
转基因苗将为进一步研究 SIP1 与 NAC1 在生长
素的信号通路及拟南芥的耐盐机制提供较好的分
子材料。
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