全 文 ：高表达 miR396 小分子导致拟南芥花柱头弯曲 ?
刘冬梅1 ,2 , 杨凤玺1 , 2 , 余迪求1
??
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 , 云南 昆明 650223 ; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049)
摘要 : MicroRNAs (miRNAs) 是大小约 21 个碱基、内源、非编码的小分子 RNA。以拟南芥 ( Arabidopsis thali-
ana) miR396 小分子为研究对象 , 分别克隆到了 miR396 小分子的两个前体 ( MIR396a, MIR396b) , 得到了
转基因植株。通过转基因植株的遗传学研究发现 , 高表达 miR396 小分子导致转基因拟南芥的花柱头弯曲。
花柱头的弯曲影响了角果的正常发育。另外 , Northern杂交结果表明转基因拟南芥花部位的 miR396 及其前
体的表达量与对照相比显著增加。这些结果表明高表达 miR396 小分子可以导致拟南芥花柱头弯曲。
关键词 : 拟南芥 ; miR396; 花柱头 ; 弯曲
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 04 - 353 - 04
Overexpression of miR396 miRNAs Caused Flower
Stigma Curved in Arabidopsis thaliana
LIU Dong-Mei1 , 2 , YANG Feng-Xi1 ,2 , YU Di-Qiu1 * *
( 1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223 , China;
2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China)
Abstract: MicroRNAs (miRNAs) are - 21 nucleotide (nt) , endogenous and encoding RNAs that play important regulatory
roles in growth and development by targetingmRNAs for direct cleavageor translational repression inplants . To analyzethe
biological function of miR396 , we placed two synthetic precursors, MIR396a or MIR396b, under the control of the en-
hanced Cauliflower mosaic virus ( CaMV) 35S promoter in a plant transformation vector ( pOCA30) and transformed the
constructs into Arabidopsis . Genetic analysis showedthat flower stigmas of 35S: MIR396 transgenic Arabidopsiswerecurve
and siliques of miR396 transgenic plants were abnormal . Inaddition, Northern blot analysis showed that themiR396 miR-
NAs and levels of MIR396 precursor transcripts were significantly increased in transgenic miR396 plants compared with
control . These results strongly supported that miR396 played an important role in plant flower development .
Key words: Arabidopsis thaliana; miR396 ; Flower stigma; Curve
MicroRNAs ( miRNAs) 是大小约 21 个碱基、
内源、非编码的小分子 RNA ( Jones-Rhoades and
Bartel , 2004)。MicroRNAs通过碱基互补诱导其靶
mRNA 的剪切或抑制其翻译 (Bartel , 2004)。一些
研究表明 MicroRNAs 可以调控植物的生长发育。
miR159 负调控 MYB转录因子家族 , 其高表达能
导致拟南芥雄性不育以及开花时间延迟 (Achard
等 , 2004) ; miR319 通过剪切负调控 TCP 转录因
子家族 , 其高表达导致拟南芥叶形不规则、叶卷
曲以及晚开花 ( Palatnik 等 , 2003 ) ; miR160 负调
控 ARF10、 ARF16 和 ARF17 , 其高表达导致拟南
芥根冠发育紊乱以及侧根增加 ( Wang等 , 2005) ;
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (4) : 353～356
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09016
?
?? ?通讯作者 : Author for corresponce; E-mail : ydq@ xtbg. ac. cn
收稿日期 : 2009 - 01 - 22 , 2009 - 03 - 31 接受发表
作者简介 : 刘冬梅 (1976 - ) 女 , 在读博士研究生 , 主要研究方向 : 植物分子生物学。 ?
基金项 目 : 国家 自然 科学 基金 ( 90408022 )、云南 省自 然科 学基 金 (2004C0051M ) 和国 家高 科技 研究 发 展计 划 ( 863 计划 )
(2006AA02Z129) 资助项目
miR164 通过剪切负调控 NAC 转录因子家族 , 其
高表达导致拟南芥器官融合以及侧根减少 (Mal-
lory等 , 2004; Guo 等 , 2005) ; miR172 通过翻译抑
制负调控类似 AP2 转录因子 , 其高表达导致拟南
芥早开花 , 花瓣缺失 , 萼片转化为心皮 (Auker-
man and Sakai , 2003; Chen, 2004)。
Jones-Rhoades and Bartel ( 2004) 通过生物信
息学方法从拟南芥和水稻中发现了 92 个 microR-
NA , 其中包括 miR396。他们通过 PCR、Northern
blot及 5′-RACE 等实验方法验证了 miR396 的存
在 , 并在幼苗、莲座叶、花和根中均有表达。同
时预测了 miR396 可能的靶基因为 Growth Regula-
tion Factor ( GRF ) , Rhodenase-like protein 和 Kine-
sin-like protein B, 并通过 5′-RACE 验证了部分
GRF ( GRF1、 GRF2、 GRF3、 GRF7、 GRF8 和
GRF9) 确实是 miR396 的靶基因。
本文以拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) 为实验
材料 , 通过基因克隆的方法高表达 miR396 的两
个前体 , 并结合 Northern杂交和形态学分析等方
法发现高表达 miR396 可导致拟南芥花柱头弯曲。
1 材料与方法
1 .1 实验材料
选用拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) 的生态型 Columbia
为实验材料。种子表面灭菌后均匀散布在 1?2 MS培养基
(含 0 .9% agar) , 4℃春化 2 天 , 转移到 28℃培养箱培养
5～7 天后移栽到土里。
1 .2 质粒构建与农杆菌转化
包含 MIR396a发夹结构的基因组序列 ( 544 bp) 作为
合成前体序列。使用两个引物 ( 5′-TGCTGTAAAAGAAT-
GACCCTT -3′, 5′-AAACTCATAGACAGAAGTTAGGGTT -3′) 进
行 PCR (聚合酶链式反应 ) 获得这个序列 , 然后克隆到
pUCm-T Vector (Sangon)。通过测序证实后再克隆到含 35S
启动子 的 高表 达 载体 ( pOCA30 ) 上 , 标 记 为 35S:
MIR396a。通过相同方法获得 35S: MIR396b。
农杆菌转化按照 Clough and Bent (1998 ) 的花浸染法
操作。
1 .3 Northern杂交
RNA 提取采用 Trizol reagent ( Invitrogen) 法。使用
1 .5% 甲醛-MOPS 琼脂糖凝胶分离 RNA 后 , 转移到尼龙
膜上。杂交温度为 68℃ ; 杂交液选用 PerfectHybTM Plus
buffer (Sigma-Aldrich)。探针通过 klenow fragment ( Takara)
进行32 P-dATP 标记。
关于小分子 RNA 杂交 , 先将 20μg总 RNA 通过 15%
聚丙烯酰胺变性凝胶 (含 7 mol L - 1 尿素 ) 进行分离 , 然
后转移到尼龙膜上。杂交温度为 35℃ ; 杂交液选用 Per-
fectHybTM Plus buffer ( Sigma-Aldrich)。探针选用 Terminal
Deoxynucleotidy Transferase (Takara) 进行32 P-dATP 标记。
2 结果
2 .1 miR396 小分子的基本信息
miR396 小 分 子 是 Jones-Rhoades and Bartel
(2004) 通过生物信息学方法发现的。他们通过
PCR、Northern 杂交及 5′-RACE 等实验方法验证
了 miR396 小分子的存在和表达 , 即 miR396 基因
在拟南芥中有两个位点 , 分别位于 2 号染色体和
5 号染色体上。这两个位点产生的相应的 miR396
小分 子 , 即 miR396a ( At2g10606 ) 和 miR396b
(At5g35407) , 只有一个碱基的差别 ( 图 1 )。采
用 PCR 技术 , 我们从拟南芥基因组 DNA 之中扩
增获得 miR396a和 miR396b前体序列 , 通过生物
信息学分析获得其二级结构见图 1。
通过 EST 序列分析方法发现 miR396 小分子
在 15 个不同的物种中存在 , 是高度保守的小分
子 , 并且其初始转录体和成熟的 miRNA 都是高
图 1 miR396 前体的二级结构
( http:??rna. tbi .univie. ac. at?cgi-bin?RNAfold. cgi )
Fig . 1 Secondary structures of miR396 precursors
453 云 南 植 物 研 究 31 卷
度保守的 , 特别是成熟 miRNA 序列及其互补序
列 (Zhang等 , 2006 )。
2 .2 基因克隆
采用 PCR 技术 , 我们从拟南芥基因组 DNA
之中扩增获得 miR396a和 miR396b前体序列 , 然
后克隆到 pUCm-T Vector ( Fermentas)。经测序证
实是 miR396 的前体序列后克隆到含 35S 启动子
的高表达载体 ( pOCA30 ) 上 , 分别记作 35S:
MIR396a、 35S: MIR396b。
2 .3 miR396 高表达转基因植株的表型
采用基因克隆的方法分别获得了 miR396 两个
前体的拟南芥高表达质粒载体 ( 35S: MIR396a,
35S: MIR396b) 并通过农杆菌介导法转入拟南芥植
株 , 收取成熟种子 , 筛选出转基因幼苗 , 移栽到
相同配方的土壤里 , 并在相同的环境中生长。然
后对其表型进行观察 , 发现转基因植株与野生型
相比 , 花的柱头出现弯曲表型 (图 2) , 柱头弯曲
的花发育成的角果也形态各异、不规则 (图 3)。
2 .4 DmiR396 及其前体在高表达转基因植株中表
达量显著增加
采用凝胶印迹杂交方法检测了 miR396 是否
在转基因植株中被高表达。当 miR396 两个前体
的拟 南 芥 高 表 达 植 株 ( 35S: MIR396a, 35S:
MIR396b) 生长约 40 天时 , 收集花序提取总 RNA ,
分别采用小分子杂交、大分子杂交进行 miR396 及
其前体的检测。结果发现 35S: MIR396a 转基因植
图 2 miR396 高表达转基因植株的花柱头弯曲
Fig . 2 The flower stigma curved in 35S: miR396 Arabidopsis plants
图 3 miR396 高表达转基因植株的角果形态不规则
Fig . 3 Abnormal siliques in 35S: miR396 Arabidopsis plants
株与 Vector 相比 , miR396 及其前体 ( MIR396a)
的表达量不同程度的明显增加 (图 4) , 而且都增
加了 10 倍以上; 35S: MIR396b转基因植株与 Vec-
tor 相比 , miR396 及其前体 ( MIR396b) 的表达量
也增加了 15 倍以上 ( 图 4)。这表明 miR396 表达
量的显著增加导致了 miR396 高表达转基因植株
的花柱头弯曲。
3 小结
miR396 在 15 个不同物种中被发现 , 是高度
保守的小分子 , 并且其初始转录体和 成熟的
miRNA 都是高度保守的 , 特别是成熟 miRNA 序列
及其互补序列 , 这暗示 miR396 可能 在植 物发 育
方面具有重要且保守的功能 (Zhang等 , 2005)。
5534 期 刘冬梅等 : 高表达 miR396 小分子导致拟南芥花柱头弯曲
图 4 miR396 及其前体在 miR396 高表达植株的花中的表达量显著增加
Fig . 4 Expression level of MIR396 ( precursor) and miR396 in transgenic plants
(T1 , 40 days old) . For miRNA gel blots, 20μg of total RNA was used . Three replicated
experiments wereperformed and the results were similar
研究发现 miR396 确实具有多方面且重要的功能 ,
例如 miR396 可以负调控拟南芥类神经酰胺酶基
因的表达 ( Liu 等 , 2009 )。本文论述了 miR396
参与拟南芥花柱头发育这一重要功能。
研究中发现 , 在 miR396 高表达转基因植株
的花器官中 , miR396 及其前体的表达量都显著
增加 , 而 miR396 转基因植株的花柱头出现了弯
曲的表型 , 这说明 miR396 参与了拟南芥花柱头
的正常发育 , 至于参与的方式以及途径有待于进
一步研究。另外 , 我们还发现 miR396 转基因植
株花柱头弯曲的程度还与环境的变化有关系 , 这
也有待于进一步研究。
〔参 考 文 献〕
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