全 文 ：植物交替氧化酶 ( AOX ) 在大肠杆菌中优化表达?
王雅英1 , 3 , Moore A L2 , 杨盛昌3 , 田惠桥3
??
(1 福建省漳州市农业科学研究所 , 福建 漳州 363005; 2 School of Biological Sciences, University of Sussex,
BN1 9QG UK ; 3 厦门大学生命科学院 , 福建 厦门 361005 )
摘要 : 植物交替氧化酶 (Alternative Oxidase, AOX) 位于高等植物线粒体内膜 , 从细胞色素途径的辅酶 Q
分岔 , 催化 4 个电子还原氧分子形成水的另一终端氧化酶。分离纯化有活性的 AOX 比较困难。本文研究
AOX 原核表达 , 选择 pFLAG-1 分泌表达载体 , 用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷 ( IPTG) 诱导 AOX 优化表达 ,
pFLAG-1-AOX 大肠杆菌优化表达条件为 : 宿主 DH5α、温度 37℃、细胞密度 OD600 = 0 .6、 IPTG 浓度 0 .2
mmol?L , 诱导后 60 min收获细胞 ; 获得少量可溶的细胞外周质 AOX 和大量不溶的 AOX , 为深入研究 AOX
打下基础 , 同时为研究膜蛋白原核表达提供依据。
关键词 : 交替氧化酶 (AOX) ; 大肠杆菌 pFLAG-1 表达系统 ; 超量表达
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 01 - 074 - 05
Optimal Expression of Alternative Oxidase in Escherichia coli
WANG Ya-Ying1 , 3 , MOORE A L2 , YANG Shen-Chang3 , TIAN Hui-Qiao3 **
(1 Agricultural Institute, Zhangzhou 363005 , China; 2 School of Biological Sciences, University of Sussex, UK BN1 9QG;
3 School of Life Sciences, University of Xiamen, Xiamen 361005 , China)
Abstract : Alternative oxidase (AOX) , aterminal oxidase located in the inner mitochondrial membrane, has been iden-
tified universally in plant, algae, fungi and protozoan . AOX branches from the cytochrome pathway at the level of the
ubiquinoneandcatalyses theoxidationof ubiquinol and reduction of oxygentowater . Theenzyme remains difficult topurify
to homogeneity in a stable, active form . The paper expressed the AOX with inducer IPTG in pFLAG-1 Escherichia coli
system . pFLAG-1 carry a ompA which secretary the AOX to periplasm . Three strategies have combined to increase the
yield of AOX . First strategy involvedtuningof the inducer concentrationwhile the second involved alter thegrowthtemper-
ature andthe last involved differ thecell concentration . Theoptimized protocol is that the host cell isDH5α, thetempera-
ture is 37℃ , the cell concentration isOD600 = 0 .6 and the IPTG is 0.2 mmol?L . Purification of proteins showed AOX is
expressed in unsoluble protein .
Key words: AOX ; pFLAG-1 Escherichia coli Expression System; Over-expression
植物交替氧化酶 (AOX) 普遍存在植物、真
菌、藻类和部分寄生虫和原核生物。它催化辅酶
Q 氧化、氧分子还原产生水 , AOX 途径没有质子
穿膜运动 , 还原能不是以 ATP 方式贮存 , 能量
通过散热方式释放 (Moore等 , 1978) 。产热植物
佛焰花序中 , AOX 的作用为使花序产热释放出
芳香气味吸引昆 虫传粉。在其 它植物 , 推测
AOX 对植物代谢有调节功能 , 与抗氧化胁迫
( 吴 强 等 , 2003 ) , 抗 水 分 胁 迫 ( 何 军 贤 等 ,
1999) , 抗低温胁迫 ( 晏婴才等 , 2004 ) 及抗病
毒病理有关 (张文利等 , 2003) 。对 AOX 已做了
许多研究 , 但因其从线粒体膜分离后极不稳定 ,
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (1 ) : 74～78
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : hqtian@ jingxian. xmu. edu. cn; Tel : 0592 - 2186486
收稿日期 : 2006 - 09 - 06 , 2006 - 10 - 24 接受发表
作者简介 : 王雅英 (1962 - ) 女 , 博士 , 副研究员 , 从事植物生理与分子生物学研究。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金 (30570104 )
一直未能获得适量有活性的 AOX , 使得蛋白质
晶体结构分析受到限制 , 迄今 AOX 结构仍不明
确 (Affourtit等 , 2002)。大肠杆菌表达外源 AOX
基因 , 主要集中在 AOX 保守氨基酸残基突变基
因和野生型 AOX 基因在大肠杆菌中表达 , 测定
AOX 活性及分子量 , 目的是研究 AOX 分子中氨
基酸残基对酶活性的作用 , 进而推测 AOX 分子
结构 ( Berthold 等 , 2002; Albury 等 , 2002 ) , 酵
母表达系统中 AOX 功能表达使酵母生长速率和
产量降低 ( Affourtit 等 , 1999 ) , 至今尚未建立有
效的 AOX 大量表达系统。
大肠杆菌表达系统是最简单的一种异源蛋白
表达系统 , 它的优点是表达水平高 , 易操作 , 有
许多菌株突变体和含强启动子的载体可供选择。
但是外源蛋白质在大肠杆菌中经常形成包涵体。
AOX 在大肠杆菌 C41 , C42 都是以膜蛋白质或蛋
白质包涵体表达 ( Berthold等 , 2003 ) , 二者都是
不可溶的不具活性蛋白。本文选择分泌表达载体
pFLAG-1 , 其原核信号基因合成的引导肽有牵引
AOX 跨过细胞膜的作用 , 使目的蛋白分泌到外
周质腔成为可溶的 AOX , 理论上可以防止 AOX
包涵体形成。然而外源蛋白质对宿主细胞有毒害
作用 (Sambrook and Russell , 2003 ) , AOX 表达使
宿主细胞生长缓慢甚至死亡 , 影响 AOX 表达的
可控因子包括宿主细胞性质 , 细胞生长温度 ,
IPTG 浓度 , 细胞密度 (OD600 ) , 改变上述因子可
以优 化 AOX 表 达 ( Sigma, 1998 )。本 文 探 索
pFLAG-1 大肠杆菌系统优化表达 AOX , 为深入研
究 AOX 创造条件。
1 材料与方法
1 .1 材料
感受态大肠杆菌试剂盒 (Subcloning Efficiency DH5α,
Chemically Competent E. coli ) 购自 Invitrogen; 融合蛋白表
达载体 pFLAG-1 ; WesternBlotting试剂盒 (Kit ECL for AOX
detection) 购自 SIGMA 公司 ; 标准分子量 ( WM) RAN-
BOW RPN800 购自 Amersham Biosciences; pFLAG-1-AOX ,
AOX 抗体 , 由英国 SUSSEX 大学 Moore教授实验室提供 ;
AOX 克隆自枯苞 ( Sauromattumguttatum)。
1 .2 方法
1 .2 .1 重组质粒转化大肠杆菌 热激方法把重组质粒
pFLAG-1-AOX、非 重 组质 粒 pFLAG-1、抗 氨 苄青 霉 素
(Ampicillin, Amp) 阳性对照质粒 pUC19 和阴性对照 ddH2 O
转化感受态大肠杆菌 , 细胞涂在含有 50μg?ml Amp LB 固
体培养基筛选阳性菌落。在 4 个离心管中各加入 DH5α50
μL , 分别加入 pFLAG-1-AOX、pFLAG-1、pUC19 和 ddH2 O 3
μL , 冰上放置 30 min后 , 37℃热激 20 s, 冰上放置 2 min,
各管加入 90μL 的 LB 培养基 , 每管取 100μl 倒一个 LB 平
板 (Amp50μg . 50 ml - 1 ) , 倒置 37℃过夜培养。
1 .2 .2 AOX 融合蛋白表达 随机挑取 pFLAG-1-AOX 和
pFLAG-1 单克隆 ( 106 - 9 cells) 接种至 5 mL LB 液体培养基
37℃振荡培养 15 h, 然后取 0 .5 mL 菌液接种 50 mL 新鲜
LB培养基中 , 细胞密度培养至 OD600 为 0 .2 时 , 加入
IPTG 至终浓度为 0 .5 mmol?L 诱导 AOX 表达 , 或不加入
IPTG 作为对照。继续培养 60 min、90 min、120 min后取 1
mL 培养液测定细胞细胞密度 OD600 值 , 同时取 1 mL ,
4℃、10 000 r?min离心 1 min, 菌体沉淀物 - 20℃保存。所
有样品在电泳前都加入等量上样缓冲液 2 倍液 , 90℃加
热 5 min, 使蛋白变性 , 10 %的聚丙稀酰胺 SDS-PAGE 分
离 , Western blotting方法分析 AOX (Albury等 , 1996)。
1.2.3 AOX 融合蛋白优化表达 我们设立 3 个细胞浓度
OD600 = 0.2 , 0 .6, 1.0 , 3 个 IPTG浓度 0.05 mmol?L , 0. 2mmol?
L , 0.5 mmol?L , 在 37℃下筛选 AOX优化表达的条件。
1 .2 .4 融合蛋白亚细胞定位 按照蛋白质表达手册方法
提取蛋白质 (Sigma, 1998) , 操作步骤 :
(1) 100 mL 细胞培养液分为 (a)、 ( b) 管 , 10℃条
件下离心 10 min ( 6 000 r?min) ; 取 2 mL 上清液 - 20℃保
存 , Western blot分析胞外 AOX ; (2) 取菌体沉淀物 (a)
0. 4 g置于室温下 , 加入 16 mL 渗透缓冲液 (500 mmol?L Su-
crose, 30 mmol?L Tris-HCl , 1 mmol?L EDTA ) , 终浓度为 : 1 g .
40ml - 1 ; (3) 稀释液在 10℃条件下 , 离心 10 min (5 500 r?
min) ; 弃上清液 ; (4) 在沉淀物中加入 12 mL 预冷到 4℃的
蒸馏水。加水后引起的渗透压变化导致细胞外膜破裂 , 细
胞外周质蛋白释放到溶液中 ; (5) 在 4℃条件下离心 10 min
(5 500 r?min) , 取 2 mL 上清液 - 20℃保存 , 用 Western blot 方
法分析细胞外周质 AOX ; (6) 向沉淀物 (b) 加入 5 mL 提取
缓冲液 A (50 mmol?L Tris-HCl, 5 mmol?L EDTA ; 0 .25 mg?mL
lysozyme; 50 ug?mL sodium azide, pH8) , 置室温下 5 min, 将
细胞溶解 ; (7) 加入提取缓冲液 B 0 .5 mL (1.5 mol?L NaCl ,
0. 1 mol?L CaCl2 , 0.1 mol?L MgCl2 ) , 置室温下 5 min; (8 ) 室
温下离心 30 min (12 000 r?min) , 取 2 mL 上清液 - 20℃保
存 , 用 Western blot方法分析可溶 AOX ; (9) 用 5 mL 提取
缓冲液 A 再悬浮沉淀物 , 取 2 mL 悬浮液 - 20℃保存 , 用
Western blot方法分析不溶的膜 AOX 及 AOX 包涵体。
1 .2 .5 外周质 AOX 融合蛋白质纯化 用 ANTI-FLAG .
M1 亲和凝胶浆 (0 . 2 mL ) 纯化可溶的细胞外周质 AOX
(Sigma, 1998)。操作步骤 :
(1 ) 1 mL TBS缓冲液 (50 mmol?L Tris-HCl , 150 mmol?
L NaCl, pH7 .4) 洗二次亲和层析柱 , 加入 400μL 亲和凝
571 期 王雅英等 : 植物交替氧化酶 (AOX) 在大肠杆菌中优化表达
胶浆 , 凝胶浆中含有与 AOX 融合蛋白特异结合的 FLAG
抗体 ; (2) 1 .0 mL 0 .1 mol?L 甘氨酸 洗 3 次 , 1 .0 mL TBS缓
冲液再洗 3 次 ; (3) 0 .5 mL 细胞外周质蛋白与 0 .5 mL 2×
TBS附加 0 .1 mol?L CaCl2 缓冲液混合 , 加入到亲和层析柱
中过滤 , 循环 3 次。没有与亲和层析柱抗体结合的细胞外
周质蛋白被洗脱 , 而细胞外周质中的 AOX 融合蛋白被特
异结合在层析柱中 ; (4) 用含 0 .2 mmol?L EDTA 的 TBS缓
冲液洗涤 6 次 , 洗脱结合层析柱 AOX 融合蛋白 , 分别收
集洗涤液 ( E1-E6) , - 20℃保存 , Western blot分析 AOX。
1 .2 .6 外周质纯化蛋白质浓缩 (TCA?deoxycholate) 从
层析柱上收集的 AOX 的浓度较低 , Western blot显示的蛋
白质条带较弱。用 TCA 方法可将蛋白质层析液浓缩 20
倍。将 1 mL 的层析液加入 0.2 mL 的 Sodium deoxycholate
和 0 .2 mL 三氯乙酸悬浮后离心 10 min (10 000 r?min) , 将
上清液弃去 , 用 5 % ( w?v) SDS 50 μL 再悬浮沉淀物 ,
Western blot方法分析浓缩后 AOX。
2 结果和讨论
2 .1 细胞转化
大肠杆菌是最常用的蛋白质表达系统之一 ,
因其遗传图谱明确 , 已经高水平地表达了数百种
重组 蛋 白 质。 pFLAG-1 和 携 带 目 的 基 因 的
pFLAG-1-AOX 以及对照 pUC19 转化都筛选到阳
性菌落 , 阴性对照 ddH2 O 没有出现菌落 , 说明
pFLAG-1-AOX、pFLA-1G 和 pUC19 质粒成功转化
大肠杆菌。因为它们均含有标记基因 ( ampr ) ,
在附加50μg?mLAmp的培养基中细胞可正常生
长。tac 为启动子的分泌表达载体 pFLAG-1 ( 图
1) 有一个既有亲水性又有免疫活性的人工 8 肽
片段 (FLAG-1 ) , IPTG 诱导合成 AOX 与 FLAG 组
成的融合蛋白。8 肽的 FLAG 作为分子伴侣 , 与
其特异抗体识别达到纯化 AOX 融合蛋白质的目
的 , 同时小分子量的 FLAG 促进 AOX 融合蛋白
正确折叠。
2 .2 AOX 优化表达
图 1 表达载体 pFLAG
ompA . 细胞内外膜间质表达信号 ; FLAG . FLAG8 肽抗原 ;
ampr . 标记基因 ; lac . 启动子
Fig . 1 Expression vector of pFLAG
ompA : Signal sequencefor secretion of FLAG fusion proteins to perplasmic
space; FLAG: Octapeptice for binding of Anti-FLAG antibodies; ampr :
Ampicillin resistance to host cell ; tac: - 35 region of trp promoter
to end of lacI binding region; lacI : repression of tac promoter .
图 2A Western Blot 分析 AOX 融合蛋白
Fig . 2A The AOX fusion protein showed by Western
Blot with Anti-AOX antibodies
2 , 4 : pFLAG-AOX + IPTG ( AOX fusion protein induced by IPTG) ;
1 , 3 : pFLAG-AOX -IPTG ( no AOX protein induced by without
IPTG; 5 : the AOX isolated fromArum maculatum
mitochondrials; 30 . 35 , 75: RPN800 markers
图 2B 表达 AOX 的大肠杆菌与对照细胞生长速率比较
Fig . 2B Comparing thegrowth rat of the host cells between
AOX expressed and no AOX expressed
pFLAG+ IPTG ( blue) : no AOX gene induced by IPTG to produce
no AOX ; pFLAG-IPTG ( red) : no AOX gene and no IPTG to pro-
duce no AOX ; pFLAG-AOX-IPTG ( green) : AOX gene induced by
no IPTG to produce no AOX ; pFLAG-AOX + IPTG ( yellow) : AOX
gene induced by IPTG to produce AOX .
67 云 南 植 物 研 究 29 卷
以蛋白质手册推荐的条件 : 37℃ , OD600 =
0 .2 , IPTG浓度 0 .5 mmol?L 成功地诱导蛋白质表
达 , Western Blot 结果显示 AOX 为阳性 , 对照组
为阴性 ( 图 2A )。但由于 AOX 对细胞有毒害作
用 , 导致细胞生长缓慢 , 60 min后细胞生长停止
(图 2B) , AOX 对宿主细胞有毒害作用 , 可能是
外源蛋白质在膜上发生堵塞。许多研究表明细胞
生长速率严重影响外源蛋白质的表达 (Sambrook
and Russell , 2003) , 控制诱导前细胞密度 , 细胞
培养温度和诱导后细胞生长时间 , 可以优化外源
蛋白质的表达。
优化表达结果显示 (图 3) , OD600 = 0.6, IPTG
浓度 0.2 mmol?L , 37℃下表达 AOX, 宿主细胞生长
最快、生长持续时间达到 4 h以上 , OD600 值增加
0.2。Western blot结果表明 , 此时 AOX 也获得大量
表达 (图 4)。表达的 AOX 相对分子量为 32 kDa和
70 kDa以上多个蛋白条带 , 低温诱导烟草愈伤组织
表达 AOX 的分子量是 35 kDa和 70 kDa 2 条蛋白质
(晏婴才等 , 2002)。AOX 位于植物线粒体内膜 ,
它有 2 种自然形态 : 氧化态具活性的单体 30～40
kDa和还原态无活性的二聚体 60～70 kDa。
IPTG 浓度 0 .2 mmol?L , 在 3 个不同细胞密度
下 , AOX 产量都比较高 , 而细胞密度 OD600 = 0 .6
时 , 3 个不同 IPTG 浓度均诱导 AOX 高水平表达。
优化条件下诱导后 30 min与 120 min AOX 表达量
没有明显差异 , 延长诱导后细胞培养时间不能获
图 4 37℃ , 0 . 2 mmol?L IPTG, 不同细胞密度 AOX
优化表达 ( Western blot)
Fig . 4 Optimal expression AOX induced by IPTG 0 .2 mmol?L
under 37℃ and different cell density
0: befoure induced by IPTG; 30 , 60 , 120: The time after induced
by IPTG ( min) ; Ar: mitochondria isolated fromArummaculatuml ;
0 . 2 0 .6 1 .0 : OD600 = 0 .2 , 0 .6 , 1 . 0 .
得更多 AOX , 反而浪费时间和能源 , 尤其是细
胞在低温 18℃培养 10 h 引起细胞大量死亡 ( 数
据末提供 ) , 减少 AOX 产量。诱导后 1 h外源蛋白
表达量已经达到最高水平 , 随时间延长 , 表达量没
有太大变化 (牛国栋等 , 2003)。近年来在大肠杆菌
中诱导 AOX 表达的条件大多采用 Berthold等 (2002)
方法 , 即细胞培养温度 18℃ , 细胞密度 OD600 = 0.5、
IPTG浓度 0.1 mmol?L , 诱导后培养 10 h收获细胞。
实验后认为 AOX 优化表达条件为 : IPTG 浓度
0 .2 mmol?L , 诱导细胞浓度 OD600 = 0.6 , 细胞生
长温度 37℃ , 诱导后 60 min收获细胞。
图 3 37℃ , IPTG = 0 .05 , 0 .2 , 0 .5 mmol?L ,
OD = 0 .2 , 0 .6 , 1 .0 的细胞生长曲线
Fig . 3 Growth of bacterial with AOX expression induced under 37℃
and different IPTG concentrationwith different density of cell
图 5 纯化浓缩 20 倍后的外周质 AOX ( Western blot)
Fig . 5 Purified & concentrated AOX from periplasm
1 , 3 , 5 , 7 : the periplasmAOX induced under 37℃ , 30℃ ,
25℃ , 18℃ ; 2 , 4 , 6 , 8 : theunsoluble AOX induced under
37℃ , 30℃ , 25℃ , 18℃ ; 9 : the AOX of mitochondrial
isolated from Arum maculatum .
771 期 王雅英等 : 植物交替氧化酶 (AOX) 在大肠杆菌中优化表达
2 .3 融合蛋白质亚细胞定位
优化表达 AOX 的宿主细胞亚细胞定位表明 ,
细胞外周质腔和细胞外培养基都无 AOX , 菌体
沉淀物有 AOX , 进一步溶解沉淀物蛋白质 , 依
然没有得到可溶的 AOX , 说明大肠杆菌 pFALG-
1-AOX 系统产生的 AOX 是不可溶的。前人研究
AOX 在 大 肠 杆 菌 中 表 达 ( Berthold 等 , 2002 ,
2003) , 也获得不可溶 AOX。37℃大肠杆菌表达
的 TAO 都是包涵体 , 30℃下诱导合成 TAO 有
80%是与膜结合的 TAO。虽然膜 TAO 也不可溶 ,
但溶解膜 TAO 比较容易获得有活性的 TAO (Ni-
hei 等 , 2003) 。蛋白质的过量表达使其容易聚集
形成不溶的包涵体。降低培养温度能抑制蛋白质
包涵体形成 (Sambrook and Russell , 2003 )。我们
降低细胞培养温度至 30℃、25℃、18℃ , 将宿主
细胞外周质 AOX 纯化后浓缩 20 倍 , 获得了着色
较弱的 AOX 条带 , 37℃细胞外周质的 AOX 量最
大 ( 图 5 ) , 说明降低培养温度并没有提高可溶
AOX 产量 , 也不能减少其包涵体的形成。
3 结论
植物抗氰呼吸平衡植物体碳代谢和电子传递。
目前 , 有关植物抗氰呼吸的环境调节以及环境胁
迫条件下植物抗氰呼吸的生理学意义研究已成为
植物呼吸代谢领域的前沿课题。研究 AOX 分子晶
体学结构 , 需要获得适量纯化的活性 AOX。但目
前提取自然状态的 AOX 很困难 , 因为 AOX 具有
酶活性不稳定和膜蛋白质难分离的特性 , 与线粒
体膜分离后很容易失活 , 所以需要建立 AOX 超量
表达系统。大肠杆菌是最常用的融合蛋白质表达
系统之一 , 我们建立大肠杆菌 pFLAG-1-AOX 表达
系统 , 筛选优化表达条件为 : 细胞培养温度 37℃ ,
细胞密度 OD600 = 0.6, IPTG浓度 0.2 mmol?L。虽然
只是获得不溶 AOX , 是膜 AOX 或 AOX 包涵体 ,
进一步溶解膜 AOX , 有望获得具活性的 AOX。
〔参 考 文 献〕
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