全 文 ：一种改良的植物基因组 ＤＮＡ通用提取方法∗
陈林杨１∗∗ꎬ 宋敏舒２∗∗ꎬ 查红光２ꎬ 李志敏１∗∗∗
(１ 云南师范大学生命科学学院ꎬ 云南 昆明　 ６５００９２ꎻ ２ 中国科学院昆明植物研究所
东亚植物多样性与生物地理学重点实验室ꎬ 云南 昆明　 ６５０２０１)
摘要: 高质量的基因组 ＤＮＡ是分子生物学研究的基础ꎬ 而从富含糖类和次生代谢物且异质性强的植物材
料中分离 ＤＮＡ相对困难ꎮ 本方法在 ＣＴＡＢ法和商业 ＤＮＡ提取试剂盒的基础上ꎬ 在裂解细胞之前ꎬ 对植物
材料进行预处理ꎬ 去除干扰 ＤＮＡ提取的代谢物ꎬ 并在后续步骤中进行了一些优化ꎮ 该方法适于多种不同
的植物种类ꎬ 所提取的基因组 ＤＮＡ质量较好ꎬ 能满足下一步基因操作的要求ꎬ 是一种通用的植物基因组
ＤＮＡ提取方法ꎮ
关键词: 植物基因组 ＤＮＡꎻ 通用 ＤＮＡ提取方法ꎻ 植物材料
中图分类号: Ｑ ７８ꎬ Ｑ ９４３􀆰 ２　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１４)０３－３７５－０６
Ａ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ＣＨＥＮ Ｌｉｎ￣Ｙａｎｇ１∗∗ꎬ ＳＯＮＧ Ｍｉｎ￣Ｓｈｕ２∗∗ꎬ ＺＨＡ Ｈｏｎｇ￣Ｇｕａｎｇ２ꎬ ＬＩ Ｚｈｉ￣Ｍｉｎ１∗∗∗
(１ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｇｅｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ Ｅａｓｔ Ａｓｉａꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｏｔａｎｙꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｉｓ ａ ｖｉｔａｌ ｓｔｅｐ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｒｅｓｅａｒｃｈ. Ｂｕｔ ｉｔ
ｉｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ＤＮＡ ｆｒｏｍ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ｗｈｉｃｈ ａｒｅ ｒｉｃｈ ｉｎ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓꎬ ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｓꎬ
ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ. Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｂａｓｅｓ ｏｎ ｃｏｍｍｏｎ ＣＴＡＢ ａｎｄ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ
ｓｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｒｅｍｏｖｉｎｇ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｐｒｉｏｒ ｔｏ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｌｙｓｉｓ. Ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ ＤＮＡ ｗａｓ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ
ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ ｆｒｏｍ ａ ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎｄ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ｗｅ ｄｅｍｏｎｓｔｒａ￣
ｔｅｄ ｔｈａｔ ｉｔ ｉｓ ａ ｃｏｍｍｏｎ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｆｏｒ ｓｏｍｅ ｄｉｆｆｉｃｕｌｔ ｐｌａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ＤＮＡꎻ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｏｍｍｏｎ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌ
　 ＤＮＡ 提取是分子生物学研究的基础技术ꎮ
高质量的 ＤＮＡ是进行后续分子操作ꎬ 如 ＰＣＲ 扩
增、 分子杂交、 限制性酶切、 基因克隆、 遗传多
态性分析等研究的必要条件ꎮ 与动物或微生物材
料相比较ꎬ 植物的总 ＤＮＡ 提取相对困难ꎬ 其原
因是植物有较坚韧的细胞壁ꎬ 且含有较多的多
糖、 脂类、 多酚等次生代谢物ꎬ 这些都有可能会
干扰 ＤＮＡ的提取 (Ａｍａｉｎｉ 等ꎬ ２０１１ꎻ 李金璐等ꎬ
２０１３)ꎮ 不同植物的次生代谢物含量和种类差异
较大ꎬ 同种植物的不同组织和器官的次生代谢物
的含量和种类也不同ꎬ 要从富含多酚和多糖的植
物组织中分离得到高质量的基因组 ＤＮＡ相对困难
(Ｂａｒｚｅｇａｒｉ等ꎬ ２０１０ꎻ Ｓａｈｕ等ꎬ ２０１２ꎻ Ｍｕｈａｍｍａｄ 等ꎬ
２０１３)ꎻ 其次ꎬ 植物基因组 ＤＮＡ 提取的起始材料
经常是干燥的组织甚至是保存多年的标本材料ꎬ
相对于新鲜材料ꎬ 这类材料代谢物浓度更高且有
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１４ꎬ ３６ (３): ３７５~３８０
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３１５６
∗
∗∗
∗∗∗
基金项目: 国家基金委－云南省联合基金重点项目 (Ｕ１Ｂ６６０１)、 国家自然科学基金 (３０３６００４９)、 国家自然科学基金 (３１１７０２１６)、
云南省教学名师工程项目
并列第一作者
通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｌｉｚｈｉｍｉｎ＿ｖｉｐ＠１６３􀆰 ｃｏｍ
收稿日期: ２０１３－０７－２５ꎬ ２０１３－１２－２０接受发表
作者简介: 陈林杨 (１９８４－) 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 主要从事植物分类、 植物微生物与分子系统研究ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｈｅｎｌｉｎｙａｎｇ＠ｍａｉｌ􀆰 ｋｉｂ􀆰 ａｃ􀆰 ｃｎ
所改变ꎬ ＤＮＡ提取更加困难 (Ｓｔａａｔｓ等ꎬ ２０１１)ꎮ
根据所使用组织裂解液的不同ꎬ 植物基因组
ＤＮＡ提取方法主要有 ＣＴＡＢ (Ｈｅｘａｄｅｃｙｌｔｒｉｍｅｔｈｙｌ￣
ａｍｍｏｎｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅꎬ 十六烷基三甲基溴化铵) 法
(Ｍｕｒｒａｙ和 Ｔｈｏｍｐｓｏｎꎬ １９８０)、 ＳＤＳ (Ｓｏｄｉｕｍ ｄｏｄｅ￣
ｃｙｌ ｓｕｌｆａｔｅꎬ 十二烷基硫酸钠) 法 (Ｄｅｌｌａｐｏｒｔａ 等ꎬ
１９８３)ꎮ 这两种方法都是在裂解细胞的基础上ꎬ 利
用多次苯酚氯仿等有机溶剂抽提使蛋白质变性后
沉淀于有机相中ꎬ 且保留含有核酸分子的水相ꎬ
进而达到分离核酸的目的 (孙璐宏等ꎬ ２０１０)ꎮ 对
于多糖、 多酚、 单宁、 脂质等次生代谢产物含量
较高的植物ꎬ 在提取基因组 ＤＮＡ时通常适当添加
一些抗氧化剂保护 ＤＮＡ 免受醌类物质、 二硫化
物、 多酚氧化酶等物质的损害ꎬ 以提高 ＤＮＡ的质
量 (Ｃｌａｒｋｅꎬ ２００９)ꎻ 对于富含蛋白质的物种ꎬ 常
用氯仿－异戊醇反复抽提来减少蛋白质的污染ꎮ 上
述处理都是 ＤＮＡ提取过程中ꎬ 提高其质量的常规
操作ꎮ 但是在某些针叶植物、 多糖或酚类物质含
量较多的物种以及标本材料中ꎬ 利用这些常规操
作也无法获得高质量的 ＤＮＡꎬ 甚至完全无法获得
ＤＮＡ的情况也常常出现ꎮ 由于植物种类繁多ꎬ 影
响 ＤＮＡ质量的物质在不同植物类群中有明显差
别ꎬ 常规去多糖多酚预处理溶液不能广泛适用于
某些难以提取的植物种类ꎬ 如部分杜鹃花科、 瑞
香科、 含树脂较多的裸子植物以及长期存放的干
材料等 (Ｃｓａｉｋｌ 等ꎬ １９９８ꎻ Ｓｐｅｒｉｓｅｎ 等ꎬ ２０００ꎻ Ｖａｒ￣
ｍａ等ꎬ ２００７ꎻ Ｔｅｌｆｅｒ 等ꎬ ２０１３)ꎮ 有些植物材料虽
经常规 ＣＴＡＢ 法可以提出 ＤＮＡꎬ 但含杂质较多ꎬ
且可能抑制 ＰＣＲ反应或影响其他下游实验ꎮ
因此ꎬ 在总结本实验室 ＤＮＡ 提取经验的基
础上ꎬ 以 ７ 种新鲜植物叶片 (其中包括常见的
模式植物和困难植物材料) 和 ２ 种标本叶片为
材料ꎬ 在 ＣＴＡＢ 裂解法和商业 ＤＮＡ 提取试剂盒
的基础上ꎬ 于裂解细胞之前ꎬ 去除可能产生干扰
的代谢物ꎬ 随后按上述方法提取 ＤＮＡ 并进行了
一些优化ꎬ 以此阐述这一方法的改良对提高基因
组 ＤＮＡ质量和纯度的作用ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 实验材料　 本研究中用于总 ＤＮＡ 提取的植物材
料包括三种分子生物学常用的模式植物水稻、 拟南芥及
烟草ꎬ 蕨类植物蜈蚣草ꎬ ＤＮＡ提取难度较大的裸子植物
苏铁、 云南松ꎬ 以及被子植物马缨花、 川滇蔷薇及瑞香
狼毒的叶片为实验材料ꎬ 材料信息及来源见表 １ꎮ 其中
川滇蔷薇和瑞香狼毒材料取自干燥的蜡叶标本ꎮ
表 １　 ＤＮＡ提取用植物材料
Ｔａｂｌｅ１　 Ｐｌａｎｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｆｏｒ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
编号
Ｎｕｍｂｅｒ 种名 Ｓｐｅｃｉｅｓ 科名 Ｆａｍｉｌｙ
１ 蜈蚣草Ｐｔｅｒｉｓ ｖｉｔｔａｔａ Ｌ.
凤尾蕨科
Ｐｔｅｒｉｄａｃｅａｅ
２ 苏铁Ｃｙｃａｓ ｒｅｖｏｌｕｔａ Ｔｈｕｎｂ.
苏铁科
Ｃｙｃａｄａｃｅａｅ
３ 云南松Ｐｉｎｕｓ ｙｕｎｎａｎｅｎｓｉｓ Ｆｒａｎｃｈ.
松科
Ｐｉｎａｃｅａｅ
４ 水稻Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ.
禾本科
Ｐｏａｃｅａｅ
５ 拟南芥Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ (Ｌ.) Ｈｅｙｎｈ
十字花科
Ｂｒａｓｓｉｃａｃｅａｅ
６ 烟草Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ Ｌ.
茄科
Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ
７ 川滇蔷薇Ｒｏｓａ ｓｏｕｌｉｅａｎａ Ｃｒｅｐ.
蔷薇科
Ｒｏｓａｃｅａｅ
８ 马缨花Ｒｈｏｄｏｄｅｎｄｒｏｎ ｄｅｌａｖａｙｉ Ｆｒａｎｃｈ.
杜鹃花科
Ｅｒｉｃａｃｅａｅ
９ 瑞香狼毒Ｓｔｅｌｌｅｒａ ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅ Ｌ.
瑞香科
Ｔｈｙｍｅｌａｅａｃｅａｅ
１􀆰 １􀆰 ２　 试剂　 裂解液: １００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ５ ｍｍｏｌ􀅰
Ｌ－１ ＥＤＴＡꎬ ３５０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１山梨醇ꎬ ７１０ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＣｌꎬ
１％ Ｎａ￣Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅꎬ ＣＴＡＢ １％ꎬ ０􀆰 １ ｍｏｌ Ｎａ２ＳＯ３ꎬ ０􀆰 １％
三 (２￣羧乙基) 膦 盐酸盐 (Ｔｒｉｓ (２￣ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ) ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ
ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅꎬ ＴＣＥＰ)
２ ×ＣＴＡＢ: ２％ ＣＴＡＢ ꎬ ０􀆰 １ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ (ｐＨ８􀆰 ０)ꎬ
１􀆰 ４ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＮａＣｌꎬ ２５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ ＥＤＴＡꎮ
干扰物清除液: １００ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＥＤＴＡꎬ ５％甘油ꎬ １０％ ＰＥＧ８０００ꎬ ０􀆰 １％ 三 (２￣羧乙基)
膦 盐酸盐 (Ｔｒｉｓ (２￣ｃａｒｂｏｘｙｅｔｈｙｌ) ｐｈｏｓｐｈｉｎｅ ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅꎬ
ＴＣＥＰ)ꎮ
ＴＥ０􀆰 １溶液: １ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１ Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌꎬ ０􀆰 １ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ－１
ＥＤＴＡꎬ 灭菌备用ꎮ
７􀆰 ５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１醋酸铵
本实验所用其他化学试剂均为分析纯或以上级别ꎮ
分子生物学试剂购自宝生物工程有限公司 (ＴａＫａＲａꎬ 大
连)ꎬ 引物均由生工生物工程有限公司 (上海) 合成ꎮ
１􀆰 ２　 基因组 ＤＮＡ提取
本方法基于传统 ＣＴＡＢ 方法ꎬ 具体操作步骤如下:
１. 称取新鲜叶片 １００ ｍｇꎬ 干材料 ３０ ｍｇꎬ 装于 ２ ｍＬ冻存
管中置于液氮中冷冻ꎬ 加入 ０􀆰 １ ｇ石英砂和 ５０ ｍｇ水不溶
性 ＰＶＰＰ (Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｐｏｌｙｐｙｒｒｏｌｉｄｏｎｅꎬ 聚乙烯聚吡咯烷酮)
６７３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
磨至粉末状ꎬ 转移至 ２ ｍＬ 离心管中ꎻ ２. 加入干扰物清
除液 １ ０００ μＬꎬ 震荡 １ ｍｉｎꎬ １２ ０００ ｇ离心 １０ ｍｉｎꎬ 弃上清
液ꎻ ３. 重复步骤 (２) 一到两次直至上清液不粘稠ꎻ ４.
加入 ８００ μＬ在 ６５ ℃预热的裂解液和 ４ μＬ ＲＮａｓｅ Ａ (１０
ｍｇ􀅰ｍＬ－１)ꎬ 充分振荡混匀ꎬ ６５ ℃水浴中放置 ６０ ｍｉｎꎬ
每 ２０ ｍｉｎ 振荡 １ 次ꎻ ５. 取出离心管ꎬ １２ ０００ ｇ 离心 １０
ｍｉｎꎬ 取上清ꎻ ６. 加入等体积的氯仿 ∶异戊醇 (２４ ∶１ Ｖ/ Ｖ)
混合液ꎬ 充分混匀ꎬ 室温下 １２ ０００ ｇ离心 ５ ｍｉｎꎬ 取上清
液ꎻ ７. 重复步骤 (６) １ 次ꎻ ８. 加入 １００ μＬ ７􀆰 ５ ｍｏｌ􀅰Ｌ－１
的醋酸铵和等体积预冷 (－２０ ℃) 的异丙醇ꎬ 充分混匀ꎬ
－２０ ℃放置半小时左右ꎮ 于 ４ ℃下 １２ ０００ ｇ 离心 ５ ｍｉｎꎬ
弃上清ꎻ ９. 加入 １ ０００ μＬ ７５％酒精ꎬ 洗涤一次ꎬ １２ ０００ ｇ
离心 １ ｍｉｎꎻ １０. 加入 １ ０００ μＬ ９５％酒精ꎬ 同前洗涤一次ꎻ
１１. 开盖在 ９０ ℃下加热 ２ ｍｉｎ 以去除残留乙醇ꎻ １２. 加
６０ μＬ ＴＥ０􀆰 １溶液溶解 ＤＮＡꎬ －２０ ℃保存ꎮ
用常规 ＣＴＡＢ法 (Ｃｌａｒｋｅꎬ ２００９) 以及 Ｅ. Ｚ. Ｎ. Ａ. Ｐｌａｎｔ
ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ 试剂盒法 (Ｏｍｅｇａ Ｂｉｏ￣ｔｅｋ Ｉｎｃ.ꎬ Ｎｏｒｃｒｏｓｓꎬ
ＵＳＡ) 分别提取上述材料ꎬ 经本方法去除干扰物后再使
用 Ｅ. Ｚ. Ｎ. Ａ. Ｐｌａｎｔ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ试剂盒作为一种改良的
试剂盒法作为本方法的参照ꎬ 具体方法严格按照文献或
试剂盒说明书进行ꎮ 所有方法均于第一步细胞裂解过程
中添加 ＲＮａｓｅＡ去除 ＲＮＡꎮ 每种材料平行提取 ３份ꎮ
１􀆰 ３　 ＤＮＡ质量检测
１􀆰 ３􀆰 １　 琼脂糖凝胶电泳检测　 取 ５ μＬ已溶解的 ＤＮＡ样
品ꎬ 加入 ２ μＬ ６ ×上样缓冲液ꎬ 用 １％的琼脂糖凝胶电
泳进行检测ꎬ 并以 ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒ ( ＴａＫａＲａ) 为参照ꎮ
１１０ Ｖ电泳 ３０ ｍｉｎ后ꎬ 于紫外凝胶成像系统 (Ｔａｎｏｎ ４１００ꎬ
上海天能科技有限公司ꎬ 上海) 下观察并照相ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ２　 紫外分光光度计检测 　 取 ２ μＬ ＤＮＡ 样品ꎬ 用
Ｎａｎｏｄｒｏｐ分光光度计 (ＮＤ￣１０００ꎬ Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ￣
ｉｃꎬ ＵＳＡ) 检测 ＤＮＡ的浓度和纯度 (Ａ２６０ / ２８０值)ꎮ
１􀆰 ３􀆰 ３　 ＰＣＲ扩增　 分别以上述 ４ 种方法所提取的 ＤＮＡ
为模板ꎬ 用通用引物 ｔｒｎＬ￣Ｆ ( Ｔａｂｅｒｌｅｔ 等ꎬ １９９１) 进行
ＰＣＲ扩增ꎬ 以检测所提取 ＤＮＡ 中是否有抑制 ＰＣＲ 成分
存在ꎮ ２０ μＬ 反应体系如下: １０ μＬ ２ｘ ＥｘＴａｑ ｐｒｅｍｉｘ
(ＴａＫａＲａꎬ 大连)ꎬ 正反向引物各 １ μＬ (１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ－１)ꎬ 提
取出的 ＤＮＡ各 １０ ｎｇ作为模板ꎬ 用去离子水补至 ２０ μＬꎮ
扩增于伯乐公司 ＰＴＣ￣２００ 型 ＰＣＲ 仪中进行 ( Ｂｉｏ￣Ｒａｄꎬ
ＵＳＡ)ꎬ 程序为: ９４ ℃预变性 ４ ｍｉｎꎻ ９４ ℃变性 １ ｍｉｎꎬ
５６ ℃退火 １ ｍｉｎꎬ ７２ ℃延伸 １ ｍｉｎꎬ ３３个循环ꎻ ７２ ℃延伸
１０ ｍｉｎꎮ 扩增产物用 １􀆰 ５％琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ 凝胶成
像系统下观察并照相ꎮ
２　 结果
２􀆰 １　 ＤＮＡ电泳检测
由于每个种 ３ 个平行样的 ＤＮＡ 提取结果相
对一致ꎬ 仅随机选取一个进行电泳ꎬ 结果显示于
图 １中ꎮ 如图 １Ｃ所示ꎬ 本方法对所用 ９ 种材料
的 ＤＮＡ都进行了有效的分离ꎬ 体现出了良好地
对不同材料的适应性ꎬ 且未出现明显降解或
ＲＮＡ残留ꎮ 经干扰物清除液清洗材料后的试剂
盒方法同样获得了很好的提取效果ꎬ 说明本方法
中第一步对干扰物的去除对于困难植物的 ＤＮＡ
提取至关重要 (图 １: Ａ)ꎮ 试剂盒法无法提取
川滇蔷薇和瑞香狼毒的 ＤＮＡ (图 １: Ｂ)ꎮ 常规
ＣＴＡＢ 法对于不同植物材料提取效果彼此差异也
比较大ꎬ 无法提取云南松、 川滇蔷薇、 瑞香狼毒
的 ＤＮＡ (图 １: Ｄ)ꎮ 常规 ＣＴＡＢ 法和试剂盒法
对于干标本的 ＤＮＡ 提取效果都比较差ꎮ 本方法
所提取出的川滇蔷薇 ＤＮＡ 浓度虽较低ꎬ 但能够
满足一般下游实验需要ꎮ
图 １　 ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果
Ａ. 经过干扰物去除后试剂盒法ꎻ Ｂ. 常规试剂盒法ꎻ Ｃ. 本方法ꎻ
Ｄ. 常规 ＣＴＡＢ法ꎮ 样品编号及名称同表Ｍ为 ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ
片段大小分别为 ２ ０００ ｂｐꎬ １ ０００ ｂｐꎬ ７５０ ｂｐꎬ ５００ ｂｐꎬ ２５０ ｂｐꎬ
１００ ｂｐ (从上至下)
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
ｏｂｔａｉｎｅｄ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａ. ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｂ. ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｃ. ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｄ. ｒｅｇｕｌａｒ
ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ. Ｍ ｉｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｉｓ ２０００ ｂｐꎬ １０００ ｂｐꎬ ７５０ ｂｐꎬ
５００ ｂｐꎬ ２５０ ｂｐ ａｎｄ １００ ｂｐꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ( ｆｒｏｍ ｔｏｐ ｔｏ ｂｏｔｔｏｍ)
２􀆰 ２　 ＤＮＡ的浓度及纯度测定———紫外分光光度法
如表 ２所示ꎬ 所用各个材料经本方法提取的
ＤＮＡ浓度和纯度均较好ꎬ 且较为均一ꎮ 常规
ＣＴＡＢ法对有些材料虽然提取出的 ＤＮＡ 浓度较
７７３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 陈林杨等: 一种改良的植物基因组 ＤＮＡ通用提取方法　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
高ꎬ 但不同材料提取效果差异较大ꎬ 比如提取出
的瑞香狼毒及川滇蔷薇 ＤＮＡ 成凝胶状ꎬ 无法使
用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ 仪的进行浓度和纯度测定ꎮ Ａ２６０与
Ａ２８０比值是检测 ＤＮＡ 纯度的指标ꎬ 高纯度的
ＤＮＡ样品 Ａ２６０ / ２８０值应在 １􀆰 ８ ~ ２􀆰 ０ 之间ꎬ Ａ２６０ / ２８０
值大于 ２􀆰 ０ 时ꎬ 说明 ＤＮＡ 样品中 ＲＮＡ 含量过
高ꎻ Ａ２６０ / ２８０值小于 １􀆰 ８ 时ꎬ 说明 ＤＮＡ 样品中可
能存在蛋白质污染ꎮ 几种方法中ꎬ 常规 ＣＴＡＢ 法
提取出的 ＤＮＡ 质量最差ꎬ 且变异系数最大ꎮ 经
过干扰物清除液清洗后的试剂盒法整体浓度偏
低ꎬ 所提取的 ＤＮＡ Ａ２６０ / ２８０值均处于 １􀆰 ８ 与 ２􀆰 ０
之间ꎬ 且变异系数最小ꎬ 较为均一ꎮ 对于相对难
提取的材料如马缨花、 川滇蔷薇及瑞香狼毒ꎬ 本
方法所提取的 ＤＮＡ 总体质量较好ꎬ 浓度高ꎬ 重
复性也较好ꎮ
２􀆰 ３　 ＰＣＲ扩增结果
以上述 ４ 种方法所提取的 ＤＮＡ 为模板ꎬ 以
通用引物 ｔｒｎＬ￣Ｆ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ 结果见图 ２ꎮ
结果显示ꎬ 以干扰物清除液清洗后的方法所提取
的 ＤＮＡ为模板进行 ＰＣＲ扩增ꎬ 成功率高 (图 ２:
Ａꎬ Ｃ)ꎬ 可以获得条带单一的扩增条带ꎻ 而用传
统方法提取的 ＤＮＡ 作为模板时ꎬ 对于某些物种
(图 ２: Ｄ中的 １号、 ３号、 ７号及 ９号) 无法获
图 ２　 不同方法提取的 ＤＮＡ ＰＣＲ扩增效果比较
Ａ. 改良试剂盒法ꎻ Ｂ. 试剂盒法ꎻ Ｃ. 本方法ꎻ Ｄ. 常规 ＣＴＡＢ法ꎮ
Ｍ为 ＤＬ２０００ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ 片段大小分别为 ２ ０００ ｂｐꎬ １ ０００ ｂｐꎬ
７５０ ｂｐꎬ ５００ ｂｐꎬ ２５０ ｂｐꎬ １００ ｂｐ (从上至下)ꎬ 图中编号 １~７
所代表的物种与表 １中的所示相同
Ｆｉｇ􀆰 ２　 ＰＣＲ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓａｍｐｌｅｓ
ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ
Ａ. ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｂ. Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｃ. ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄꎻ Ｄ. ｒｅｇｕｌａｒ
ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ. Ｍ ｉｓ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ ｔｈｅ ｓｉｚｅ ｉｓ ２ ０００ ｂｐꎬ １ ０００ ｂｐꎬ ７５０ ｂｐꎬ
５００ ｂｐꎬ ２５０ ｂｐ ａｎｄ １００ ｂｐꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ( ｆｒｏｍ ｔｏｐ ｔｏ ｂｏｔｔｏｍ).
Ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒ １－７ ａｒｅ ｓａｍｅ ａｓ Ｔａｂｌｅ１
表 ２　 不同方法提取 ＤＮＡ浓度及纯度比较
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ＤＮＡ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ
编号　
Ｎｕｍｂｅｒ　
本方法
Ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
/ ｎｇ􀅰ｕｌ－１
Ａ２６０ / ２８０
ＣＴＡＢ法
ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
/ ｎｇ􀅰ｕｌ－１
Ａ２６０ / ２８０
试剂盒法
Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
/ ｎｇ􀅰ｕｌ－１
Ａ２６０ / ２８０
改良后试剂盒法
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｋｉｔ ｍｅｔｈｏｄ
浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
/ ｎｇ􀅰ｕｌ－１
Ａ２６０ / ２８０
１ ２０６􀆰 ７ １􀆰 ９５ ７２１􀆰 ８ １􀆰 ９８ ８９􀆰 ５ １􀆰 ９３ ５３􀆰 ６ １􀆰 ９５
２ １１１９􀆰 １　 ２􀆰 ０　 ２７６２􀆰 ２　 １􀆰 ９３ １２９􀆰 ８ １􀆰 ９２ ２３４􀆰 ４ １􀆰 ９０
３ ５９４􀆰 ７ １􀆰 ９２ ９７􀆰 １ １􀆰 ７９ １２５􀆰 ７ １􀆰 ７９ ２９６􀆰 ８ １􀆰 ９１
４ ５６９􀆰 ４ １􀆰 ８７ ２０４７􀆰 ３　 ２􀆰 ０８ １５５􀆰 ７ １􀆰 ８１ １３３􀆰 ６ １􀆰 ９０
５ １１３　 １􀆰 ８　 ６７􀆰 ９ １􀆰 ９２ ２９􀆰 ６ １􀆰 ８５ ６０􀆰 ８ １􀆰 ９３
６ １２１１􀆰 １　 １􀆰 ８９ ９３６􀆰 ８ １􀆰 ５３ １５８􀆰 ８ １􀆰 ８６ ４１１􀆰 ３ １􀆰 ８８
７ ２６７􀆰 ９ １􀆰 ８５ ＮＡ ＮＡ ＮＡ ＮＡ ９１􀆰 ７ １􀆰 ８７
８ １９８􀆰 ６ １􀆰 ９４ ９９􀆰 ７ １􀆰 ７３ ５８􀆰 ２ １􀆰 ３６ ４８􀆰 ３ １􀆰 ７９
９ ４２２􀆰 ８ １􀆰 ７５ ＮＡ ＮＡ ５９􀆰 ９ １􀆰 ５６ ２７８􀆰 ０ １􀆰 ９０
Ｍｅａｎ ５２２􀆰 ６ １􀆰 ８９ ８４１􀆰 ６ １􀆰 ６２ ８９􀆰 ７ １􀆰 ５６ １７８􀆰 ７ １􀆰 ８９
ＳＤ ４００􀆰 ７２ ０􀆰 ０８ １０４０􀆰 ４３　 ０􀆰 ６８ ５６􀆰 ５４ ０􀆰 ６２ １３０􀆰 ９４ ０􀆰 ０５
ＣＶ 　 ０􀆰 ７７ ０􀆰 ０４ 　 １􀆰 ２４ ０􀆰 ４２ ０􀆰 ６３ ０􀆰 ３９ ０􀆰 ７３ ０􀆰 ０２
ＳＤ: 标准差ꎬ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｄｅｖｉａｔｉｏｎꎻ ＣＶ: 变异系数ꎬ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｏｆ Ｖａｒｉａｔｉｏｎꎻ ＮＡ: 无法检测获得ꎬ Ｎｏｔ Ａｖａｉｌａｂｌｅ
表中浓度及纯度值均为三个重复样品的平均值
Ａｌｌ ＤＮＡ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｄａｔａ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｔｈｅ ａｖｅｒａｇｅ ｖａｌｕｅ ｆｒｏｍ ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ
８７３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
得目的条带ꎬ 但是经过干扰物清除液清洗后成功
获得了单一的条带 (图 ２: Ｃ)ꎮ 经过干扰物清除
液清洗后ꎬ 再用 ＣＴＡＢ 法或者试剂盒继续提取
ＤＮＡ后进行目的基因的 ＰＣＲ扩增都能获得单一条
带 (图 ２: Ａꎬ Ｃ)ꎮ 由此说明ꎬ 本方法能够有效
减少所提取 ＤＮＡ中残留的 ＰＣＲ反应抑制成分ꎮ
２􀆰 ４　 干扰物清除液对所提取 ＤＮＡ中杂质的清除
在 ＤＮＡ提取过程中ꎬ 富含酚类等次生代谢
物植物材料ꎬ 其 ＤＮＡ 被乙醇沉淀后可能被酚类
氧化成棕褐色 (Ｍａｌｔａｓ 等ꎬ ２０１１)ꎮ 本研究中ꎬ
瑞香狼毒即是如此ꎮ 而经过本方法去除干扰杂质
后ꎬ 瑞香狼毒 ＤＮＡ 溶液呈无色透明ꎬ 由此显示
其中杂质被较彻底地去除ꎮ 用干扰物清除液洗涤
材料后能有效去除此类次生代谢物ꎬ 提取的 ＤＮＡ
近无色 (图 ３)ꎮ
３　 讨论
本方法基于传统 ＣＴＡＢ 法和 Ｋｏｂａｙａｓｈｉ 等
(１９９８) 对于木本植物 ＤＮＡ 的提取方法ꎬ 但作
了一定的改进ꎬ 如: １. 于组织裂解水浴加热期
间添加 ＲＮａｓｅ Ａꎬ 有效去除了其中的 ＲＮＡꎬ 而且
所添加的 ＲＮａｓｅ Ａ会随后续纯化过程一并去除ꎮ
简化了步骤ꎬ 同时减少了 ＤＮＡ 损失ꎻ ２. 本方法
将原始文献中干扰物清除液中的 β￣巯基乙醇替
换成 ＴＣＥＰꎮ 该试剂还原力强ꎬ 不仅没有刺激性
气味ꎬ 并且能在室温下保存ꎮ 目前逐渐在生物学
实验中替代 β￣巯基乙醇和二硫苏糖醇使用ꎮ 同
时采用更易获得的甘油代替原配方中的山梨醇ꎬ
效果相同 (未发表数据)ꎮ 鉴于已有文献报道尤
其是对于时间较长且已发生 ＤＮＡ降解的材料ꎬ 亚
硫酸钠可以有效改善所提取 ＤＮＡ的完整性ꎮ 本实
验室一般会在对此类材料 ＤＮＡ 提取的干扰物清
除液中添加原配方中没有的亚硫酸钠 ( Ｂｙｒｎｅ
等ꎬ ２００１ꎻ Ｂａｒａｎｗａｌ等ꎬ ２００３)ꎮ 但其对植物材料
的实际效果需要进行严格的比对实验证明ꎮ 本实
验室尚未发现亚硫酸钠对于常规新鲜植物材料
ＤＮＡ提取有任何不良效果ꎬ 因此在本文干扰物
清除液配方中未明确列出 (未发表数据)ꎮ 本方
法还提高了去除干扰物缓冲液原配方中 Ｔｒｉｓ￣ＨＣｌ
的浓度ꎬ 以适于更广泛的植物材料ꎮ
　 　 从文中可以看出ꎬ 本方法中的干扰物清除尤
为重要ꎬ 是本方法具有广泛适用性的关键ꎬ 可以
在提取起始时去除干扰物ꎬ 却不会造成 ＤＮＡ 产
率的显著下降ꎮ 当然对于拟南芥之类较易提取的
材料ꎬ 无需这一过程ꎮ 本方法较为灵活ꎬ 同时适
用于新鲜材料、 冷冻材料或长期保存的干标本材
料ꎮ 本方法可以不使用试剂盒进行ꎬ 所有试剂都
可以很容易地获得ꎬ 配制过程简单ꎬ 较为经济ꎬ
仅需一台常规台式离心机即可ꎮ 而对于下游实验
要求起始 ＤＮＡ 质量较高时ꎬ 我们推荐本方法结
合 ＤＮＡ吸附柱或试剂盒使用ꎬ 如本文中的改良
试剂盒法ꎮ 这也是本实验室更多使用的方法ꎮ 不
图 ３　 不同提取法下瑞香狼毒和烟草的 ＤＮＡ色泽比较ꎮ Ａ. 瑞香狼毒ꎻ Ｂ. 烟草ꎮ １. 常规 ＣＴＡＢ法ꎻ ２. 本方法
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｔｈｅ ｐｈｏｔｏｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ＤＮＡ ｂｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ. Ａ: Ｓ􀆰 ｃｈａｍａｅｊａｓｍｅꎻ Ｂ. Ｎ􀆰 ｔｏｂａｃｕｍ. １. ｒｅｇｕｌａｒ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄꎻ ２. ｔｈｉｓ ｍｅｔｈｏｄ
９７３３期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 陈林杨等: 一种改良的植物基因组 ＤＮＡ通用提取方法　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
同植物类群中次生代谢物的组成不同是造成其
ＤＮＡ提取差异的重要原因 (Ｖａｒｍａ 等ꎬ ２００７)ꎮ
而一般认为ꎬ 同一类群的植物其次生代谢物组成
有一定共性 (Ｈｅｇｎａｕｅｒꎬ １９８６)ꎮ 在本方法中ꎬ 我
们选择了包括蕨类植物、 裸子植物、 双子叶植
物、 单子叶植物的共计 ９种植物ꎬ 分属于 ９个不
同的科ꎮ 尤其包含了本实验室在实际研究中遇到
的提取较为困难的植物种类ꎬ 如杜鹃花科的马缨
花、 蔷薇科的川滇蔷薇和瑞香科的狼毒ꎮ 对这些
系统位置差异较大的植物材料ꎬ 本方法均可以有
效提取 ＤＮＡ并用于下游研究ꎬ 因此有一定的通
用性ꎮ 而在实际工作中ꎬ 该方法作为本实验室针
对困难植物材料 ＤＮＡ提取的标准方法ꎬ 已被用于
数十种不同科属植物的 ＤＮＡ的提取ꎬ 并为周边实
验室所采用ꎮ 限于文章篇幅ꎬ 不一一敷述ꎮ
综上所述ꎬ 我们认为本方法是一种通用的植
物 ＤＮＡ提取方法ꎬ 尤其适于困难植物材料、 干
标本材料等ꎬ 值得推广使用ꎮ
致谢　 云南省农科院蹇红英博士提供川滇蔷薇ꎬ 云南师
范大学的张永洪老师提供瑞香狼毒材料ꎬ 中科院昆明植
物研究所胡向阳老师提供拟南芥材料ꎬ 昆明植物园提供
马缨花材料ꎮ
〔参　 考　 文　 献〕
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Ｐｌａｔｆｏｒｍ [Ｊ] . Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ ４３: ３
Ｖａｒｍａ Ａꎬ Ｐａｄｈ Ｈꎬ Ｓｈｒｉｖａｓｔａｖａ Ｎꎬ ２００７. Ｐｌａｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｉｓｏｌａ￣
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０８３　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷