全 文 ：高表达水稻 WRKY72 基因影响拟南芥生长素信号传导 ?
宋 钰1 ,2 , 刘冬梅1 , 2 , 余迪求1
??
(1 中国科学院西双版纳热带植物园植物分子实验室 , 云南 昆明 650223;
2 中国科学院研究生院 , 北京 100049 )
摘要 : 植物转录调控因子 WRKY基因家族是一个拥有众多成员的超家族 , 功能涵盖了植物生长发育的控制
与抗病耐逆的调节。我们主要分析了 OsWRKY72 基因在外源植物拟南芥中的生物学功能。通过转基因拟南
芥 ( Arabidopsis thaliana) 的遗传学研究发现外源高表达该基因不单明显地抑制转基因植株的顶端优势 , 增
强植株侧枝的生长 , 还改变了转基因植株叶片和角果的发育。进一步分析证实 , 高表达 OsWRKY72 基因所
导致转基因拟南芥植株的表型和其它生理现象都与生长素信号通路改变所导致的表型和生理变化极其相近。
这些结果说明 OsWRKY72 基因在外源植物拟南芥体内高表达后很可能改变了其正常的生长素信号通路。
关键词 : OsWRKY72; 顶端优势 ; 生长素
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 06 - 699 - 07
Overexpression of OsWRKY72 Gene Causes Auxin
Signaling Passway in Arabidopsis
SONG Yu
1 , 2
, LIU Dong-Mei
1 , 2
, YU Di-Qiu
1 * *
(1 Laboratory of Plant Molecular Biology, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences,
Kunming 650223 , China; 2 Graduate University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 )
Abstract: The transcription factors WRKY protein superfamily arewidely presented in plants . It iswell known that ama-
jority of the plant biological processes are modulated by WRKY transcription factors . And here wefocused on OsWRKY72 .
Genetic analysis showed the apical dominance of 35S: OsWRKY72 transgenic Arabidopsis thaliana was repressed and the
transgenic plants had significantly more shoot branches comparingwith thecontrol plants . Besides the reducedapical domi-
nance, thephenotypes, includingcurled leaves and short fruits in transgenicArabidopsis, weresimilar to those of thechar-
acteristic mutants deficiency in auxin singal transduction . These resultssuggested that OsWRKY72 played an important role
in the auxin signaling pathway .
Key words: OsWRKY72 ; Apical dominance; Auxin
转录调控因子是一类通过调控下游靶基因的
表达进而控制细胞代谢过程的一类蛋白质 , 在植
物生长发育和耐逆抗病过程中发挥极其重要的调
节和控制作用 (余迪求等 , 2006)。根据转录调控
蛋白的结构特点可以将其分为若干个家族 , 其中
WRKY 转录调控因子家族是一个多成员的大家族 ,
拟南芥拥有 72 个成员 , 粳稻日本晴拥有 98 个成
员 , 中国籼稻 93 - 11 拥有 102 个成员 (Qiu 等 ,
2004; Ross等 , 2007)。WRKY 转录调控因子以其典
型的保守结构域 WRKYGQK 高亲和性地结合 DNA
的 W盒 (C?TTGACT?C) 而自成一个家族 (Eulgem
等 , 2000)。同时 WRKY 转录调控因子氨基酸序列
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (6) : 699～705
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.08043
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ydq@ xtbg. ac. cn
收稿日期 : 2008 - 03 - 21 , 2008 - 05 - 10 接受发表
作者简介 : 宋钰 ( 1982 - ) 男 , 在读硕士研究生 , 主要研究方向 : 植物基因功能分析。 ?
基金项目 : 云南省基金项目 ( 2003C0342M) 、国家自然科学基金 (3037803 ) 和中国科学院“百人计划” 择优资助项目
上毗邻 WRKY 域的还有一个 C2 -H2 的锌指结构 ,
这一结构特点类似乙烯应答因子 ( ERF ) 家族
(Gutterson等 , 2004)。与大多数 WRKY 蛋白不同 ,
拟南芥 WRKY 家族中的 AtWRKY50 , AtWRKY51 和
AtWRKY59 的 WRKY 结构域序列为 WRKYGKK , 而
水稻 WRKY 家族的一些成员中则出现新的 WRKY
结构域序列 WRKYGEK (Qiu等 , 2004 )。
得益于水稻全基因组测序工作 , 水稻 WRKY
基因家族成员的功能研究近年来取得了很大的进
展。自 2000 年克隆到第一个水稻 WRKY 基因 Os-
WRKY4 后 (Kim等 , 2000) , 已经发现近 20 个水
稻 WRKY 基因受真菌性的稻瘟病诱导 , 超过 10
个水稻 WRKY 基因受细菌性的白叶枯病诱导
( Ryu等 , 2006)。近年来又在水杨酸依赖的抗病
信号途径中发现 OsWRKY12 和 OsWRKY71 处于
OsNH1 的 上 游 ( Liu 等 , 2005 , 2007 ) , 而 Os-
WRKY45 独立于 OsNH1 信号通路 ( Shimono 等 ,
2007)。此外 , 由我们实验室承担的水稻胁迫条
件下相关 WRKY 转录调控因子基因的筛选工作
预示一些水稻 WRKY 基因家族成员可能参与了
水稻对环境胁迫因子的响应 (Qiu等 , 2004)。而
新近发表的过表达 OsWRKY100 基因增强水稻对
紫外辐射耐性的结果 ( Wang等 , 2007) 和正在发
表的转基因 OsWRKY45 增强拟南芥耐旱性的结果
(Qiu等 , 2008) 都从遗传学的角度证实了先前我
们利用分子生物学手段对水稻 WRKY 转录因子
参与植物耐逆性的预测。
WRKY 转录调控因子除了在植物抗病耐逆过
程中发挥重要的生物学作用外 , 还参与了植物发
育过程的调控。如 AtWRKY44 (TTG2 ) 不单可以
控制拟南芥表皮毛和种皮的发育 ( Johnson 等 ,
2002) , 还可以影响拟南芥表皮的分化和根毛的
形成 ( Ishida 等 , 2007 ) ; 而 AtWRKY10 (MINI3 )
则可以和其他基因一起控制拟南芥种子的发育
(Luo 等 , 2005 ) ; 由美 国内华达大学 Qingxi J .
Shen教授领导的小组发现在α淀粉酶基因表达的
过程中 , OsWRKY51 和 OsWRKY71 的表达受 ABA
抑制、GA 诱导 (Xie等 , 2005 , 2006) , 而它们的
表达情况则会决定种子的发育和萌发 ( Ross等 ,
2007)。最新的结果显示一些 WRKY 基因在水稻
中的表达是有组织特异性的 , 预示它们在水稻发
育过程中生物学功能的多样性 ( Ramamoorthy等 ,
2008) , 而中国农业大学的郭泽建教授领导的小
组也确实发现了 OsWRKY55 的过表达影响了水稻
不定 根 的发 育 和 转 基因 水 稻 的生 长 素 反 应
(Zhang等 , 2008 )。
基于以上 WRKY 转录调控因子的重要作用 ,
我们利用分子生物学和反向遗传学的方法对 Os-
WRKY72 ( DAA50784 ) ( Xie 等 , 2005; Kato 等 ,
2007) 基因的异源高表达拟南芥进行了分析。已
有 的 研 究 发 现 OsWRKY72、 CjWRKY01 和 At-
WRKY75 三者间存 在较高的 同源性 ( Kato 等 ,
2007) , 而在水稻糊粉层细胞内的 OsWRKY72 受
ABA 诱导但不受 GA3 诱导 (Xie等 , 2005 )。我们
的结果显示 OsWRKY72 基因在水稻幼叶中的表达
量较高。 OsWRKY72 连接 35S 强启动子异源转化
拟南芥发现随着其表达量的增强 , 转基因植株出
现明显的顶端优势减弱而产生了较多的分支 , 此
形态特征与空载体转基因植株相比差异明显。另
外 , 转基因拟南芥还出现成苗叶形变小且卷曲 ,
角果缩短并伴随部分败育等生理现象。进一步的
分析发现 OsWRKY72 的高表达抑制了拟南芥生长
素相 关 基 因 AXR1 的 表 达。这 些都 预 示 Os-
WRKY72 在植物形态建成过程中影响了其生长素
信号通路。
1 材料和方法
1 .1 植物材料
columbia生态型的野生和转基因拟南芥 ( Arabidopsis
thaliana) 及烟草 ( Nicotiana tobacumCV . Xanthi NC) 由本
实验室长期种植。拟南芥种子表面灭菌后均匀散布在
1?2 MS 培养基 (含 0 .9% agar) , 4℃春化 3 天后转移到
24℃培养箱培养 5～ 7 天移栽到土里。培养条件为 22～
24℃ , 14 h光照?10 h黑暗 , 湿度 40%。 japonica栽培种水
稻 ( Oryza sativa) 由云南农业大学李成云教授赠予 , 和
烟草一同在 28℃左右的温室生长。用于表达谱分析的水
稻幼叶为萌发 4 周后收割所得 , 其他部位均为水稻扬花
时取材。野生型和转基因拟南芥生长 5 周后经 100μmol?L
NAA 处理于相应时间点取材。
1 .2 核酸的提取及 OsWRKY72 cDNA 的克隆
japonica生态型水稻 4 周幼苗和转基因拟南芥 3 周苗
的总 RNA 提取方法依照 Logemann等 ( 1987) 的报道。根
据 NCBI 公布的序列设计用于 OsWRKY72 cDNA 克隆的引
物分别为 A : 5′cgcttcgaattctcaatctctct3′, B : 3′gttacggttacggt-
gtgacatgt5′; 用于 OsWRKY72 反转录 PCR (21 个循环 ) 的
007 云 南 植 物 研 究 30 卷
引物 为 A : 5′cgcttcgaattctcaatctctct3′, B : 3′ttctcggtcgact-
tcttcca5′; 用于 AtAXR1 反转录 PCR (26 个循环) 的引物为
A : 5′ggtgcaatgggattttatattctt3′, B : 3′ttactgtcaagtcgactctggt5′;
用于 AtActin2 反转录 PCR ( 24 个循环) 的引物为 A : 5′at-
tcagatgcccagaagtcttgt3′, B : 3′ccttagcaagtgtcttttacaaag5′。首先
将 RNA 用 DNAse处理 , 再使用 2×10 - 7 g RNA 样品和 2×
10 - 8g引物 B 进行反转录 , 反转录产物取 1?10 体积进行
PCR。PCR 产物 DNA 电泳后片段胶回收。以上所用试剂
均由 Fermentas公司生产。
1 .3 质粒构建与农杆菌转化
将上步克隆到的 OsWRKY72 cDNA 连接至 pUCm-T
Vector (Fermentas) 后测序。通过测序证实后再克隆到含
35S启动子的高表达载体 ( pocA28) (Du and Chen, 2000)
上 , 记作 35S: : OsWRKY72。另外我们将空载体转入拟
南芥获得转基因植株作为对照 , 记作 CK。农杆菌转化拟
南芥按照 Clough and Bent (1998) 的花浸染法操作 , 转化
烟草按照 Horsch (1985) 的圆叶切片法操作。
1 .4 Northern杂交
使用 1 .5% 甲醛-MOPS 琼脂糖凝胶分离总 RNA 后 ,
转移到尼龙膜上。杂交温度为 68℃ ; 杂交液选用 Perfect
HybTM Plus buffer ( Sigma-Aldrich) ; 使用 OsWRKY72cDNA
全长做探针 ; 探针通过 klenow fragment (Takara) 进行 32 P-
dATP 标记。洗膜 : 2×SSC?0.5 %SDS, 每次 10 min, 1 次 ;
0 . 5×SSC?0 .1%SDS, 2 次 , 每次 20 min; 0. 1×SSC?0 .1%
SDS, 每次 20 min, 1 次。最后压片放射自显影。
2 结果与分析
2 .1 OsWRKY72 基因的组织表达
利用 Northern 杂交技术 , 我们对 OsWRKY72
基因在水稻各部位的表达情况进行了分析。用
OsWRKY72 全长 cDNA 作探针杂交后放射自显影 ,
结果显示 OsWRKY72 在叶片和花序中均有表达 ,
在幼叶中的表达量明显高于成熟叶、旗叶和老叶
(图 1) 。Ramamoorthy (2008 ) 等新近的表达谱分
析在证实上述结果可靠性的同时补充了该基因在
幼苗根部表达较强而在成苗根部几乎不表达的结
果。这些都说明 OsWRKY72 具有部位表达的特异
性 , 在生长旺盛的部位表达较强。
2 .2 转基因拟南芥筛选
为了深入探讨 OsWRKY72 基因的生物学功
能 , 我们将 OsWRKY72 基因转化拟南芥。通过筛
选 , T1 代得到 19 株转基因植物 , 其中 4 株未能
得到种子。T2 代中 # 19 表型与其他 14 株转基因
植物明显不同 , 经检测不表达 OsWRKY72。在剩
余 14 株转基因植株中 , 我们分别选取了一株中
等表达水平和一株高表达水平的转基因植株用于
观察实验和数据采集 , 并以转空载体的转基因植
株为对照 , 其它转基因植株主要用于定性观察。
如图 2 所示 , 株系 15 号为中等表达水平的转基
因植株 , 株系 17 号为高表达水平的转基因植株。
2 .3 E高表达 OsWRKY72 基因的转基因植物叶片
向下卷曲
在转基因拟南芥的生长过程中 , 我们发现高
表达 OsWRKY72 基因的转基因植物莲座叶和茎生
叶明显比转空载体的转基因植株小且幼嫩 , 部分
叶片叶尖明显下卷 ( 图 3: A )。通过激光共聚焦
扫描显示 : 与转空载体的转基因植株相比 , 高表
达 OsWRKY72 基因的转基因植株叶片表皮细胞未
发生变化 , 而栅栏层细胞变大且细胞间隙较疏松
(图 3: B , C)。这可能是高表达 OsWRKY72 基因
的转基因植物叶片卷曲和变嫩的生理原因之一。
2 .4 E高表达 OsWRKY72 转基因植物的角果变短
或者败育
在转基因拟南芥果实的发育过程中 , 我们发
现与转空载体的转基因植株相比 , 高表达 Os-
WRKY72 基因的转基因植物角果长度明显较短 ,
且随着 OsWRKY72 表达量的增加 , 高表达植株出
现角果逐步缩短 , 且败育果荚的数目增多 ( 图
4: A , B)。此结果说明高表达 OsWRKY72 影响
了转基因拟南芥角果的发育和种子的形成。
2 .5 E高表达 OsWRKY72 基因降低转基因植物的
顶端优势
纵观高表达 OsWRKY72 转基因植物整体形
图 1 OsWRKY72 基因的水稻组织定位
(MR: 成熟根 ; S: 小穗 ; YL : 幼叶 ; ML : 成熟叶 ;
FL : 旗叶 ; OL : 老叶 )
Fig . 1 Spatial expression profilesof OsWRKY72 . Transcript level of Os-
WRKY72 was inspected by RNA gel blot analysis in different organs .
Ethidiumbromidestaining of rRNA for theblot is displayed to demonstrate
equal loading of RNA in each lane . (MR : matureroot; S: spikelet; YL :
young leaf; ML : mature leaf; FL : flag leaf; OL : old leaf)
1076 期 宋 钰等 : 高表达水稻 WRKY72 基因影响拟南芥生长素信号传导
图 2 拟南芥高表达 OsWRKY72 转基因植株的筛选
左一为转基因植株中 OsWRKY72 的表达情况 , 右图为野生型和各转基因植株 4 周龄苗的表型
Fig . 2 The screen of transgenic lines of 35S: : OsWRKY72 . The left is transcript level of OsWRKY72 in different lines,
and the right is the phenotypes of wild type and transgenic lines at the ageof 4 weeks
图 3 转基因拟南芥表现出的叶变小和叶卷曲现象及叶片共聚焦显微照
( A . 空载体与 OsWRKY72 转基因拟南芥茎生叶形态比较 ; B . 空载体与 OsWRKY72 转基因拟南芥叶表皮细胞的比较 ;
C . 空载体与 OsWRKY72 转基因拟南芥叶栅栏细胞的比较。Bars = 10μm)
Fig . 3 Morphological comparison of cauline leaf between vector and 35S: OsWRKY72 transgenic plants
( A : The cauline leaves of vector and 35S: OsWRKY72 transgenic plants; B : Normal stomata and epidermal cells;
C: Loosepalisade cell clearance and increased palisade cell volume of transgenic lines . Bars= 10μm)
态 , 与转空载体的植株相比 , 侧枝的发育较转空
载体的转基因植株强盛 , 主枝与侧枝的明显差异
消失 ( 图 5: A) 。经统计发现随 OsWRKY72 的表
达量增加 , 高表达 OsWRKY72 转基因植物侧枝的
分支数明显的较转空载体的转基因植物增多 ( 图
5: B)。众所周知 , 植物顶芽会不同程度的抑制
腋芽的生长 , 而这一特性在高表达 OsWRKY72 转
基因植物上明显发生改变 , 即其顶端优势现象明
显受到抑制。另外这一现象在转基因烟草中也得
到了重复 , 图 5C 显示转基因烟草的侧芽发育明
显较对照强。
3 讨论
植物顶端优势的改变在一定程度上反映了其
生长 素信 号通 路的 变化 ( McSteen and Leyser,
2005) , 而现已普遍认为生长素可以促进一些器
官细胞的伸长 ( Jones, 1994 ) 和调控叶片的发育
(李林川和瞿礼嘉 , 2006 ) , 更加明确的是生长素
信号通路受阻会强烈影响种子的形成和果实的发
育 (Wang 等 , 2005; Goetz等 , 2006 ) , 因而上述
叶片向下卷曲、角果发育不良、顶端优势降低的
现象暗示高表达 OsWRKY72 可能影响了转基因植
物的生长素信号通路。
207 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 4 转基因拟南芥角果的发育情况及长度统计 ( Mean±SD, n= 50 )
Fig . 4 Morphological and statistical comparison of fruit phenotype and length between vector and 35S: : OsWRKY72
transgenic plants ( Figures represent the means±SD from at least 50 Fruits for each line)
图 5 转基因拟南芥和烟草表现的顶端优势减弱 , 侧枝增多情况 ( Mean±SD , n= 25 )
Fig . 5 The increased branches of transgenic Arabidopsis and tobacco in morphological and statistical comparison
( Figures represent the means±SD from at least 25 plants for each line)
另外 OsWRKY72 基因在生长旺盛的幼嫩组织
强烈表达 (图 1) 的事实促使我们想进一步探讨
影响植物生长发育的激素是否能有效地调控其表
达水平 ? 而事实上根据 Xie 等 ( 2005 ) 和 Rama-
3076 期 宋 钰等 : 高表达水稻 WRKY72 基因影响拟南芥生长素信号传导
moorthy等 (2008) 的表达谱分析发现 OsWRKY72
确实受 ABA 和 IAA 的诱导 , 因此我们推测 Os-
WRKY72 可能参与了脱落酸和生长素的信号途
径。进一步调查生长素信号通路相关基因的突变
体后我们发现 , 35S: : OsWRKY72 植株的表型确
实很大程度的与 bud1 (Dai 等 , 2006)、 axr1 (Lin-
coln等 , 1990)、 aux1 ( Cernac等 , 1997)、 atmdr1- 1
atpgp1 (Noh 等 , 2001 ) 等突变体表型高度相近。
为此我们检测了 AXR1 基因在 35S: : OsWRKY72
植株抽苔后的表达情况 , 结果发现它在 35S: :
OsWRKY72 植株的表达量比在野生型的表达量低
(图 6)。由此我们推断是否是以 AXR1 基因为代
表的生长素相关基因因 OsWRKY72 基因的高表达
而受抑制进而导致相关表型的出现。
图 6 1μM NAA 处理过程中 35S: : OsWRKY72 转基因
拟南芥中 AXR1 基因的表达情况。 ( Actin 为内标 )
Fig . 6 Expression of AXR1 in 35S: : OsWRKY72 transgenic
plants treated with or without 1μmol?L NAA . The actin gene
was used as an internal standard
植株侧芽发育增强及叶卷曲等现象与 AXR1
和 BUD1 基因的变化相关联 ( Stirnberg等 , 1999;
Dai 等 , 2006 )。而 BUD1 基因编码 MAPKK7 激
酶 , 可以在上游负调控 AXR1、 AUX1、 MDR1 和
PGP1 等基因的表达 ( Dai 等 , 2006 )。MAPKK 激
酶家族共有 10 个成员 , 与 60 个 MEKK 激酶和 21
个 MAP 激 酶共 同组 成 三级 磷 酸化 级联 网 络
(MAPK group, 2002 )。现 已 在 拟 南 芥 中 发 现
MAPK 成员和 WRKY 成员间可以相互作用 , 如
MEKK1 在蛋白水平和转录水平上都可以直接和
WRKY53 发生相互作用进而影响衰老和抗病信号
通路 (Miao 等 , 2007 ) , MAPK4 可以在转录水平
上调控 WRKY25 和 WRKY33 进而影响抗逆信号
通路 ( Andreasson 等 , 2005 ) , MEKK1、MKK4?
MKK5、MPK3?MPK6 组成的级联体系很可能在上
游调控 WRKY22 和 WRKY29 (Asai 等 , 2002) , 对
突变体进行诱导发现 WRKY33 和 WRKY53 与处
于其上游的 MPK6?MPK3 之间具有强烈的关联性
(Wan等 , 2004)。另外 bud1 是一个 BUD1 基因过
表达的突变体 ( Dai 等 , 2006 ) , 它和高表达 Os-
WRKY72 的转基因植株以及 axr1 敲除突变体表型
和生理变化十分相近 , 暗示 WRKY 转录因子和
MAPKK7 直接或者间接的调控或者影响下游生长
素极性运输相关基因进而产生与它们突变体相近
的表型。
综合以上证据和推论我们认为 OsWRKY72 基
因确实影响了生长素极性运输信号通路 , 它的高
表达很可能通过与 MEKK7 互作直接或者间接的
调控生长素极性运输相关基因 , 从而造成生长素
的信号通路自身节点蛋白的变化进而影响生长素
指导的生长发育 , 特别是影响植物顶端优势。而
对这一现象形成的分子机制做进一步的研究探索
将有利于我们对植物顶端优势等的生长素反应的
认识和利用。
致谢 图片的摄影和文献的整理工作得到了陈征、高洁
和赖菡同学的热心协助。
〔参 考 文 献〕
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