全 文 ：盾叶薯蓣花药培养及单倍体植株的获得
?
闫立霞1 , 胡春根2 , 姚家玲1
??
( 1 华中农业大学生命科学技术学院 , 武汉 430070; 2 华中农业大学园艺林学学院 , 武汉 430070 )
摘要 : 以处于单核期的盾叶薯蓣花药为材料 , 经愈伤组织途径成功获得单倍体盾叶薯蓣新材料。对盾叶薯
蓣花药培养、植株再生过程的研究表明 : 来自不同居群的外植体对花药愈伤组织诱导有显著影响 ; W14 是
适合花药愈伤组织诱导的基本培养基 ; 花药愈伤组织增殖和分化的适宜培养基为 : MS 基本培养基 + BA2 .0
mg?L + IAA0 .2 mg?L ; 生根培养基为添加了 IBA2 .0 mg?L、NAA0 .4 mg?L 和 0 .5 g?L 活性碳的 MS培养基。以流
式细胞仪和根尖染色体压片法检查花培植株的结果表明 , 有 8%～12% 的个体为单倍体。实验结果为进一
步开展单倍体育种及相关理论研究提供了材料和技术基础。
关键词 : 盾叶薯蓣 ; 花药培养 ; 单倍体 ; 植株再生
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 01 - 033 - 05
Haploid Callus and Plantlets Regenerated from Anther
Culture of Dioscorea zingiberensis (Dioscoreaceae)
YAN Li-Xia
1
, HU Chun-Gen
2
, YAO Jia-Ling
1 * *
( 1 Collegeof LifeScience and Technology, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070 , China;
2 College of Horticultural and Forest, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070 , China)
Abstract: Haploid plantlet and calluswere induced fromthe anther culture of Dioscorea zingiberensisas the explant at the
stag of later uninucleate period . The results indicatesthat the basal culturemediaand explants fromdifferent population af-
fect dramatically callus inductionfromanthers . W14 was the best basal mediafor thefirst step of callus induction . MS me-
dia with BA2 .0 mg?L + IAA0 .2 mg?L improved callus′multiplication and differentiation . MS media with 2 .0 mg?L IBA ,
0 . 4 mg?L NAA and 0.5 g?L active carbon were suitable for rooting . Examination of the anther cultured plantlet displayed
that 8 %- 12% cloneswere haploid . Theestablishedtechnique systemand obtained haploid plantwould provide solid sup-
port and valuablematerials for further breedingof Dioscorea zingiberensis .
Key words: Dioscorea zingiberensis; Anther culture; Haploid; Plant regeneration
盾叶薯蓣 ( Dioscorea zingiberensis) 别名黄姜、
火头根 , 系薯蓣科多年生草质缠绕藤本 , 雌雄异
株 , 其根状茎富含的薯蓣皂甙元是生产甾体激素
类药物的重要原料 (丁志遵等 , 1983) 。由于多
年无计划采挖 , 野生资源严重破坏而濒临枯竭 ,
现已转为人工栽培 , 在此过程中种质退化严重 ,
皂甙提取成本提高、排污量增加 ( 金志雄等 ,
2004) 。生产中迫切需要通过各种育种技术获得
薯蓣皂甙元含量高、产量高的品种。谢碧霞等
(1999) 、任建伟等 (1994 ) 建立了盾叶薯蓣的组
培快繁体系 , 李运合等 ( 2005) 、周媛等 ( 2005)
通过离体诱导获得盾叶薯蓣四倍体植株 , 开展盾
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (1 ) : 33～37
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence
收稿日期 : 2006 - 03 - 29 , 2006 - 12 - 15 接受发表
作者简介 : 闫立霞 (1980 - ) 女 , 华中农业大学生命科技学院硕士 , 研究方向为资源植物研究与利用。 ?
基金项目 : 国家自然科学基金资助项目 ( 39770084)
叶薯蓣的多倍体育种。而花药培养获得的花粉植
株经加倍后可迅速获得纯合植株 , 提高育种效
率、缩短育种年限 , 在水稻、小麦等许多作物的
单倍体育种中发挥了重要作用 (姜键等 , 2001;
隋新霞等 , 2005) , 因此尝试开展盾叶薯蓣的花
药培养 , 期望得到单倍体或双单倍体植株 , 为解
决盾叶薯蓣种质退化 , 培育高产和高薯蓣皂甙元
含量的新品种奠定基础。
花药培养时诱导花粉植株能否成功及诱导频
率受多种因素的影响 , 亲本植株的基因型、生理
状态以及培养基组成、培养方式等对花粉植株的诱
导频率有直接影响 (郭奕明等 , 2001; 王伟光等 ,
2005)。本文研究了不同居群的盾叶薯蓣花药、基本
培养基等对其愈伤组织诱导及植株再生的影响 , 经
染色体计数和流式细胞仪检测 , 确定了花培植株的
倍性 , 首次通过盾叶薯蓣花药培养得到了单倍体植
株 , 为进一步开展药用薯蓣的单倍体育种和相关
理论研究提供了技术基础和实验材料。
1 材料与方法
1 .1 材料
供试盾叶薯蓣取自湖北武当山、郧西县 , 河南南阳
市 , 湖南泸溪县 , 种植在华中农业大学实验基地。
1 .2 方法
1 .2 .1 花药愈伤组织的诱导 镜检确定花粉发育时期 ,
选取花粉处于单核中晚期的花蕾 , 用 0.1 %氯化汞溶液
整体灭菌 10 min, 无菌水冲洗 3～5 次 , 剥取花药 , 接种
到 4 种诱导培养基上以筛选基本培养基 (表 1 )。黑暗条
件下 30℃预培养 3 d, 后转入 28℃黑暗条件下诱导培养。
在愈伤组织转移出来之前统计花药愈伤组织诱导率 (形
成愈伤组织花药数?接种花药数×100% )。
1 .2 .2 植株再生 愈伤组织分化采用 2 步培养法 : 待愈
伤组织长至 2～3 mm时转入芽分化培养基 (表 2) , 统计
表 1 愈伤组织诱导培养基
Table 1 Media for callus inducing from the anther
培养基 基本培
代号 养基 添加的激素
Medium Basal Hormone composition
code medium
M MS 2 n, 4-D 2 D. 0 mg?L + KT2 ?. 0 mg?L + NAA0 .5 mg?L
N N6 ?2 n, 4-D 2 D. 0 mg?L + KT2 ?. 0 mg?L + NAA0 .5 mg?L
W W14 ?2 n, 4-D 2 D. 0 mg?L + KT2 ?. 0 mg?L + NAA0 .5 mg?L
B B5 ?2 n, 4-D 2 D. 0 mg?L + KT2 ?. 0 mg?L + NAA0 .5 mg?L
注 : 诱导培养基添加 0 . 7 %琼脂 , 调节 pH 至 5 .8 , 添加的糖类为
麦芽糖 Note: All of the culturemediawere addedwith 0 .7 % agar,
adjusting pH to 5 .8 , add maltose as sugar
幼 (绿 ) 苗分化率 (分化幼苗数?转移愈伤组织数×
100% )。分化培养的前三天采用散光照培养 , 后强光照
培养。在愈伤组织分化出芽后将其转移至生根培养基
中 , 生根培养基为 1?2MS 基本培养基 , 添加了 2 .0 mg?L
IBA、0 .4 mg?L NAA、0.5 g?L 活性碳和 30 g?L 蔗糖。培养
温度为 (25±3)℃。
表 2 分化培养基
Table 2 Culture media for differentiation
培养基代号 培养基配方
Medium code Major components of the culture medium
F1 ?MS + BA2 ?. 0 mg?L + IAA0 .2 mg?L + 蔗糖 3 %
F2 ?MS + NAA1 D. 0 mg?L + KT0 ?. 2 mg?L + 蔗糖 3 %
F3 ?G大量 + MS 微量 + MS 有机物 + BA2 . 0 mg?L
+ IAA0 ?. 2 mg?L + 蔗糖 3 %
注 : 所有分化培养基添加 0 .7 % 琼脂 , 调节 pH 至 5.8 Note:
All of the culture media were added with 0 .7 % agar , adjusting pH to 5 .8
G大量包含的成分 : KNO3 3 000 mg?L , CaCl2·H2 O 220
mg?L , MgSO4·7H2 O 440 mg?L KH2 PO4 500 mg?L
MS大量包含的成分 : NH4 NO3 1 650 mg?L , KNO3 1 900
mg?L , MgSO4·7H2 O 370 mg?L KH2 PO4 170 mg?L
1 .2 .3 倍性鉴定 盾叶薯蓣花药培养再生植株的倍性鉴
定 , 利用流式细胞仪 (德国 Partec公司产品 ) , 参照张俊
娥 ( 2003) 的测定方法 , 分别检测对照和诱导材料幼嫩
叶片和愈伤组织细胞中的 DNA 含量。根尖染色体计数 :
采用常规细胞染色体压片方法 , 卡宝品红染色。
2 结果与分析
2 .1 培养基选择与不同居群外植体的差异
盾叶薯蓣花药接种后 2 周左右 , 在花药的表
面形成愈伤组织。愈伤组织为白色或乳黄色 , 质
地较密实 , 以花药两侧形成愈伤较常见 (图 1A)。
接种 3 周后统计愈伤组织诱导率 , 结果见表 3。
实验结果显示 , 盾叶薯蓣花药培养的愈伤组
织诱导率较低 , 居群和培养基对诱导率都存在显
著影响 , 二者之间的互作效应显著。如来自河南
南阳的材料在 W14 和 MS基本培养基上形成了愈
伤组织 , 诱导率分别为 5 .2% 和 0 .4% , 在 N6 和
B5 培养基上则没有形成愈伤组织 ; 来自湖南泸
溪的 材料在 N6 培养基 上的诱导率 最高 , 为
1 .6% , 在 W14 和 MS 培养基上诱导产生了花药
愈伤 , 但在 B5 培养基上则不能形成愈伤组织。
从培养基的主效应看 , W14 培养基诱导率最佳 ;
从居群效应看 , 河南南阳居群与湖南泸溪居群对
于花药培养有较好反应。
43 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 1 A . 盾叶薯蓣花药愈伤组织 ; B . 盾叶薯蓣花药愈伤组织的再生植株 ; C . 二倍体植株根尖染色体 ; D . 单倍体植株根尖染色体
Fig . 1 A . callus induced from the anther of Dioscorea zingiberensis C H Wright; B . plantlets regenerated from anther culture of
D. zingiberensis; C . photo displayed the chromosomes of root tip cells from donor plant, 2n= 20; D . chromosomes
of the root tip cells of the regenerated haploid plantlet from anther culture, 2n= 10
表 3 不同居群盾叶薯蓣花药在各诱导培养基上的愈伤诱导效率
Table 3 Callus induce frequency in the media for anther culture from different populations of Dioscorea zingiberensis ( % )
居群 Populations
培养基 Medium
W14 qN6 8MS B5 ?
居群平均 ( po)
湖北武当 Hubei Wudang 0 ?. 8±1 S. 094 0 ?0 0 8. 4±0 .854 0 W. 30 b
湖北郧西 Hubei Yunxi 1 ?. 6±2 S. 118 0 t. 4±0 5. 894 0 0 0 W. 50 b
河南南阳 Henan Nanyang 5 ?. 2±3 S. 031 0 ?0 V. 4±0 .854 0 1 Y. 40 a
湖南泸溪 Hunan Luxi 1 ?. 2±1 S. 788 1 t. 6±1 5. 672 0 V. 4±0 ?. 855 0 0 G. 80 ab
培养基平均 ( me) 2 ?. 20 a 0 .50 b 0 .20 b 0 .10 b
注 : 上述处理中 , 每处理 5 皿 , 每皿 50 个花药。以 SAS 9 .0 对各居群与培养基的效果进行双因素方差及协方差分析。同一行或同一栏
平均值后中含相同字母为差异不显著 (LSD 法 , p= 0 .05 ) , LSDme0 .05 = 0 .7558 , LSDpo0 .05 = 0 .7558
2 .2 愈伤组织分化与植株再生 ( 图 1B)
生长素如2 ,4-D 能够促进小孢子的分裂 , 诱
导花粉粒发育成为愈伤组织 , 但要使愈伤组织分
化成植株 , 则需要将其转移至含较低浓度生长素
和较高浓度细胞分裂素的分化培养基上。为了比
较生长素和细胞分裂素对植株分化的影响 , 本实
验设计了含有高浓度 BA 和低浓度 IAA 的 F1 培
养基和含有高浓度生长素的 F2 培养基。F3 培养
基的激素组合同 F1 , 但基本培养基为 G 大量元
素。G 大量元素在我们已建立的盾叶薯蓣快速繁
殖体系中 , 用于提高芽的增殖速率。
将愈伤组织转移进行分化培养时 , 常选取直
径为 1～3 mm的愈伤组织块。本实验中盾叶薯蓣
花药愈伤组织在诱导培养基中生长 30 d左右 , 其直
径增殖达 2～3 mm, 此时将愈伤组织块直接转入分
化培养基中 , 愈伤组织继续增殖 , 待生长 3 周时开
始分化出绿芽 , 之后 25 d左右继代一次 , 第一次继
代时部分愈伤组织转绿 , 个别愈伤组织出现芽的分
化; 第二次继代时愈伤组织已全部出现芽的分
化 , 易形成丛生芽 , 芽的数量从 2-多个不等 , 有
些已分化的芽在试管里伸长形成幼叶 , 将其转移
至生根培养基后分化出根 , 形成再生植株。
盾叶薯蓣花药愈伤组织对 3 种分化培养基的
反应不同 , 分化时间和分化率都有差异。统计不
同分化培养基 F1、F2 和 F3 中的幼 (绿 ) 苗分化
率 , 分别为 50.0%、38.46%、20 .0%。愈伤组织
在 F1 培养基中分化最早 , 20 d 左右出现多个绿
芽 , 30 d左右长出幼叶形成幼苗 ; 愈伤组织在 F2
培养基中芽分化的时间比 F1 晚 3～4 d, 芽数量
少 , 幼叶发育不良 , 愈伤组织在 F2 培养基中可以
同时分化形成根 , 但根细弱、易分支 , 移栽成活
困难; 愈 伤组 织 在 F3 培 养 基中 分 化 率最 低
(20% ) , 多数褐化死亡 , 而且芽开始分化所需要
的时间更长 , 幼苗形成晚于 F1 培养基 10～15 d。
531 期 闫立霞等 : 盾叶薯蓣花药培养及单倍体植株的获得
实验结果表明 , F1 是适合于愈伤组织分化的培养
基 , 分析和比较这 3 种分化培养基的成分 , 其中
F1 和 F3 培养基具有相同激素和浓度 , 但 F3 培养
基中缺少了 NH4 NO3 , 表明 NH4 + 在盾叶薯蓣花药
愈伤组织培养中有促进生长和分化的作用。而 F1
和 F2 的基本培养基相同 , 但添加的激素种类不
同 , 添加 BA2 .0 mg?L、 IAA0 .2 mg?L 的 F1 培养基
比添加 NAA1.0 mg?L、KT0 .2 mg?L 的 F2 培养基更
适合于花药愈伤组织的增殖和分化。因此 , 适合
盾叶薯蓣花药愈伤组织增殖和分化的培养基为 :
MS基本培养基 , 添加 BA2 .0 mg?L、IAA0.2 mg?L。
2 .3 再生植株的倍性鉴定
利用流式细胞仪检测盾叶薯蓣花药愈伤组织
及再生植株的倍性 , 以二倍体植株的叶片为对
照 , 测定了 33 个花药培养的材料 , 其中 12 个是
花药愈伤组织 , 21 个是再生植株的叶片 , 得到
被测样品细胞的相对 C 值 , 采用 Partec DPAC 软
件对检测细胞 DNA 含量分布图进行分析 , 测定
结果显示花药培养材料的倍性水平比较复杂 , 所
测的 33 个样品中 , 有单倍体峰、二倍体峰、四
倍体峰和混倍体峰 , 具体比例见表 4。
表 4 盾叶薯蓣花培材料不同细胞倍性率
Table 4 The different ploid frequency of anther culture
of Dioscorea zingiberensis
样品类型 单倍体 二倍体 四倍体 混倍体
Sample ( 1 ?C) (2C) (4 LC) Mixoploid
Haploid Diploid Tetraploid
愈伤组织 Callus ( % ) 16 ?67 ?8 .3 8 .3
再生植株 Plantlet ( % ) 9 ?. 5 81 ?5 d5
图 2A 所示为对照盾叶薯蓣叶片 DNA 含量分
布图 , 只有一个峰 , 说明对照为纯倍体 , 设定其
细胞 C 值为 2C , 图 2B 为花药愈伤组织再生植株
叶片的 DNA 含量分布图 , 只有一个峰 , 也为纯
倍体 , 但峰值约为图 2A 的 1?2 , 说明其叶片细胞
的 C 值为 1C , 再生植株为单倍体。
对盾叶薯蓣花药培养再生植株还做了根尖染色
体压片观察 , 共检测 24 个单株 , 其中 2 株根尖细胞
染色体数目为 2n= 10 (图 1D) , 是单倍体植株。
本实验通过两种方法鉴定盾叶薯蓣花药愈伤
组织及再生植株的倍性 , 分别检测到单倍体植
株 , 但愈伤组织分化过程中会出现自然加倍的现
象 , 使得再生植株单倍体检测率低于愈伤组织。
3 讨论
基本培养基的组成对花药培养成功率有明显
影响。花药培养基种类很多 , 有些是适用于单子
叶植物的 , 如朱至清为水稻花药培养设计的 N6
培养基 , 这种培养基已被广泛地应用于禾谷类作
物的花药培养 (余叔文和汤章城 , 1992) ; 欧阳俊
闻 (1991) 在进行小麦花药培养时 , 设计了 W14
培养基 , 大大提高了花粉植株的获得率。盾叶薯
蓣虽然属于单子叶植物 , 但对适应于单子叶禾谷
类花药培养的几个基本培养基的反应不同 , 从本
实验对几种基本培养基的筛选结果来看 , 在禾本
科植物花药培养中普遍适用的 N6 培养基 , 并不适
合于盾叶薯蓣的花药培养 , 而 W14 培养基所得到
的花药愈伤组织诱导率达到 5 .2% , 而且表现出
对来自不同居群的花药有较广的适应性。
花培材料的遗传背景对培养成败关系甚大 ,
如小麦在一步成苗中 , 不同的基因型表现很大的
差异性 ( 任慧莉等 , 2002) ; 在棉花花药培养中 ,
图 2 A . 盾叶薯蓣二倍体植株叶片 DNA 含量分布图 ; B . 花培植株叶片 DNA 含量分布图
Fig . 2 A . the distribution of relative DNA content in mesophyll of diploid control of Dioscorea zingiberensis; B . the distribution
of relative DNA conent in mesophyll of regenerated plantlets from anther cultureof Dioscorea zingiberensis C H Wright
63 云 南 植 物 研 究 29 卷
不同基因型愈伤组织诱导之间有明显差异 , 而且
对愈伤组织生活力也有影响 ( 张宝红等 , 1994 ) ;
亚麻花药培养也存在基因型或居群对花药愈伤组
织诱导力的差异 ( Bohus等 , 2004)。我们在进行
预备实验时曾选用了 28 个居群的材料 , 结果只
有 8 个居群的花药在培养中对诱导有反应 ; 本实
验选用的 4 个居群的花药 , 在筛选出的最适基本
培养基 W14 中的花药愈伤组织诱导率也有明显
差异 , 因此在花药培养中对供试材料的筛选是非
常重要的。
前人的研究表明 , 花培植株的倍性水平比较
复杂 , 其中不但有单倍体、二倍体 , 还有多倍
体、非整倍体和混倍体等 , 通常经愈伤组织途径
分化形成的植株 , 出现非单倍体的频率较高 (余叔
文和汤章城 , 1992)。盾叶薯蓣花培植株经根尖细胞
压片和流式细胞仪检测 , 发现有一定频率的单倍体
植株 ( 8% ～ 12% ) , 而 二 倍 体 植 株 占 大 多 数
(81.8% )。分析二倍体植株形成的原因 , 一是再生
植株可能起源于花药壁组织的体细胞 , 二是来自花
粉的单倍体愈伤组织在培养过程中染色体自然加倍
(Assani 等 , 2003)。De Buyser 等 ( 1980 ) 曾分析 ,
导致花培植株自然加倍的可能因素是核融合或者是
愈伤阶段细胞核内有丝分裂。因此 , 在盾叶薯蓣
的花药培养中可以追踪愈伤组织的确切来源和植
株再生过程的形态发生 , 进一步优化花药培养的
技术体系 , 提高单倍体或双单倍体再生植株的频
率 , 以利于单倍体育种及相关理论研究。
本实验获得的盾叶薯蓣单倍体花粉植株 , 其
形态表现和性别分化对于雌雄异株植物的性别发
育理论学研究也是一个很有意义的材料 , 单倍体
花粉植株及其加倍后的纯合二倍体植株的薯蓣皂
甙元代谢方面的变化和在育种中的潜在价值有待
进一步发掘。
〔参 考 文 献〕
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