全 文 ：拟南芥六个新的 small RNAs 的克隆和功能预测?
唐 霏1 ,2 , 梁 岗1 , 2
??
, 余迪求1 ***
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 , 云南 昆明 650223 ; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049)
摘要 : 以模式植物拟南芥为例 , 建立了一种克隆 small RNA 分子的技术平台 , 为今后开展 small RNA 分子的
生物学功能研究提供技术支撑。通过用抗病信号分子水杨酸 (SA) 处理拟南芥叶片后 , 进行 small RNA 分
子群体的分离与接头连接、PCR 扩增、T - 载体克隆与检测、测序分析和生物信息学分析等一系列实验 ,
成功地克隆了一些 small RNAs, 并对其表达和功能进行了分析。
关键词 : 拟南芥 ; small RNA ; PCR; 克隆
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 05 - 570 - 07
Clone and Function Prediction of Six Novel Small
RNAs in Arabidopsis (Cruciferae)
TANG Fei
1 , 2
, LIANG Gang
1 , 2 * *
, YU Di-Qiu
1 ** *
( 1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223 , China;
2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China)
Abstract : We have developed a reproduciblemethodof small RNAs cloning frommodel plant Arabidopsis thaliana, which
will facilitatetheresearchon small RNAsin thefuture . We have successfully cloned several small RNAs fromleaves of Ar-
abidopsis treated by SA (signal molecule of disease resistance) , using isolation, adapter ligation, PCR amplification, T-
clone, sequence and bio-information analysis and so on . Furthermore, we conducted analysis on their expression profiles
and predicted functions of these small RNAs .
Key words: Arabidopsis; Small RNA ; PCR; Clone
MicroRNA 和 siRNA 是两类非编码的 small
RNA , 他们在动物和植物的基因表达调控中起到
非常重要的作用。miRNA 的功能主要是通过与目
标 mRNA 配对使其降解 ( Llave等 , 2002; Palatnik
等 , 2003) 或者抑制其翻译 (Lee等 , 1993; Rein-
hart 等 , 2000; Aukerman and Sakai , 2003; Chen,
2004) , 引起基因沉默。拟南芥的 miRNA 是 Bartel
等 2003 年最早发现的 ( Bartel 等 , 2004; Aukerman
and Sakai , 2003; Palatnik 等 , 2003; Chen, 2004;
J uarez 等 , 2004; Kidner and Martienssen, 2004 )。
siRNA 主要来源于双链的 RNA 分子 ( Waterhouse
等 , 2001; Plasterk, 2002) , 是在植物的转基因沉
默或者病毒侵染的条件下产生的 ( Hamilton and
Baulcombe, 1999; Zamore等 , 2000 )。siRNA 介导
的 RNA 基因沉默主要是保护基因组抵抗一些移
动的 DNA 元 件 ( Ketting 等 , 1999; Tabara 等 ,
1999; Wu-Scharf 等 , 2000 ) , 和病毒的侵染 (Vo-
innet, 2001; Waterhouse等 , 2001) 。在转录后基因
沉默中 , siRNA 可能通过指导 DNA 甲基化和染
色体的修饰来参与 (Qi 等 , 2006) 。
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (5) : 570～576
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2008.07324
?
?? ?同第一作者对本论文具相同贡献 ; * ** 通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ydq@xtbg. ac. cn
收稿日期 : 2008 - 01 - 09 , 2008 - 02 - 13 接受发表
作者简介 : 唐霏 ( 1982 - ) 男 , 硕士研究生 , 主要研究方向 : 植物基因功能分析。 ?
基金项目 : ?云南省基金项目 ( 2004C0051M) 、国家自然科学基金重大项目 ( 90408022 )、中国高技术研究发展计划 ( 863 项目 )
和 (2006AA02Z129) 中国科学院“百人计划” 择优资助项目
近年来 , 关于 siRNA 和 miRNA 两 种 small
RNA 的报道越来越多。最近的研究表明 , small
RNA 的 形成 需 要 DICER-LIKE ( DCL ) , ARGO-
NAUTE 和 RdRP 的共同参与 (Xie等 , 2004 )。植
物在周围环境的影响下 , 会通过自身的机制来进
行调节。在非生物因素作用下 , 比如在干旱、高
盐、SA 和 ABA 等胁迫下 , 生物体内的 small RNA
会参与基因的调控 , 包括转录调控和转录后水平
的调控。目前已经报道了一些在非生物因素下参
与调控的 miRNA 分子 , 如 miR393 , miR402 等
(Sunkar and Zhu, 2004) 。miRNA 与其它 small RNA
的区别之一是它的前体是否能形成发夹结构。
我们的研究发现 , 拟南芥细胞存在的调控逆
境诱导反应及其信号传导的基因也参与 miRNA
分子形成及其表达调节 , 比如依赖于 RNA 的
RNA 多聚酶 1 ( RdRP1: RNA-dependent RNA Poly-
merase 1 ) 基因受水杨酸和病毒感染诱导表达 ,
参与植物抗病毒反应及 small RNAs 分子的形成
(Yu等 , 2003; Xie等 , 2004) 。在此基础上 , 我们
成功地从 SA 诱导的拟南芥叶片中克隆获得 100
多个 small RNAs 分子 , 并初步确定了其中 6 个
small RNAs分子为新的 miRNA 分子。通过随后的
表达谱分析以及靶基因及其功能预测 , 更进一步
了解这些 miRNA 分子的生物学功能。
1 材料与方法
1 .1 材料与处理
实验材料拟南芥 ( Arabidopsis thaliana) 生态型 Co-
lumbia ( Col ) , 种植于温室 , 温度为白天 23℃ , 晚上
19℃ , 光周期为 14 h光照和 10 h黑暗。本研究所用大肠
杆菌 ( Escherichia coli ) DH5α菌株由本实验室保存。
1 .2 small RNA 克隆
用含 8 mol?L 尿素、1% SDS 的 15% 的聚丙烯酰胺
(加 400μl 过硫酸铵 , 40μl TEMED) 进行电泳 , 在样品和
Marker 中加少量 EB, 分离出我们所需要的 small RNA。之
后进行连接 3′-adapter、5′-磷酸化、连接 5′-adapter、RT-
PCR、T 克隆、大肠杆菌转化、挑出克隆 , 提取质粒
DNA 进行酶切 , 检测所挑的克隆是否含有插入片段 , 用
试剂盒提取检测到的含有插入片段的质粒 DNA 并测序 ,
获得 small RNA。
1 .3 small RNA 的前体和靶基因的预测
用mfold program分析了 miRNA 前体的近 100～300 个核
苷酸序列的发夹结构 , 并通过 http:?www.ncbi.nlm.nih.gov?
网站进行序列比对 , 寻找 6 个 small RNAs相应的靶基因。
1 .4 small RNA 的表达谱分析
取 40μg的拟南芥总 RNA , 用 15%聚丙烯酰胺进行
电泳 , 之后转到 BioScience NytranN上 , 膜在 80℃下烘烤
1 h, 并进行 UV 交联。最后用α-32 P-ATP 标记探针 , 在
35℃下进行杂交过夜。杂交液选用 PerfectHyb Plus Hybrid-
ization Buffer (Sigma)。用 2×SSC 和 1% SDS溶液在 35℃下
洗膜两次 , 每次 20 min。于 - 80℃曝光 2 天后冲片。
2 实验结果
2.1 SA-regulated small RNAs and other small RNAs
为了克隆 SA 诱导的 small RNAs, 我们构建
了一个 SA 诱导的 small RNAs 库。从变性凝胶中
分离了 small RNAs, 连接 5′-和 3′-接头 , 然后
PCR 扩增 , 再亚克隆到 pUCm-T vector 上 , 最终
得到 100 多个克隆。测序结果表明 , 其中 8% 的
克隆与 8 个已报道的拟南芥 miRNA ( miR156 ,
miR157 , miR158 , miR163 , miR168 , miR173 ,
miR396 , miR398 ) 相同 ; 86% 的序列分别属于
tRNAs、rRNAs和 small nuclear RNAs。
更为重要的是我们克隆到了 6 个新的拟南芥
small RNAs分子 ( 表 1)。RNA 在基因组中所对应
的侧翼序列形成的二级结构是否带有发夹结构是
miRNA 区别于别的 samll regulatory RNAs的一个重
要特征。我们用 mfoldprogram分析了 miRNA 前体
的近 300 个核苷酸序列的发夹结构 , 并且发现我
们克隆的 6 个 small RNAs正好在发夹结构中 ( 图
1)。所以这 6 个 ( 6% ) 序列可能是新的拟南芥
miRNA 分子 , 我们将其分别命名为 small RNA
0001 , small RNA 0002 , small RNA 0003, small RNA
0004 , small RNA 0005 , small RNA 0006 (表 1)。
表 1 6 个新的 small RNAs 分子
Table 1 6 Novel small RNAs
Small RNA gene Sequence
0001 ?5 t′-UACUAAUACGAAUCACUAA-3′
0002 ?5 t′-UUAGUCGGUUGUGGUUGUUCUUA-3′
0003 ?5 t′-AUACUAAUACGUUUUAUUA-3′
0004 ?5 t′-GACAUCUGGAGAGUUUA -3′
0005 ?5 t′-CGCGACCUUCAAUCCCGUCGCU-3′
0006 ?5 t′-GGCAAAUAUAAUUUGAAGUUUUG-3′
2 .2 6 个 small RNAs 在基因组上的位置
通过 blast分析 , 我们确定了 small RNA 0001
～small RNA 0006 在基因组上的位置。small RNA
1755 期 唐 霏等 : 拟南芥六个新的 small RNA 的克隆和功能预测
图 1 small RNA 0001～0006 前体的发夹结构
Fig . 1 The hairpin structure of small RNA 0001 - 0006
0001 位于 1 号染色体上 , 距离上游基因 5 kb, 距
离下游基因 7 .5 kb; small RNA 0002 位于 2 号染
色体上 , 距离上游基因 1 .5 kb, 距离下游基因
0 .5 kb; small RNA 0003 位于 4 号染色体上 , 距离
上游基因 40 bp, 距离下游基因 0 .5 kb; small
RNA 0004 位于 2 号染色体上 , 距离上游基因 1
kb, 距离下游基因 2 kb; small RNA 0005 位于 2 号
染色体上 , 距离上游基因 4 kb, 距离下游基因 5
kb; small RNA 0006 位于 4 号染色体上 , 距离上游
基因 2 kb, 距离下游基因 4.8 kb (表 2 和图 2)。
2 .3 6 个 small RNAs 的靶基因
我们通过 http:??www. ncbi . nlm. nih. gov?网站
进行序列比对 , 寻找了这 6 个 small RNAs的靶基
因 (表 3) 。从表 3 中可知 , 新克隆的 small RNA
分子所调控的靶基因如下 : small RNA 0001 的靶
基因可能是锌指转录因子 HBP-1b, 线粒体转录
终止因子 , NAM 蛋白等 ; small RNA 0002 可能与
富含亮氨酸的蛋白激酶 , WRKY 蛋白转录因子等
相关 ; 而 small RNA 0003 可能调控脂类代谢 , 因
为其靶基因是脂类结合相关基因。另外 , small
RNA 0004 的靶基因可能是与衰老相关的基因 ,
而 small RNA 0005 和 small RNA 0006 可能分别调
控胚胎特异性蛋白和 FAD 结合域蛋白等基因的
表达 ( 表 3 )。
2 .4 Northern blot 分析
为了分析我们所克隆的 small RNAs的表达 ,
275 云 南 植 物 研 究 30 卷
表 2 新克隆的 6 个 small RNAs 的基本信息
Table 2 Essential information of the 6 novel small RNAs
Small RNA gene Small RNA Sequence Len Arm Chr . Fold back Distance to nearest gene Exp .
0001 JUACUAAUACGACUCACUAA 19 ?5′ 1 Yes 5 kb Yes
0002 JUUAGUCGGUUGUGGUUGUUCUUA 23 ?5′ 2 Yes 0 . 5 kb Yes
0003 JAUACUAAUACGACUUACUA 19 ?3′ 4 Yes 40 bp No
0004 JGACAUCUGGAGAGUUUA 17 ?5′ 2 Yes 1 kb No
0005 JCGCGACCUUUAAUCCCGUCGCU 22 ?3′ 2 Yes 4 kb No
0006 JGGCAAAUAUAAUUUGAAGUUUUG 23 ?5′ 4 Yes 2 kb Yes
Len . (small RNA 的长度 ) , Arm (small RNA 所在的臂 ) , Chr . ( small RNA 所在的染色体 ) , Foldback (small RNA 前体是否可以形成发夹
结构 ) , Exp . ( 是否检测到表达 )。
Len . ( the length of small RNA ) , Arm ( the arm of small RNA ) , Chr . (the chromosomeof small RNA ) , Foldback ( whether the small RNA can form
hairpin structure) , Exp . ( whether the expression of small RNA can be detected) .
图 2 6 个 small RNA 在染色体上的位置
Fig . 2 The position of 6 small RNAs on chromosome
我们检测了 6 个 small RNAs在野生型 ( col ) 和 3
种突变体 ( dcl1-7、dcl3-1 和 rdrp1 ) 中的表达情
况 (图 3)。如果 small RNA 能够在 dcl3-1 和 rdrp1
等突变体中表达 , 而在 dcl1-7 突变体中几乎不表
达 , 那么很可能是 miRNA。如果在这三种突变体
中都能够表达 , 则很可能是 siRNA。所以我们所
克隆的 6 个 small RNA 中 , 0001 和 0002 可能是
siRNA , 其余的 4 个很可能是 miRNA。
由于 6 个全新的 small RNAs 是从 SA 诱导的
small RNAs文库中克隆获得 , 促使我们检测是否
克隆的每个 small RNA 都受 SA 的诱导。通过
Northern blot分析发现 , 除 small RNA 0001 外 , 其
余 5 个 small RNAs 不受 SA 处理所影响 ( 数据未
显示 )。同时 , 我们也分析了其它已报道的 miR-
NAs是否受 SA 调控 ( 图 4 )。拟南芥 miR163 在
SA 处理 4 h时表达量开始升高 , 而 miR173 在 8 h
时表达量开始下降 , 其余的 miRNA 则与 SA 诱导
无关。
3 讨论
Brenda and David ( 2002) 的研究表明 , 非编
码的 small RNAs已经成为转录沉默和转录后基因
沉默的重要调控因子。建立一套完整的生物体的
small RNAs库及其克隆研究平台 , 对于基因组研
究、多基因比较、发育的比较研究和进化分析等
起着基础性的作用 (Sunkar and Zhu, 2004 )。研
究人员已经用克隆的办法分离了一系列 small
RNAs ( Elbashir 等 , 2001; Sunkar and Zhu, 2004 )。
我们用同样的方法建立了一个 SA 处理的拟南芥的
small RNAs库 , 并测了 100 个克隆的序列。其中
86%的 small RNAs来自于 tRNAs、rRNAs和 small
3755 期 唐 霏等 : 拟南芥六个新的 small RNA 的克隆和功能预测
表 3 6 个 small RNAs 可能调控的靶基因及序列比对分析
Table 3 The target gene and sequence analysis of 6 small RNAs
475 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 3 small RNA 0001 , 0002 , 0003 , 0004 , 0005 , 0006 在野生型
(Col ) 和突变体 ( dcl1-7 , dcl3-1 , rdrp1) 的表达
Fig . 3 The expression of small RNA 0001 , 0002 , 0003 , 0004 ,
0005 and 0006 between wild type (Col ) and mutants
( dcl1-7 dcl3-1 and rdrp1) .
nuclear RNAs, 8% 为已发现的拟南芥 miRNAs,
6%为可能的新的 small RNAs。这些新 克隆的
small RNAs都来自于基因间区 , 它们分属于不同
的染色体 , 位于发夹结构的 5′臂或 3′臂 ( 表 2 ,
图 2 )。
我们检测了新的 small RNAs在拟南芥中的表
达 , 除 small RNA 0001 , small RNA 0002 和 small
RNA 0006 有表达外 , 没有检测到其余三个 small
RNA 的表达 (图 3) , 可能是因为这些 small RNAs
的基础表达量很低 , 不容易被检测到。
我们通过 northern blot 分析进一步检测了克
隆到的 small RNAs在 SA 诱导下的表达情况。结
果表明 , 有些 small RNAs并不受 SA 的诱导 ( 只
有 miR163 受 SA 诱 导 ) , 反 而 有 的 miRNA
(miR173 ) 受 SA 的抑制。多数克隆获得的 small
RNAs (small RNA 0001 , miR156 , miR158 , miR396)
则与 SA 没有直接的关系 ( 图 4) 。Northern 分析
表明已报道的 miRNAs的基础表达量较高 , 比较
容易克隆 , Sunkar and Zhu ( 2004) 也克隆到了这
几个 miRNAs。
我们总共测了 100 个克隆的序列 , 已报道的
miRNAs占据了克隆总数的 8% , 而 6%为新发现
的 small RNAs, 这说明拟南芥 small RNAs的数据
图 4 克隆的 small RNA 在 SA 处理的不同时段的表达分析
Fig . 4 Time course of the expression level of
small RNAs induced by SA
库还不完善 , 还需要进一步研究才能建立一个完
整的拟南芥 small RNAs数据库。另外 , 寻找并确
认这些 small RNAs的靶基因、具体的调控位点以
及相应生物学功能等方面的研究 , 将是非常有意
义的。
small RNA 分子在调控生物体生长发育方面
具有非常重要的作用。如在线虫的大脑神经元发
育中的左右不对称 ( Johnston and Hobert, 2003 ) ,
花的发育 ( Chen, 2004 ) , 开花时间 ( Lim 等 ,
2004) 等方面起的作用。因此 , 我们推测 , small
RNA 分子在植物的生长发育和抗逆性水平等方
面可能同样起着十分重要的作用。small RNA 分
子的表达是否受逆境因子的调控 , 特别是水杨酸
的调控 , 目前尚无报道。水杨酸 (SA ) 作为植
物抗病反应的重要信号分子 , 参与植物的过敏性
反应 (HR) 和系统获得抗病性 ( SAR ) 的建立 ,
在植物的 HR 和 SAR 信号传导的抗病反应中起着
关键的作用 ( Yu 等 , 2003 ) , 但 SA 是 否通过
small RNA 分子发挥其调控功能尚不清楚。因此 ,
5755 期 唐 霏等 : 拟南芥六个新的 small RNA 的克隆和功能预测
分析受 SA 调控的 small RNA 分子的生物学功能 ,
将有助于理解 SA 作用的分子机制。
〔参 考 文 献〕
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