全 文 ：江苏铁角蕨的系统位置和多倍体起源
常艳芬１ꎬ４ꎬ 李　 捷１∗ꎬ 陆树刚２ꎬ Ｈａｒａｌｄ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ３
(１ 中国科学院西双版纳热带植物园 植物系统发育与保护生物学实验室ꎬ 云南 昆明　 ６５０２２３ꎻ ２ 云南大学
生态学与地植物学研究所ꎬ 云南 昆明　 ６５００９１ꎻ ３ Ｂｏｔａｎｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ Ｍｕｓｅｕｍꎬ
Ｌｏｎｄｏｎꎬ ＳＷ７ ５ＢＤꎬ ＵＫꎻ ４ 中国科学院大学ꎬ 北京　 １０００４９)
摘要: 运用分子系统发育分析的方法研究了江苏铁角蕨 (Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ) 的系统位置及其与庐山铁
角蕨 (Ａ􀆰 ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ) 的关系ꎬ 并探讨了该类群可能的多倍体起源方式ꎮ 结果显示: 江苏铁角蕨与庐山铁
角蕨可能为同源四倍体ꎬ 是组成倒挂铁角蕨复合体 (Ａ􀆰 ｎｏｒｍａｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ) 的成员之一ꎻ 二者在形态特征与
基因序列方面均表现一致ꎬ 接受英文版中国植物志的处理ꎬ 即把庐山铁角蕨处理为江苏铁角蕨的异名ꎮ
关键词: 江苏铁角蕨ꎻ 庐山铁角蕨ꎻ 核基因 ｐｇｉＣꎻ 叶绿体基因ꎻ 系统位置ꎻ 多倍体起源
中图分类号: Ｑ ９４９　 　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５－０８４５(２０１４)０１－００７－０６
Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｐｏｓｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｅｒｎ
Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ (Ａｓｐｌｅｎｉａｃｅａｅ)
ＣＨＡＮＧ Ｙａｎ￣Ｆｅｎ１ꎬ４ꎬ ＬＩ Ｊｉｅ１∗ꎬ ＬＵ Ｓｈｕ￣Ｇａｎｇ２ꎬ ＳＣＨＮＥＩＤＥＲ Ｈａｒａｌｄ３
(１ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎꎬ Ｘｉｓｈｕａｎｇｂａｎｎａ Ｔｒｏｐｉｃａｌ Ｂｏｔａｎｉｃａｌ Ｇａｒｄｅｎꎬ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２２３ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｇｅｏｂｏｔａｎｙꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００９１ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ
３ Ｂｏｔａｎｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔꎬ Ｎａｔｕｒａｌ Ｈｉｓｔｏｒｙ Ｍｕｓｅｕｍꎬ Ｌｏｎｄｏｎꎬ ＳＷ７ ５ＢＤꎬ ＵＫꎻ ４ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００４９ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ ｗａｓ ｒｅｄｕｃｅｄ ｔｏ ａ ｓｙｎｏｎｙｍ ｏｆ Ａ􀆰 ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｌｉｓｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｏｒａ ｏｆ Ｃｈｉｎａ.
Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｂｏｔｈ ｅｎｔｉｔｉｅｓ ｈａｓ ｎｏｔ ｂｅｅｎ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ ｒｉｇｏｒｏｕｓｌｙ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｌａｓｔｉｄ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａ ａｎｄ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｏｆ ｐｌｏｉｄｙ ｌｅｖｅｌ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｓｅ ｔａｘａ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ
ｐｕｔａｔｉｖｅ ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｏｒｉｇｉｎ. Ｂｏｔｈ Ａ􀆰 ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ ａｎｄ Ａ􀆰 ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ ｔｏ ｂｅ ｌｉｋｅｌｙ ａｕｔｏｔｅｔｒａｐｌｏｉｄ ｍｅｍｂｅｒｓ
ｏｆ ｔｈｅ Ａ􀆰 ｎｏｒｍａｌｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓꎬ ｗｅ ａｃｃｅｐｔ ｔｈａｔ
Ａ􀆰 ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ ｓｈｏｕｌｄ ｂｅ ｔｒｅａｔｅｄ ａｓ ａ ｓｙｎｏｎｙｍ ｏｆ Ａ􀆰 ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ ｉｎ ｔｈｅ Ｅｎｇｌｉｓｈ ｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ Ｆｌｏｒａ ｏｆ Ｃｈｉｎａ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅꎻ Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅꎻ Ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ＤＮＡꎻ ｐｇｉＣꎻ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎꎻ Ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ ｏｒｉｇｉｎ
　 多倍化 (ｐｏｌｙｐｌｏｉｄ) 的物种在维管植物中十
分丰富 (Ｂｅｃｋ等ꎬ ２０１０)ꎬ 而蕨类植物的多倍体
比例在植物界是最高的 ( Ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｅｅｄｅ 等ꎬ
２００３)ꎬ 其中铁角蕨科 (Ａｓｐｌｅｎｉａｃｅａｅ) 的铁角蕨
属 Ａｓｐｌｅｎｉｕｍ就是一个典型的例子ꎮ 据统计ꎬ 铁
角蕨属植物 ７００ 多个物种中就有超过 ７０％的物
种是多倍体种 (Ｗａｎｇꎬ １９８８ꎻ Ｗａｎｇ 等ꎬ ２００３)ꎮ
多倍体常常与杂交相伴随ꎬ 二者的作用常导致
形成具有复杂的网状进化 ( ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ)
关系的复合体类群 ( ｓｐｅｃｉｅｓ ｃｏｍｐｌｅｘ) ( Ｇｒａｎｔꎬ
１９８１ꎻ 洪德元ꎬ １９９０)ꎮ 由于多倍化是不可逆的ꎬ
因此ꎬ 多倍体复合体类群的研究对于分析进化、
系统发育和植物地理问题具有特别重要的价值
(Ｓｏｌｔｉｓ等ꎬ ２０１０)ꎮ
植 物 分 类 与 资 源 学 报　 ２０１４ꎬ ３６ (１): ７~１２
Ｐｌａｎｔ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 ＤＯＩ: １０.７６７７ / ｙｎｚｗｙｊ２０１４１３０１６
∗ 通讯作者: Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｊｉｅｌｉ＠ ｘｔｂｇ. ａｃ. ｃｎꎻ
收稿日期: ２０１３－０１－３１ꎬ ２０１３－０３－２８接受发表
作者简介: 常艳芬 (１９８０－) 女ꎬ 博士ꎬ 主要从事植物分类与植物系统发育研究ꎮ Ｅ￣ｍａｉｌ: ｃｙｆ＠ ｘｔｂｇ. ｏｒｇ. ｃｎ
江苏铁角蕨 ( Ａ􀆰 ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ Ｃｈｉｎｇ ＆ Ｙ. Ｘ.
Ｊｉｎ) 作为新种最初发表于江苏植物志 (江苏植
物研究所ꎬ １９７７)ꎮ 中国植物志 (吴兆洪ꎬ １９９９)
没有收录江苏铁角蕨ꎬ 而是收录了形态特征与江
苏铁角蕨比较相似的庐山铁角蕨 (Ａ􀆰 ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ
Ｃｈｉｎｇ ＆ Ｓ.Ｈ. Ｗｕ)ꎬ 据中国植物志的记录ꎬ 庐山
铁角蕨只分布于江西和湖南ꎮ 英文版的中国植物
志 (Ｌｉｎ和 Ｖｉａｎｅꎬ ２０１２) 则把庐山铁角蕨处理为
江苏铁角蕨的异名ꎬ 而且认为江苏铁角蕨与倒挂
铁角蕨 ( Ａ􀆰 ｎｏｒｍａｌｅ Ｄ. Ｄｏｎ) 之间的关系复杂ꎬ
所以它的分布范围可能更为广泛ꎮ 倒挂铁角蕨分
布于东非ꎬ 马达加斯加ꎬ 印度ꎬ 东亚至东南亚热
带ꎬ 东部延伸到太平洋岛屿的夏威夷ꎬ 北部到中
国中部及日本 (吴兆洪ꎬ １９９９)ꎬ 目前认为该物
种是组成黑茎铁角蕨类群 ( Ｂｌａｃｋ ｓｔｅｍｍｅｄ
ｓｐｌｅｅｎｗｏｒｔｓ) 的一个复杂的复合体种 (Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ
等ꎬ ２００４ꎬ ２００５ꎻ Ｃｈａｎｇ 等ꎬ ２０１３)ꎬ 但该复合体
种的组成成员及其分类还有待研究ꎮ 目前认为倒
挂铁角蕨复合体种可能包括被处理为种或亚种的
倒挂铁角蕨 Ａ. ｎｏｒｍａｌｅ ( ＝Ａ. ｎｏｒｍａｌｅ ｖａｒ. ｎｏｒｍａｌｅ)ꎬ
Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ (Ｏｈｗｉ ｅｘ Ｓａ. Ｋｕｒａｔａ) Ｎａｋａｉｋｅ( ＝Ａ. ｎｏｒ￣
ｍａｌｅ ｖａｒ. ｂｏｒｅａｌｅ Ｏｈｗｉ ｅｘ Ｓａ. Ｋｕｒａｔａ) 和 Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ
(Ｈ.Ｉｔｏ) Ｎａｋａｉｋｅ ( ＝Ａ. ｎｏｒｍａｌｅ ｖａｒ. ｓｈｉｍｕｒａｅ Ｈ.Ｉｔｏ)
(Ｋｕｒａｔａꎬ １９６３ꎻ Ｉｔｏꎬ １９７２ꎻ Ｎａｋａｉｋｅꎬ １９９２ꎻ Ｉｗａｔｓｕ￣
ｋｉꎬ １９９５)ꎬ 以及产于日本的 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ Ｂａｋｅｒ
(Ｍａｔｓｕｍｏｔｏꎬ １９７５ꎻ Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ 等ꎬ ２００３) 和产于
中国中部的江苏铁角蕨和庐山铁角蕨 (吴兆洪ꎬ
１９９９ꎻ Ｌｉｎ 和 Ｖｉａｎｅꎬ ２０１２)ꎮ 所以ꎬ 阐明江苏铁
角蕨和庐山铁角蕨的种间关系及其系统位置有助
于对倒挂铁角蕨复合体的进一步研究ꎮ
本研究对 ４ 个叶绿体 ＤＮＡ 片段 ( ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦꎬ
ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲꎬ ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ、 ｒｂｃＬ) 和一个单拷贝核基
因 ｐｇｉＣ片段进行研究ꎬ 并综合使用流式细胞分
析的方法推测分类群的细胞倍性ꎬ 来共同分析江
苏铁角蕨的系统位置及其与庐山铁角蕨和其他倒
挂铁角蕨复合体类群组成成员间的关系ꎬ 并探讨
该类群可能的多倍体起源方式ꎮ
１　 材料和方法
１􀆰 １　 样品采集
江苏铁角蕨和庐山铁角蕨分别采自江苏宜兴和江西
庐山ꎮ 用于本研究的相关类群的实验材料信息见表 １ꎬ
凭证标本保存于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆
(ＨＩＴＢＣ)ꎮ
１􀆰 ２　 流式细胞分析
使用 Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６流式细胞仪 (Ａｃｃｕｒｉ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒｓꎬ Ｉｎｃ.ꎬ
Ａｎｎ Ａｒｂｏｒꎬ ＭＩꎬ ＵＳＡ) 对江苏铁角蕨、 庐山铁角蕨和二
倍体的 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ的基因组含量进行测量ꎮ 使用大
豆 Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ (Ｌ.) Ｍｅｒｒ.(１􀆰 １３ ｐｇ / Ｃ) 作为内参照ꎬ 取
实验样品植物的健康幼叶约 １ ｃｍ２ꎬ 洗净并去除所有孢
子囊后置于培养皿中ꎬ 加入 ０􀆰 ５ ｍＬ核分离缓冲液ꎬ 用锋
利的刀片将叶片充分切碎ꎬ 再用 ３０ 目网孔 ( Ｐａｒｔｅｃꎬ
Ｍｕｅｎｓｔｅｒꎬ Ｎｏｒｄｒｈｅｉｎ￣Ｗｅｓｔｆａｌｅｎꎬ Ｇｅｒｍａｎｙ) 的尼龙网过滤ꎬ
过滤液里加入用核分离缓冲液制备的 １００ μＬ荧光染料碘
化丙啶 (ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅꎬ ＰＩ) 于 ４ ℃冰箱放置 ３０ ｍｉｎꎬ
再用 Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６流式细胞仪检测核 ＤＮＡ 的 Ｃ 值 (Ｄｏｌｅｚｅｌ
等ꎬ ２００７)ꎮ 每次分析均使用内参照ꎬ 每个样品重复 ５次
分析取平均值ꎮ
１􀆰 ３　 分子系统发育分析
材料野外采集后用硅胶迅速干燥ꎬ 采用 ３ Ｘ ＣＴＡＢ
(Ｄｏｙｌｅ 和 Ｄｏｙｌｅꎬ １９８７) 法提取总 ＤＮＡꎮ 用 ４ 对引物
(表 ２) 对叶绿体基因的 ４ 个区段 ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ、 ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ、
ｒｂｃＬ和 ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲ进行扩增ꎬ 扩增反应体积为 ２０ μＬꎬ 扩
增程序为: ９４ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎬ ９５ ℃ １ ｍｉｎ变性ꎬ ４０~６０ ℃
引物退火 １ ｍｉｎꎬ 循环反应 ３５个重复后 ７２ ℃延伸 ８ ｍｉｎꎮ
扩增产物直接送到测序公司测序ꎮ 用于核基因 ｐｇｉＣ 的
ＰＣＲ扩增反应与扩增叶绿体基因片段的相同ꎬ 引物见表
２ꎮ 核基因 ｐｇｉＣ 扩增后选择最优一份 ＰＣＲ 产物进行克
隆ꎬ 每个个体选取 ５~１０份阳性克隆进行测序ꎮ
叶绿体基因片段测序所得 ＤＮＡ序列使用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ软
件进行序列比对ꎬ 之后通过手工调整完成校对ꎮ 克隆产
物的测序结果得到后ꎬ 对每个个体的所有 ｐｇｉＣ 序列进行
多序列比对的对位排列 (Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ)ꎬ 去除相同及嵌套基
因的序列后剩余的序列单独形成一个可以分析的序列矩
阵ꎬ 用 ＰＡＵＰ４􀆰 ０的最大简约法 (Ｓｗｏｆｆｏｒｄꎬ ２００２) 对其进
行系统发育分析ꎬ 从得到的系统树选取不同的基因型ꎬ
手工修正其中由于 ＰＣＲ扩增过程中产生错误阅读造成的
可疑位点ꎬ 获得最终的一致序列用于系统发育树的构建ꎮ
系统发育分析用 ＰＡＵＰ４􀆰 ０ 的最大简约法ꎬ ＰｈｙＭＬ ３􀆰 ０
(Ｇｕｉｎｄｏｎ 等ꎬ ２０１０) 的最大似然法和 ＭｒＢａｙｅｓ ３􀆰 １􀆰 ２
(Ｈｕｅｌｓｅｎｂｅｃｋ和 Ｒｏｎｑｕｉｓｔꎬ ２００１) 的贝叶斯分析来来进行ꎮ
简约性 (Ｐａｒｓｉｍｏｎｙ) 分析采用如下分析完成ꎬ 即树二组
重新连接 ＴＢＲ、 启发式搜索 (Ｈｅｕｒｉｓｔｉｃ ｓｅａｒｃｈ)、 多重性
选择 ＭμＬＰＡＲＳ、 ＡＣＣＴＲＡＮ优化和 １００ 次随机附加的重
复ꎬ 用自展法 (Ｂｏｏｔｓｔｒａｐ Ａｎａｌｙｓｉｓ) 检验系统树ꎬ 自展数
为 １ ０００次重复ꎮ 最大似然法分析使用 ＰｈｙＭＬ ３􀆰 ０的默认
值进行ꎮ 贝叶斯分析的最佳模型使用 ｊＭｏｄｅｌＴｅｓｔ (Ｐｏｓａｄａꎬ
２００８) 的 ＡＩＣ (Ａｋａｉｋｅꎬ １９７４) 标准算法获得ꎮ
８　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
表 １　 用于研究的样品采集和序列信息
Ｔａｂｌｅ １　 Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｌｏｃａｌｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ
物种名称 Ｓｐｅｃｉｅｓ 采集地点 Ｌｏｃａｌｉｔｙ 叶绿体基因序列号 Ｇｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ:ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ / ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ / ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲ / ｒｂｃＬ
核基因 ｐｇｉＣ序列号
Ｇｅｎｂａｎｋ ｎｕｍｂｅｒ ｆｏｒ ｐｇｉＣ
江苏铁角蕨 Ａ. ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ１ 江苏宜兴 Ｙｉｘｉｎｇꎬ Ｊｉａｎｇｓｕ ＪＱ７２４２００ / ＪＱ７２４２８４ / ＪＱ７２４２４１ / ＪＸ１５２７３５
江苏铁角蕨 Ａ. ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ２ 江苏宜兴 Ｙｉｘｉｎｇꎬ Ｊｉａｎｇｓｕ ＪＸ２３７４８７ / ＪＸ２３７４８８
庐山铁角蕨 Ａ. ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ１ 江西庐山 Ｌｕｓｈａｎꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ＪＱ７２４２２４ / ＪＱ７２４３０９ / ＪＱ７２４２６６ / ＪＸ１５２７３８ ＪＸ２３７４７３ / ＪＸ２３７４７４
庐山铁角蕨 Ａ. ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ２ 江西庐山 Ｌｕｓｈａｎꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ
Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ１ 日本 Ｊａｐａｎ ＪＱ７２４２２５ / ＪＱ７２４３１０ / ＪＱ７２４２６７ / ＪＸ１５２７５１ ＪＸ２３７４７５
Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ２ 日本 Ｊａｐａｎ
倒挂铁角蕨 Ａ. ｎｏｒｍａｌｅ１ 福建武夷山 Ｗｕｙｉｓｈａｎꎬ Ｆｕｊｉａｎ ＪＱ７２４２１０ / ＪＱ７２４２９４ / ＪＱ７２４２５１ / － ＪＸ２３７５２１
倒挂铁角蕨 Ａ. ｎｏｒｍａｌｅ２ 浙江雁荡山Ｙａｎｄａｎｇｓｈａｎꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＪＱ７２４２１４ / ＪＱ７２４２９８ / ＪＱ７２４２５５ / ＪＸ１５２７４９ ＪＸ２３７５１１ / ＪＸ２３７５１２
Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ１ 云南贡山 Ｇｏｎｇｓｈａｎꎬ Ｙｕｎｎａｎ ＪＱ７２４１９１ / ＪＱ７２４２７５ / ＪＱ７２４２３３ / ＪＸ１５２７４１ ＪＸ２３７５０７ / ＪＸ２３７５０８
Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ２ 云南昭通 Ｚｈａｏｔｏｎｇꎬ Ｙｕｎｎａｎ ＪＱ７２４１９２ / ＪＱ７２４２７６ / ＪＱ７２４２３４ / － ＪＸ２３７５２８ / ＪＸ２３７５２９
Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ１ 广东鼎湖山Ｄｉｎｇｈｕｓｈａｎꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ＪＱ７２４２０９ / ＪＱ７２４２９３ / ＪＱ７２４２５０ / － ＪＸ２３７５０１ / ＪＸ２３７５０２
Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ２ 浙江杭州 Ｈａｎｇｚｈｏｕꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＪＱ７２４２１３ / ＪＱ７２４２９７ / ＪＱ７２４２５４ / ＪＸ１５２７３９ ＪＸ２３７４７７ / ＪＸ２３７４７８
表 ２　 扩增叶绿体基因和核基 ＤＮＡ片断的引物
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ａｍｐｌｉｆｙ ｆｏｕｒ ｒｅｇｉｏｎｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｇｅｎｏｍｅ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｇｉＣ
引物 Ｐｒｉｍｅｒ 正向引物 Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｅｒ (５′－３′) 反向引物 Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｅｒ (３′－５′) 来源 Ｓｏｕｒｃｅ
ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ ＧＧＣＡＧＣＣＣＣＣＡＲＡＴＴＣＡＧＧＲＡＡＣＣ ＡＴＴＴＧＡＡＣＴＧＧＴＧＡＣＡＣＧＡＧ Ｔａｂｅｒｌｅｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９１ꎻＴｒｅｗｉｃｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２
ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ ＡＴＧＴＣ [ＡＣ] ＣＧＴＴＡ [ＣＴ] ＣＧＡＧＧ[ＡＧ] ＣＣＴＣＧＴ ＴＡＣＣＧＡＧＧＧＴＴＣＧＡＡＴＣ Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５
ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲ ＧＣＧＧＧＴＡＴＡＧＴＴＴＡＧＴＧＧＴＡＡ ＣＴＡＴＣＣＡＴＴＡＧＡＣＧＡＴＧＧＡＣＧ Ｇｒｕｓｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００９
ｒｂｃＬ ＣＴＴＣＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＡＣＴ ＣＣ
ＡＴＧＴＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡ (Ｇ / Ａ)
ＡＧＡＣＴＡＡＡ ＧＣ
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５ꎻ
Ｅｂｉｈａｒａꎬ Ｎｉｔｔａ ＆ Ｉｔｏꎬ ２０１０
ｐｇｉＣ ＴＧＧＧＴＣＴＴＴＴＧＡＧＴＧＴＴＴＧＧ ＣＡＴＴＧＣＴＴＴＣＣＡＴＡＣＴＡ Ｊａｍｅｓ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８
　 　 对叶绿体基因片段 ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ、 ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ、 ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲ
和 ｒｂｃＬ的序列数矩阵进行联合分析ꎬ 外类群的选取根据
Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ等 (２００５) 对倒挂铁角蕨的姐妹类群 Ｄｉｅｌｌｉａ属
的研究结果选取代表铁角蕨属黑茎铁角蕨分支的另外几
个类群ꎬ 包括: Ａ. ｍｏｎａｎｔｈｅｓ 复合体 ( Ａ. ｆｏｒｍｏｓｕｍꎬ Ａ.
ｍｏｎａｎｔｈｅｓꎬ Ａ. ｒｅｓｉｌｉｅｎｓ)ꎬ 铁角蕨 Ａ. ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ 复合体
(Ａ. ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ ｓｕｂｓｐ. ｉｎｅｘｐｅｃｔａｎｓꎬ Ａ. ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ ｓｕｂｓｐ.
ｑｕａｄｒｉｖａｌｅｎｓꎬ Ａ. ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ ｓｕｂｓｐ. ｔｒｉｃｈｏｍａｎｅｓ)ꎬ 欧亚铁
角蕨 Ａ. ｖｉｒｉｄｅ以及 Ａ. ×ｌａｕｉｉꎮ 用于分析核基因 ｐｇｉＣ片段的
外类群选取与倒挂铁角蕨亲缘关系密切并已有序列提交
ＧｅｎＢａｎｋ的欧亚铁角蕨 (Ｊａｍｅｓ等ꎬ ２００８)ꎮ
２　 研究结果
２􀆰 １　 流式细胞分析
流式细胞分析的结果 (图 １) 显示: 江苏铁
角蕨的 Ｃ值为 １８􀆰 ２８ ｐｇ / ２Ｃꎬ 庐山铁角蕨的 Ｃ值为
１８􀆰 ２５ ｐｇ / ２Ｃꎬ 日本产的二倍体 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ Ｃ
值为 ９􀆰 ０４ ｐｇ / ２Ｃꎮ 与 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ 相比ꎬ 江苏
铁角蕨和庐山铁角蕨的细胞倍性可能为四倍体ꎮ
２􀆰 ２　 叶绿体基因序列构建的进化树结果分析
四条叶绿体 ＤＮＡ片段 ( ｔｒｎＬ￣ｔｒｎＦ、 ｔｒｎＧ￣ｔｒｎＲ、
ｒｐｓ４￣ｔｒｎＳ以及 ｒｂｃＬ) 的整合序列长度共 ４ １５５ ｂｐꎬ
总计有 ２３８个变异位点ꎬ 其中 １６２个变异位点为
信息位点ꎮ 然而江苏铁角蕨和庐山铁角蕨的叶绿
体 ＤＮＡ片段序列仅有 ５ 个变异位点的差异ꎬ 这
一结果显示了二者在遗传上不存在种间差异ꎬ 应
该为同一个物种ꎮ
对整合的 ４ 条叶绿体 ＤＮＡ 片段的序列数据
矩阵使用 ＰＡＵＰ４􀆰 ０ 的最大简约分析ꎬ ＰｈｙＭＬ ３􀆰 ０
的最大似然分析和 ＭｒＢａｙｅｓ３􀆰 １􀆰 ２ 的贝叶斯分析
得到的系统发育树的拓扑结构是一致的ꎬ 得到支
持率较好的 ５ 个分支 (图 ２)ꎬ 并与外类群聚成
姐妹类群ꎮ 五个分支中的 ４个分支分别包含了倒
挂铁角蕨ꎬ Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ、 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ和日本的 Ａ. ｏｌｉ￣
ｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ几个类群ꎬ 而江苏铁角蕨和庐山铁角
９１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 常艳芬等: 江苏铁角蕨的系统位置和多倍体起源　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
蕨聚在了同一个进化支中ꎮ 这一结果支持倒挂铁
角蕨复合体是一个独立的由几个物种组成的复合
体种ꎮ
２􀆰 ３　 核基因 ｐｇｉＣ序列构建的进化树结构分析
测序得到的核基因 ｐｇｉＣ的序列长度为 ６４５ ~
７３７ ｂｐꎬ 在 ２６３和 ５６４ ｂｐ 处分别有一个 ２３ ｂｐ 和
９２ ｂｐ的长片段插入ꎬ 总计有 ９３个变异位点ꎬ 其
图 １　 流式细胞分析日本产的 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ、 江苏铁角蕨与
庐山铁角蕨的荧光信号图谱比较ꎬ 箭头表示为内参照
Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘꎬ ｃｏｕｎｔ为细胞核数目
Ｆｉｇ.１　 Ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌｏｉｄｙ ｆｏｒ Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍꎬ
Ａ. ｋｉａｎｇｓｕｅｎｓｅ ａｎｄ Ａ. ｇｕｌｉｎｇｅｎｓｅ ｗｉｔｈ ＤＮＡ ｃｏｎｔｅｎｔ ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｓｔａｎｄａｒｄ ｏｆ Ｇｌｙｃｉｎｅ ｍａｘ (ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ
ｔｈｅ ａｒｒｏｗｓ)ꎻ ｃｏｕｎｔ ＝ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉ
中有 ５５ 个变异位点为信息位点ꎮ 最大简约性、
最大似然和贝叶斯分析得到拓扑结构一致的系统
发育树ꎬ 显示几个支持率较好的分支 (图 ３)ꎬ
其中倒挂铁角蕨、 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ和 Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ的不同
拷贝同时聚在相同的分支中ꎬ 显示这 ３个种间存
在杂交和基因重组ꎮ 江苏铁角蕨和庐山铁角蕨均
具有两个不同的拷贝ꎬ 相似的两个拷贝分别聚在
了同一个分支中ꎬ 结果显示这一类群与其他的基
因组不存在杂交重组ꎮ
３　 讨论
３􀆰 １　 江苏铁角蕨与庐山铁角蕨的关系
通过仔细对比江苏铁角蕨和庐山铁角蕨的模
式标本 (ＰＥ: ０７０１６４ꎻ ＮＡＳ: ７５０１４) 和原始文献
描述 (江苏植物研究所ꎬ １９７７ꎻ 吴兆洪ꎬ １９８９)ꎬ
我们发现这两个种在根状茎鳞片、 叶柄、 羽片、
叶脉及孢子囊群形态特征上均比较相似ꎮ 本研究
通过流式细胞分析发现两个种的基因组大小基本
一致ꎬ 分别为 １８􀆰 ２５ ｐｇ / ２Ｃ 和 １８􀆰 ２８ ｐｇ / ２Ｃꎮ 对 ４
个叶绿体 ＤＮＡ片段及一个核基因片段的测序表
明江苏铁角蕨和庐山铁角蕨序列信息基本一致ꎮ
上述研究结果均支持英文版中国植物志对该类群
的处理ꎬ 即把庐山铁角蕨处理为江苏铁角蕨的异
名 (Ｌｉｎ和 Ｖｉａｎｅꎬ ２０１２)ꎮ
３􀆰 ２　 江苏铁角蕨的系统位置
分子系统发育的研究结果显示倒挂铁角蕨、
Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ、 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ、 日本产的 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ、
江苏铁角蕨和庐山铁角蕨聚成了一个独立的分
支ꎮ 这一结果支持倒挂铁角蕨复合体是由几个物
种组成的复合体种 (Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ 等ꎬ ２００４ꎬ ２００５)ꎮ
江苏铁角蕨与庐山铁角蕨均聚在了倒挂铁角蕨复
合体的分支中ꎬ 显示江苏铁角蕨和庐山铁角蕨为
组成倒挂铁角蕨复合体的成员之一ꎮ
在形态特征上ꎬ 江苏铁角蕨和庐山铁角蕨与
Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ比较相似ꎬ 二者都是组成倒挂铁角蕨复
合体的成员中唯一没有在叶片上生成无性繁殖的
芽孢的两个类群ꎮ 本文分子系统发育的研究结果
也支持江苏铁角蕨和庐山铁角蕨与 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ之间
存在杂交现象且关系较近ꎮ 然而ꎬ 我们的研究结
果也显示了这一类群与日本产的 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ
之间也存在较近的亲缘关系 (图 ２)ꎬ 支持 Ｍａｔｓｕ￣
ｍｏｔｏ等 (２００３) 认为 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ和 Ａ. ｏｌｉｇｏｐｈｌｅｂｉｕｍ
０１　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷
图 ２　 对叶绿体基因片段序列数据进行最大似然法分析得到的系统发育树ꎮ 系统发育分析的支持率表示顺序为:
最大简约法和最大似然法的靴带支持率 (ＭＰ / ＭＬ) 和贝叶斯分析得到的后验率
Ｆｉｇ.２　 Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ ｄａｔａｓｅｔ. Ｎｏｄｅ ｓｕｐｐｏｒｔ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｆｏｒ ａｌｌ ｔｈｒｅｅ ａｎａｌｙｓｅｓ: ｍａｘｉｍｕｍ
ｐａｒｓｉｍｏｎｙ / ｍａｘｉｍｕｍ ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ / Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
图 ３　 对核基因 ｐｇｉＣ 序列进行最大似然法分析得到的系统发育
树ꎮ 系统发育分析的支持率表示顺序为: 最大简约法、 最大似
然法的靴带支持率 (ＭＰ / ＭＬ) 和贝叶斯分析得到的后验率
Ｆｉｇ.３　 Ｍａｘｉｍｕｍ Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｐｇｉＣ. Ｎｏｄｅ ｓｕｐ￣
ｐｏｒｔ ｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｆｏｒ ａｌｌ ｔｈｒｅｅ ａｎａｌｙｓｅｓ: ｍａｘｉｍｕｍ ｐａｒｓｉｍｏｎｙ / ｍａｘｉｍｕｍ
ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ / Ｂａｙｅｓｉａｎ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ ｉｎ ｂｏｏｔｓｔｒａｐ ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ ａｎｄ ｐｏｓｔｅｒｉｏｒ
ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｉｅｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. － ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｖａｌｕｅ ｕｎｄｅｒ ５０％
之间存在杂交现象的观点 (Ｍａｔｓｕｍｏｔｏꎬ １９７５ꎻ
Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等ꎬ ２００３)ꎮ
３.３　 江苏铁角蕨的多倍体起源
蕨类植物同大多数种子植物一样ꎬ 叶绿体基
因的遗传物质是母性遗传 (Ｇａｓｔｏｎｙ和 Ｙａｔｓｋｉｅｖｙｃｈꎬ
１９９２ꎻ Ｖｏｇｅｌ等ꎬ １９９８)ꎬ 而核基因揭示的是双亲
遗传物质的来源ꎬ 它具有来自不同起源亲本的不
同拷贝ꎬ 这些拷贝会分布在核基因构建的系统发
育树的不同分支中ꎬ 形成在系统发育树上重复出
现的分类群名称ꎮ 所以ꎬ 通过比较分析两个基因
组即叶绿体基因片段和核基因构建的系统树的拓
扑结构的差异ꎬ 可以推测其多倍体类群可能的母
本和父本遗传物质的来源ꎮ
　 　 倒挂铁角蕨四倍体类群的不同拷贝同时和
Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ以及 Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ的拷贝聚在相同的分支
中ꎬ 显示这几个类群间存在遗传物质的交流ꎬ 为异
源多倍体ꎮ 这一结论支持Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ等 (２００３) 的
观点ꎬ 认为倒挂铁角蕨、 Ａ. ｂｏｒｅａｌｅ和 Ａ. ｓｈｉｍｕｒａｅ
间存在自然杂交的现象ꎮ 确定江苏铁角蕨和庐山
铁角蕨的细胞倍性还需要细致的细胞学的研究ꎬ
我们通过流式细胞分析ꎬ 初步认为这一类群可能
为四倍体ꎮ 江苏铁角蕨和庐山铁角蕨分别具有两
个不同的拷贝ꎬ 其中相似的两个拷贝两两聚在了
一个分支中ꎬ 显示这一类群可能是同源多倍体ꎬ 与
其他基因组可能不存在杂交重组ꎮ 但是ꎬ 由于可能
存在谱系分选事件及基因拷贝丢失的影响ꎬ 该类群
多倍体的起源方式的确定还需要引入更多的核基
因片段建立多个系统发育树来进行比较研究ꎮ
１１１期　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 常艳芬等: 江苏铁角蕨的系统位置和多倍体起源　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　
〔参　 考　 文　 献〕
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２１　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 植 物 分 类 与 资 源 学 报　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 第 ３６卷