全 文 ：小桐子的组织培养和植株再生?
秦 虹1 ,2 , 宋松泉1
??
, 龙春林3 , 程红焱4
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 , 云南 勐腊 666303; 2 云南农业大学园林园艺学院 , 云南 昆明 650201;
3 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204; 4 中国科学院植物研究所 , 北京 100093)
摘要 : 以小桐子 ( Jatropha curcas) 的胚芽、子叶、下胚轴、叶柄、叶片和茎段作为外植体 , 用不同浓度的
6-苄基腺嘌呤 (6-BA) 和α-萘乙酸 (NAA) 对其进行愈伤组织的诱导和植株再生的研究。结果表明 : 在 MS
培养基中加入 5 .0 mg?L 6-BA 和 1 .0 mg?L NAA 对愈伤组织的诱导效果最好 ; 加入 5 .0 mg?L 6-BA 和 0 .1 mg?L
NAA 对不定芽的诱导最为有效 , 加入 0 .1 mg?L 6-BA 和 1 .0 mg?L NAA 有利于芽的生长 ; 加入 1 .0 mg?L NAA
的 1?2 MS 培养基对生根最为有利。
关键词 : 小桐子 ; 种子 ; 外植体 ; 组织培养 ; 愈伤组织
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)06 - 649 - 04
Tissue Culture and Plant Regeneration of J atropha
curcas (Euphorbiaceae)
QIN Hong1 , 2 , SONG Song-Quan1 * * , Long Chun-Lin3 , CHENG Hong-Yan4
(1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Mengla 666303 , China;
2 Collegeof Landscapeand Gardening, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 , China;
3 Kunming Instituteof Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204 , China;
4 Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093 , China)
Abstract: In this paper, plumules, cotyledons, hypocotyls, leaf blades, petioles and stalks of physic nut ( Jatropha
curcas L .) were used as explants, and callus induction and plant regeneration were studied on MS medium contained dif-
ferent concentrations of 6-BA and NAA . The results showed that the MS mediumwith 5 .0 mg?L BA and 1 .0 mg?L NAA
wasthe best for callus induction, and with 5 .0 mg?L BA and 0 .1 mg?L NAA , for formation of adventitious buds, and
with 1 .0 mg?L BA and 1 .0 mg?L NAA , for bud growth, and that 1?2 MS mediumwith 1.0 mg?L NAA was the best for
formation and growth of adventitious roots .
Key words: Callus; Explant; J atropha curcas L .; Seed; Tissue culture
小桐子 ( Jatropha curcas L .) , 又名麻疯树、
膏桐 ( 云南 )、黄肿树 (广东 ) 、假花生 ( 广西 )、
桐油树 ( 台湾 )、南洋油桐 ( 日本 ) , 为大戟科
(Euphorbiaceae) 麻疯树属半肉质的小乔木或大灌
木 ( 林娟等 , 2004 ) , 原产中美洲 , 现分布于非
洲、拉丁美洲和亚洲 , 绝大多数生长在美洲和亚洲
的热带地区 , 在我国主要分布于云南、四川、贵
州、广西、广东及台湾等地区 (钟志权 , 1984)。野
生小桐子种仁的最高含油量约为 60% , 超过油菜和
大豆等常见的油料作物; 用小桐子种子生产的新
型燃料可适用于各种柴油发动机 , 并在闪点、凝
固点、硫含量、一氧化碳排放量、颗粒值等关键
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (6) : 649～652
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence . E - mail : sqsong@ xtbg. org. cn; Tel : 0691 - 8715474
收稿日期 : 2006 - 07 - 12 , 2006 - 08 - 30 接受发表
作者简介 : 秦虹 ( 1980 - ) 女 , 硕士研究生 , 主要从事生物质能源的研究。 ?
基金项目 : 国家发展改革委员会产业化项目 ; 中国科学院知识创新工程重要方向性项目 ( KSCX2-SW-117 ) , 中国科学院“百人
计划”项目 , 科技部国家科技基础条件平台工作项目 (2004DKA30430 )
指标上均优于国内零号柴油 ; 而且这种“生物柴
油”除了更加清洁和高效外 , 还具有加工成本低
廉以及可再生的优势 (邓志军等 , 2005; Heller,
1996; The national Oilseeds and Vegetable Oils De-
velopment Board, 2004 - 2005; Openshaw, 2000;
Augustus等 , 2002) 。此外 , 小桐子还具有很强的
抗旱、耐贫瘠的习性 , 能在环境较差的土壤中生
长而不与作物竞争耕地 , 因此 , 小桐子是目前公
认的一种具有产业化应用前景的能源植物。
目前 , 小桐子的产量较低和适宜种植区域狭
窄 , 严重地制约了其产业化的发展。因此 , 选育
高产、优质和抗逆性强的新品种以及随后的快速
繁育就成为生物柴油发展的重要条件。林娟等
(2002) , 陆伟达等 (2003 ) , Wei 等 ( 2004) 曾以
种胚、子叶、下胚轴 , 叶柄和叶片及上胚轴作为
外植体 , 利用 不同 浓度 的 6-BA 和吲 哚丁 酸
( IBA) 激素配比的培养基 , 进行了小桐子的组织
培养及植株再生 , 但在愈伤组织的诱导率和诱导
速率、芽和根的分化率和分化速率等方面都有待
提高。本文以小桐子的胚芽、子叶、叶片 ( 嫩
叶 )、叶柄和茎段 (未木质化的枝条 ) 为外植体 ,
利用不同 6-BA 和 NAA 激素配比的培养基 , 研究
了不同激素配比对不同外植体的愈伤组织的诱导
以及芽和根的分化的影响 , 试图为高产、优质和
抗逆性强的新品种的快速繁育和转基因植物提供
技术参数。
1 材料和方法
1 .1 材料
小桐子的种子、叶片 (嫩叶 )、叶柄和茎段 (未木
质化的枝条 ) 均采自西双版纳勐腊县勐仑镇巴卡村寨
(21°41′N, 101°25′E ; 海拔 600～700 m)。
1 .2 方法
1 .2 .1 外植体的灭菌 ( a) 种子的灭菌 : 浸入 75% 酒
精中 2 min, 再放入 0 .1% HgCl2 溶液中 20 min, 无菌水冲
洗 4 次 ; 去掉种皮后 , 用 0.1% HgCl2 溶液灭菌 5 min, 再
用无菌水冲洗 4 次并浸泡 1 h后 , 剥去胚乳 ; ( b) 叶片的
灭菌 : 浸入 75%酒精中 1 min, 再放入 0 .1% HgCl2 溶液中
7 min, 无菌水冲洗 4 次 ; (c) 叶柄的灭菌 : 浸入 75%酒精
中 1 min, 再放入 0 .1% HgCl2 溶液中 10 min, 无菌水冲洗 4
次 ; (d) 茎段的灭菌 : 浸入 75% 酒精中 1 min, 再放入
0 .1% HgCl2 溶液中 15 min, 无菌水冲洗 4 次。
1 .2 .2 培养基配方 以下培养基均附加 3%蔗糖、0 .9%
琼脂 , pH 5 .8。
1 号 : MS+ BA 5 .0 mg?L + NAA 0 .1 mg?L
2 号 : MS+ BA 5 .0 mg?L + NAA 0 .5 mg?L
3 号 : MS+ BA 5 .0 mg?L + NAA 1 .0 mg?L
4 号 : MS+ BA 2 .5 mg?L + NAA 0 .1 mg?L
5 号 : MS+ BA 2 .5 mg?L + NAA 0 .5 mg?L
6 号 : MS+ BA 2 .5 mg?L + NAA 1 .0 mg?L
7 号 : MS+ BA 1 .0 mg?L + NAA 0 .1 mg?L
8 号 : MS+ BA 1 .0 mg?L + NAA 0 .5 mg?L
9 号 : MS+ BA 1 .0 mg?L + NAA 1 .0 mg?L
10 号 : MS+ BA 0 .1 mg?L + NAA1 .0 mg?L
11 号 : MS+ BA 0 .1 mg?L + NAA 0 .5 mg?L
12 号 : 1?2 MS + NAA 1 .0 mg?L
1 .2 .3 培养方法 ( a) 种子 : 将胚接种在 MS + 6-BA
2 .0 mg?L + NAA 1.0 mg?L + 活性炭 2 g的培养基上 , 在黑
暗下培养 3 d后 , 转入光照下培养 , 成苗后将子叶和下
胚轴分别接种在 3 号培养基上 , 依次进行愈伤组织的诱
导。培养温度为 24～28℃ , 光照强度为 45μmol m- 2 s- 1 ,
每天光照 12 h, 下同。 (b) 叶柄和叶片 : 将未木质化的
叶柄切成 1～2 cm的切段 , 将叶片切成 1～2 cm2 的小块 ,
分别接种在 2 号和 3 号培养基上 , 进行愈伤组织的诱导 ;
然后将诱导出的愈伤组织转入分化培养基上 , 进行丛芽
的诱导。 (c) 茎段 : 将带有节的茎段切下 , 接种在 9 号
和 11 号培养基上 , 进行腋芽的诱导。 ( d) 根的诱导 : 将
不定芽转移至 12 号培养基上进行生根培养。
2 结果
2 .1 培养基的筛选
把在 MS + 6-BA 2 .0 mg?L + NAA 1 .0 mg?L + 活
性炭 2 g的培养基上培养出的小苗取出 , 将子叶
和下胚轴分别接种在 1～9 号培养基上。结果表
明 , 子叶外植体在 1～8 号培养基上能形成愈伤
组织 ( 图 1: a) , 但形成愈伤组织的速率和随后
分化成不定芽的分化率不同 ( 表 1 )。例如 , 在 3
号培养基上愈伤组织的形成速率较快 , 但在随后培
养 60 d 后 , 没有不定芽的分化 ; 与 3 号培养基相
比 , 1 号和 2 号培养基上愈伤组织形成的速率较慢 ,
但培养 60 d后 , 可以分化出不定芽 (表 1, 图 1:
b) , 而且在培养过程中的污染率也较低; 在 9 号培
养基上不能形成愈伤组织 , 3 号培养基对诱导愈伤
组织最为有利 , 而 1 号培养基对诱导不定芽最为有
效。下胚轴外植体在 1～9 号培养基中的愈伤组
织形成和随后的不定芽分化的结果与子叶类似。
2 .2 生长和分化的情况
056 云 南 植 物 研 究 28 卷
2 .2 .1 胚芽的诱导 把无菌苗的胚芽切下 , 接
种在 11 号培养基上 , 大约 10 d后 , 插入培养基
的部分长出黄绿色的愈伤组织 , 随后在一部分愈
伤组织上长出白色的根系 , 在胚芽的顶部长出一
片真叶。继续培养约 30 d后 , 将顶芽从两片子
叶处切下 , 接种于 11 号培养基上 , 生长形成小
苗。切去顶芽的胚芽继续接种在 11 号培养基上 ,
培养 20 d后 , 会在切口处的两边长出新的芽。
2 .2 .2 子叶和下胚轴芽的诱导 从无菌苗上切
下子叶和下胚轴 , 将子叶切成 1 cm2 的小块 , 下
胚轴切成 2 cm长的切段 , 接种到 3 号培养基上。
子叶在 3 号培养基上培养 10 d后 , 在切口处逐渐
形成愈伤组织。培养 30 d后 , 将愈伤组织转至 1
号培养基上进行不定芽的诱导 , 20 d后可观察到
被诱导出的不定芽。
表 1 不同 6-BA 和 NAA 配比的培养基对子叶愈伤组织
形成和随后不定芽分化的影响
Table 1 Effects of mediawith different 6-BA and NAA concentrations
on callus formation and subsequently adventitious buds
differentiation from J atropha curcas cotyledons
形成愈 形成愈伤组 接种 30 Jd 接种 60 ?d后
培养基 伤组织 织的最初 后的污染 不定芽的分
( % ) 时间 ( d) 情况 化率 *( % )
1 ?100 Z17 ?+ 80
2 ?100 Z13 ?+ 20
3 ?100 Z10 ?+ + 0
4 ?100 Z16 ?+ + 20
5 ?100 Z20 ?+ + + + 0
6 ?100 Z16 ?+ + + 0
7 ?100 Z20 ?+ + + 0
8 ?100 Z20 ?+ + + 0
9 ?0 5- - 0
* 分化率为分化瓶数占总接种瓶数的百分比 ; 培养温度为 24～
28℃ , 光照强度为 45μmol m - 2 s- 1 , 每天光照 12 h
图 1 小桐子愈伤组织的诱导和植株再生。a, 愈伤组织 ; b, 由愈伤组织形成的不定芽 ; c, 不定芽生成的根
Fig . 1 Callus induction and plant regeneration of J atropha curcas L . a . calli; b . adventitious buds from calli ; c . root from adventitious buds
下胚轴在 3 号培养基上培养 15 d后 , 插入培
养基的下胚轴基部明显地膨胀 , 20 d后在基部产
生黄绿色的愈伤组织。随着培养时间的延长 , 黄
绿色的愈伤组织会逐渐变为透明 ; 将透明的愈伤
组织转至 1 号培养基上 , 透明的愈伤组织会逐渐
变为褐色并死亡。将下胚轴接种到 2 号培养基上 ,
培养 20 d后 , 在基部形成透明的愈伤组织 , 在切
段的上部会形成细小的白色愈伤组织 , 随着培养
时间的延长 , 白色的愈伤组织会分化出不定芽。
2 .2 .3 茎段、叶片和叶柄芽的诱导 将当年生
未木质化的茎段灭菌后切成小段 , 每段带有一个
节 , 接种到 9 号培养基上。大约 10 d后 , 在叶腋
处长出腋芽 , 而且在茎段的基部也长出愈伤组
织。将其形成的腋芽切下 , 接种于 9 号培养基 ,
形成小苗。
将经过灭菌的叶片切成 1 cm2 左右的小块 , 接
种于 3 号培养基上 , 培养约 20 d后 , 在切口处有愈
伤组织形成 ; 再培养 40 d, 将愈伤组织转至 1 号培
养基上 , 继续培养 30 d后 , 可诱导不定芽形成。
将经过灭菌的叶柄切成 1 cm左右的切段 ,
接种于 2 号培养基上。约 10 d后可观察到叶柄切
段的上部裂开 , 继续培养 15 d后 , 在裂开处逐
渐形成愈伤组织 , 此后愈伤组织不断膨大 ; 约
60 d后 , 在愈伤组织上有不定芽出现 ; 将产生的
不定芽切下并转至 10 号培养基上 , 剩余部分继
续放入原来的培养基中 , 可以继续产生不定芽。
2 .2 .4 芽的生长和生根 将分化产生的不定芽
转入 11 号培养基中 , 不定芽逐渐长大 ; 培养 30
d后 , 不定芽长到 2～3 cm; 然后转入 12 号培养
基 , 10 d后 , 不定芽基部膨大 , 在膨大的部分有
1566 期 秦 虹等 : 小桐子的组织培养和植株再生
白色的根系长出 ( 图 1: c) 。当小苗的根系长到
5 cm时 , 开始练苗 ; 把经过练苗的小苗洗去琼
脂 , 移栽到装有蛭石和腐植土 (1∶1 ) 的育苗钵
中 , 以渗透浇水的方式浇透水 , 生长情况良好。
3 讨论
关于小桐子的组织培养 , 在国内外仅有少量
的文献报道 ( 林娟等 , 2002; 陆伟达等 , 2003;
Sardana等 , 2000; Wei 等 , 2004 )。在这些仅有
的报道中 , 在以小桐子的子叶、下胚轴和真叶为
外植体进行组织培养和植株再生时都是采用不同
的 6-BA 和 IBA 配比的培养基 ( 林娟等 , 2002;
陆 伟 达 等 , 2003; Sardana 等 , 2000; Wei 等 ,
2004)。经本实验室的重复实验发现 , 6-BA 和
IBA 配比的培养基存在愈伤组织形成缓慢、愈伤
组织小、分化率低等问题。使用 6-BA 和 NAA 配
比的培养基 , 则愈伤组织形成的速率较快 , 愈伤
组织较大 , 并且分化率也相应地提高。
本文以小桐子的子叶和下胚轴为外植体 , 采
用MS + BA 5.0 mg?L + NAA 1 .0 mg?L 培养基 , 可以
较快地形成愈伤组织 , 在 MS + BA 5 .0 mg?L + NAA
0.1 mg?L 培养基上可以有效地诱导出不定芽 , 分
化率高达 80%。以胚芽、茎段、叶片和叶柄为外
植体 , 在合适的培养基上也成功地诱导出幼苗。
此外 , 用 75%酒精和 0 .1% HgCl2 灭菌不同
外植体的效果随时间延长而加强 ( 未表明数据 )。
值得注意的是 , 当灭菌时间较长时 , 外植体会受
到伤害 , 甚至死亡。
〔参 考 文 献〕
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