全 文 ：拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定*
李婉莎, 王春涛, 胡向阳**
(中国科学院昆明植物研究所, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 叶的极性建立直接决定叶的平展性发育, 极性改变导致叶形态异常, 影响植物体的各种正常生理活
动。 利用反向遗传学方法, 从拟南芥基因激活标签突变体库中分离到一个叶片边缘锯齿状表型的突变体
(命名为 pCB1294), 该突变体同时表现出叶表皮腺毛形态发育异常。 通过 Tail鄄PCR 方法成功定位突变基
因为 At5g41663, 该基因编码 miR319b基因。 Real time PCR 显示, pCB1294 突变体植株中 miR319b 基因的
表达量是野生型 (col) 植株的 11 倍多。 所得结果为进一步研究 miRNA 调控叶极性的分子机制和进一步
分析 miR319b与叶形态发生的关系奠定了基础。
关键词: 拟南芥; 突变体; 叶锯齿; Tail鄄PCR; miRNA
中图分类号: Q 75摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)01-028-05
Isolation and Identification of an Arabidopsis thaliana
Mutant with Serration Leaf Margin
LI Wan鄄Sha, WANG Chun鄄Tao, HU Xiang鄄Yang**
(Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: Leaf polarity determines leaf flatness development directly, and abnormal polarity usually results in many
abnormal leaves, which subsequently affects many physiological functions of plants. So the normal leaf development
is important to plants. Here, an abnormal serration leaf margin mutant with abnormal leaf trichome development,
named pCB1294, was isolated from an activation tagging Arabidopsis mutant pool through reverse genetics. By Tail鄄
PCR, the mutant gene loci At5g41663 encoding miR319b was successfully identified. Real time PCR shows the rela鄄
tive expression level of miR319b gene in the pCB1294 mutant is eleven times of higher than that of the wild (col) .
Our study lay the foundation for further studying the genetic mechanism of leaf polarity and investigating the interac鄄
tion between miR319b and leaf morphology.
Key words: Arabidopsis thaliana; Mutant; Leaf margin serration; Tail鄄PCR; miRNA
摇 叶是植物体的基本营养器官之一, 在植物
的生命活动中起着重要作用, 研究植物叶的发
生、 发育的分子机理, 是发育生物学的一个重要
课题。 叶片发育的阶段大致可分为: 叶原基的起
始和叶极性的建立 (Smith 和 Hake, 1992)。 叶
原基是在茎的顶端分生组织 (Shoot apical meri鄄
stem, SAM) 中形成的 (Scanlon, 2000; Hudson,
1999)。 叶极性的建立是叶发育的核心环节。
Tsukaya (2005) 的新细胞决定理论认为, 叶
边缘锯齿、 叶卷曲是某些直接或间接影响细胞分裂
或生长分化的基因突变造成的。 从叶形成的分子机
制上看, SAM细胞及周边细胞的发育形成叶原基,
叶原基产生极性分化并从细胞分裂状态转入细胞生
长阶段, 平展、 正常的叶片逐渐形成。 控制这一发
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (1): 28 ~ 32
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 11103
*
**
基金项目: 中国科学院百人计划项目与国家自然科学基金项目 (30871704, 30971452, 31170256)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: huxiangyang@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2011-07-05, 2011-10-15 接受发表
作者简介: 李婉莎 (1979-) 女, 硕士, 主要从事植物分子生物学和功能基因组学研究。
育进程的一系列基因的突变及影响细胞分裂、 生长
分化的因素都有可能使叶发育异常, 产生卷曲、 锯
齿状等异型叶片 (Huang, 2003; Tsukaya, 2005)。
近年来研究表明, miRNA在植物叶极性的分
化方面具有重要的调节作用。 Palatnik 等 (2003)
通过对 jaw鄄D 基因进行突变研究, 发现 miR319a
能通过靶向作用于 TCP转录因子基因家族来调控
植物叶形态建成。 miR319a 基因在芽顶端组织、
花器官和果实中表达, miR319a 基因过表达突变
体产生叶片卷曲、 花发育异常、 叶片偏上生长、
果实畸形等异常表型。 西红柿中, LA基因编码一
个包含 miR319 位点的 TCP 转录因子, miR319 通
过介导 LA 基因调控叶边缘细胞发育。 LA 表达水
平升高, 导致叶边缘发育异常化; 降低 LA表达水
平, 则使叶边缘细胞持续生长 (Ori等, 2007)。
金鱼草 cin ( cincinnata) 突变体由于细胞在
叶边缘的分裂延长, 导致突变体叶片皱褶, CIN
编码一个 TCP 转录因子, 金鱼草 cin 和拟南芥
jaw鄄D突变体具有相似的叶片边缘卷曲表型。 在
这两个突变体中, TCP 基因的表达调控受到
miRNA的介导, 影响细胞分裂的时空特性, 进
而在叶的发育中起到调控作用 (Nath 等, 2003;
Palatnik等, 2007)。
叶的近轴面决定基因家族 ClassIII HD鄄ZIP成
员是 miR165 / 166 的靶基因。 HYL1 是 miRNA 形
成过程中一个重要的基因, HYL1 基因通过介导
miRNA来调节 ClassIII HD鄄ZIP 基因的表达; 在
叶上卷突变体中, miR165 水平降低, 近轴面决
定基因 REV 被上调, 同时叶的远轴区域也受到
影响, 导致远轴面决定基因 FIL被下调, 叶背腹
极性丧失, 产生叶片翻卷现象 (Yu等, 2005)。
突变体分析是研究叶形态发生机制的最好方
法之一, 拟南芥和其它一些植物突变体己被广泛
应用于植物发育及代谢途径的研究中。 本研究利
用基因激活标签法构建突变体库, 并从中筛选了
一个叶发育异常突变体进行研究。 突变体表型
为: 叶片边缘锯齿状、 叶片卷曲、 叶表皮细胞窄
小、 果荚皱缩、 叶片表皮腺毛结构异常等。 通
过 Tail鄄PCR方法成功定位该突变体突变基因为
At5g41663。 本研究为下一步探究该突变基因与
叶形态发育的关系, 进一步阐明叶发育的分子调
控网络奠定了基础。
1摇 材料与方法
1. 1摇 材料
拟南芥叶边缘锯齿状突变体 pCB1294 是从实验室前
期构建的拟南芥基因激活标签突变体库中筛选得到的,
该突变体库遗传背景为 colombia生态型 (col)。
1. 2摇 突变体表型观察
突变体和野生型种子同时播种于土壤中, 温室
(25益) 正常生长, 观察表型、 拍照。 取突变体叶片、
茎杆、 果荚固定于 FAA固定液中, 扫描电镜观察表型。
1. 3摇 突变体基因定位
运用 Tail鄄PCR方法分离突变体 T鄄DNA侧翼序列 (Liu
等, 1995)。 程序: Tail鄄1: 94益 2 min; 95益 1 min; 94益
30 s, 62益 1 min, 72益 2. 5 min, 5 个循环; 94益 30 s,
25益 3 min (50% ramp), 72益 3 min (32% ramp), 2个循
环; 94益 10 s, 68益 1 min, 72益 2. 5 min, 94益 10 s, 68益
1 min, 72益 2. 5 min, 94益 10 s, 44益 1 min, 72益 2. 5 min
15cycles; 72益 7 min。 Tail鄄2 (将第一轮产物稀释 50 倍取
1 滋L作为第二轮反应的模板): 94益 3 min; 94益 10 s,
64益 1 min, 72益 2. 5 min, 5cycles; 94益 10 s, 64益 1 min,
72益 2. 5 min, 94益 10 s, 64益 1 min, 72益 2. 5 min, 94益
10 s, 44益 1 min, 72益 2.5 min, 15cycles; 94益 10 s, 44益
1 min, 72益 2. 5 min, 5cycles; 72益 7 min。 Tail鄄3 (将第二
轮产物稀释 12. 5 倍取 1 滋L 做第三轮模板): 94益 10 s,
44益 1 min, 72益 2. 5 min, 30cycles; 72益 7 min。 所用引
物为特异引物、 简并引物, 见表 1。
1. 4摇 T鄄DNA插入位点鉴定
分别提取 col、 pCB1294 基因组 DNA, 采用三引物法
鉴定, 在 pCB1294 突变体 T鄄DNA插入位点两侧的基因组
序列上设计两个引物 (LP、 RP), 与 T鄄DNA左边界引物
(LB3) 扩增 (http: / / signal. salk. edu / tdnaprimers. 2. html)。
以 col野生型植株基因组 DNA作为对照, 分别以 pCB1294鄄
LP \ LB3、 pCB1294鄄RP \ LB3、 pCB1294鄄LP \ pCB1294鄄RP
三组引物进行 PCR扩增。 鉴定引物见表 1。
1. 5摇 RNA的提取及 Real鄄time PCR
取生长约 10 d的 pCB1294 突变体及 col野生型幼苗,
采用异硫氰酸胍法提取总 RNA, Real鄄time PCR分析 pCB鄄
1294突变体植株中 miR319b 基因表达量, 以看家基因
ACTIN2作为内参 (Varkonyi鄄Gasic等, 2007)。 引物见表 1。
2摇 结果与分析
2. 1摇 叶边缘锯齿状突变体 pCB1294 的筛选与表
型分析
pCB1294 突变体是利用基因激活标签法构建
的突变体库中, 获得的一个叶片发育异常的突变
体。 从表型分析可知 (图 1), 突变体从幼苗期
921 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李婉莎等: 拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
开始, 第一片真叶表现为叶片锯齿状。 莲座叶形
成时期, 突变体叶片基部和顶部都表现为较多锯
表 1摇 引物及其序列
Table 1摇 Primer and their sequences
引物 Primer 序列 Sequence
特异引物 Special primer
pCB260LB1 GATTATTGCTCGGGTAGATCGTCTTG
pCB260LB2 CATATGTGGGTTAGCATTCTTTCTG
pCB260LB3 GGTACCAAAACCACCCCAGT
pCB260RB1 ACCTTTTCGAGTATCAATGGAAACTTAACCG
pCB260RB2 CAACGGAGAGTGGCTTGAGATCGGCA
pCB260RB3 CAATGGCCCTTATGGTTTCTGCATCTAG
鉴定引物 Diagnosis primer
pCB1294鄄LP CCGAACAACTAAACTTTCATTC
pCB1294鄄RP ACGTACACAGAGCAATATACC
LB3 GGTACCAAAACCACCCCAGT
兼并引物 Degenerate primer
AD1 NGTCGASWGANAWGAA
AD2 TGWGNAGSANCASAGA
AD3 AGWGNAGWANCAWAGG
AD4 STTGNTASTNCTNTGC
AD5 NTCGASTWTSGWGTT
AD6 WGTGNAGWANCANAGA
Real鄄time PCR引物 Real鄄time PCR primer
miR319b鄄RT GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGGGAG
miR319b鄄F CGGCGGCTTGGACTGAAGGGA
Universal primer鄄R GTGCAGGGTCCGAGGT
ACTIN2鄄F TATCGCTGACCGTATGAG
ACTIN2鄄R CTGAGGGAAGCAAGAATG
图 1摇 pCB1294 突变体叶表型
Fig. 1摇 pCB1294 mutant phenotype of leaf
齿, 边缘皱缩。 突变体花发育和野生型无太大区
别。 扫描电镜观察结果表明 (图 2): 突变体叶
片表皮细胞窄小、 果荚表面皱缩、 果荚表皮细胞
异型、 叶片表皮腺毛表现为两叉结构, 而野生型
叶片表皮腺毛为三叉结构, 突变体叶表皮腺毛形
态发育异常。
图 2摇 pCB1294 突变体扫描电镜观察结果
A. B: 叶表皮; C. D. E. F: 果荚; G. H. I. J: 叶表皮毛
Fig. 2摇 The scanning electron microscopy observation
of pCB1294 mutant
A. B: leaf epidermidis; C. D. E. F: pod; G. H. I. J: leaf trichome
2. 2摇 Tail鄄PCR定位突变基因
运用 Tail鄄PCR方法, 我们成功分离到 pCB1294
突变体 T鄄DNA侧翼序列, 通过序列比对发现 T鄄
DNA插入在 At5g41663 基因的启动子区域, 该
基因编码 miR319b, T鄄DNA为正向插入 (图 3 所
03摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
示), T鄄DNA 中的 4 个串联的 35S 启动子增强
miR319b基因的表达。
图 3摇 拟南芥 At5g41663 基因结构及 pCB1294 突变体
T鄄DNA插入位点 (三角形表示 T-DNA插入位点)
Fig. 3摇 The structure of At5g41663 gene and the location
of the T鄄DNA insert (marked with triangles)
2. 3摇 T鄄DNA插入位点鉴定
col野生型植株用 pCB1294鄄LP 和 pCB1294鄄
RP引物可扩增出 750bp 左右的特异条带, 而另
外两组引物不能扩增出条带; pCB1294 突变体用
左边界引物 (pCB1294鄄LP) 与 T鄄DNA引物 (LB3)
能够扩增出 500 bp 左右的条带, 另外两组引物
扩增无条带 (图 4)。 结果表明, 通过 tail鄄PCR方
法扩增的 pCB1294 突变株 T鄄DNA插入位点正确,
且该突变株是纯合体。
图 4摇 pCB1294 突变体 T鄄DNA插入位点鉴定
I. pCB1294鄄LP \LB3 引物; II. pCB1294鄄RP \LB3 引物;
III. pCB1294鄄LP \ pCB1294鄄RP引物
Fig. 4摇 Identification of T鄄DNA insertion sites in pCB1294 mutant
I. pCB1294鄄LP \LB3 primer; II. pCB1294鄄RP \LB3 primer;
III. pCB1294鄄LP \ pCB1294鄄RP primer
2. 4摇 Real鄄time PCR实验分析突变基因
Real鄄time PCR 结果表明 (图 5): miR319b
基因在 pCB1294 突变体中的表达量比野生型植
株高 11 倍多。 说明 pCB1294 突变体植株中
miR319b基因的表达得到了极大增强。
图5摇 pCB1294与 col植株miR319b基因表达量的Real鄄time PCR检测
Fig. 5摇 Real鄄time PCR analyses of miR319b expression
level from pCB1294 mutant and col plant
3摇 讨论
pCB1294 突变体是利用基因激活标签系统突
变体库筛选得到的一株叶型锯齿状的突变体。 该
激活标签突变体库较之先前的 T鄄DNA插入突变体
库、 转座子插入突变体库等具有明显的优势。 它运
用一个含有 4伊35S超强启动子的 pCB260质粒进行
转化, 构建得到的突变体为显性突变, T1 代即可
观察表型。 pCB260质粒上带有一个 Basta抗性标记
基因 (抗除草剂基因) 和一个GFP (绿色荧光蛋白)
报告基因, 通过 Basta 抗性标记基因可以方便地
筛选转基因后代植株, GFP报告基因的利用则可
进一步鉴定转基因的可靠性, 使得转基因植株的
筛选鉴定工作简单、 直观 (关艳龙等, 2009)。
pCB1294 突变体中 T鄄DNA 插入在 At5g41663
基因的启动子区域, 该基因编码 miR319b。 Real鄄
time PCR结果显示, pCB1294 突变体中 miR319b
基因显著增强表达, 说明 T鄄DNA中 4个 35S启动
子极大增强了 miR319b基因的表达, 该突变体为
增强型表达的突变体。 突变体在形态上表现为整
个叶发育时期叶片边缘锯齿状, 边缘皱缩, 叶表
皮毛表现为两个分叉、 结构异常, 另外果荚表面
皱缩、 扭曲, 突变体这些异常的表型性状有可能
是 miR319b基因增强表达的结果, miR319b 基因
与植物的叶形态发育密切相关。
研究表明, miRNA在植物叶极性建立、 叶发
育方面起重要作用。 例如, 从拟南芥的激活标签
突变体库中分离到的两个突变体 meristem en鄄
larged1 (men1) 和 jabba鄄1D ( jab鄄1D), 突变体表
型均为叶片卷曲。 突变体表现为 miR166a 和
miR166g 水平升高 (Kim 等, 2005; Williams 等,
131 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 李婉莎等: 拟南芥叶边缘锯齿状突变体的分离与鉴定摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
2005)。 miR159 和 miR319 分别调控 MYB mRNAs
和 TCP mRNAs, 其突变体均表现为叶极性改变、
发育异常 ( Palatnik 等, 2007)。 在拟南芥中,
CUP鄄SHAPED COTYLEDON2 ( CUC2 ) 基 因 和
miR164基因在叶边缘细胞形成和发育的整个过
程中发挥了重要的作用 (Nikovics 等, 2006)。
miR164 和 CUC 基因的相互平衡共同控制着这一
过程。 整个叶发育过程中, miR164a 突变体叶边
缘比野生型具有较多的锯齿, GUS 染色表明
miR164a和 CUC2 基因在叶边缘细胞表达。 CUC2
基因编码 NAC家族转录因子, miR164靶向作用于
NAC基因 (Nikovics等, 2006; Guo等, 2005; Bak鄄
er 等, 2005; Schwab 等, 2005 )。 ARGONUATE1
(AGO1) 是 miRNA 介导基因调控, 对 PHB 进行
调控的一个基因, AGO1 通过 miRNA 对 PHB 进
行调控, AGO1 是 RNA介导的基因沉默途径中一
个主要的成分 (Kidner和 Martienssen, 2004)。
研究 miRNA与植物生长发育的相互关系是植
物生物学研究领域中的一个热点, 如有研究认为
(刘冬梅等, 2009) miR396具参与拟南芥花柱头发
育的重要功能。 但 miRNA 如何调控多个靶基因,
其具体的网络调控机制、 植物中的 miRNA和它们
的靶基因的探寻等诸多问题还有待深入研究。
本项研究为深入分析 miRNA 功能、 miRNA
与靶基因的相互作用关系及调控机制奠定了基
础。 下一步, 我们可利用分离到的 pCB1294 突
变体为基础, 建立另外一个以 pCB1294 突变体
为背景的突变体库, 从该突变体库中筛选各种叶
形突变体, 例如, 突变体叶形边缘锯齿状加剧或
其他叶形变异突变体, 以此深入分析植物叶形态
发育与 miRNA的相互关系, 以及探寻更多 miR319b
所调控的靶标基因。
也参摇 考摇 文摇 献页
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