全 文 ：通过导入几丁质酶基因提高巨大芽孢杆菌的生防效果
?
张新建1 , 黄玉杰1 , 杨合同1 ,2
??
, 任 艳1 , 陈 凯1
(1 山东省科学院中日友好生物技术研究中心 , 山东省应用微生物重点实验室 , 山东 济南 250014 ;
2 山东理工大学生命科学学院 , 山东 淄博 255049)
摘要 : 以质粒 pMSDChi113 为模板 , 经 PCR 扩增 , 获得了几丁质酶基因 1 .8 kb DNA 片段 , 将该基因与大肠
杆菌 - 芽孢杆菌穿梭质粒 pHY300PLK 连接 , 获得重组质粒 pHYChi113。重组质粒经芽孢杆菌感受态方法转
入巨大芽孢杆菌 ( Bacillus megaterium) Ap25 中 , 获得的工程菌株 B. megateriums Ap25-chi113 同时具有几丁
质酶和内切葡聚糖酶酶活。平板对峙实验结果表明 , 工程菌株对病原真菌 Rhizoctonia solani , Coniothyrium
fuckellii , Fusariumgraminearum, Macrophoma kawatsukai , Fusariumoxysporium, Botrytiscinerea, Rhizoctonia cerea-
lis, Colletotrichumgloeosporioides, Bipolarls sorohlulana的拮抗性能明显提高 , 尤其是对 Coniothyrium fuckellii 的
抑制率相对于野生菌 Ap25 提高了 13%以上。盆栽防病实验结果表明 , 工程菌株显著降低纹枯病菌 ( Rhi-
zotonia cerealis) 对小麦 ( Triticumaestivum L .) 及枯萎病菌 ( Fusarium oxysporum) 对棉花 ( Gossypiumhirsutum
Linn .) 的致病能力 , 对这两种病原菌的防效分别是 70 .34% 和 58 .51% , 同原始菌株相比 , 防效分别提高
了 27 .54%和 21 .28%。
关键词 : 几丁质酶 ; 芽孢杆菌 ; 穿梭质粒 ; 转化
中图分类号 : Q 784 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2007) 06 - 666 - 05
Improving Biocontrol Effect of Bacillus megterium (Bacillaceae)
on Plant Disease through Genetic Modification
with Chitinase Gene
ZHANG Xin-Jian
1
, HUANG Yu-Jie
1
, YANG He-Tong
1 , 2
, REN Yan
1
, CHEN Kai
1
(1 Biotechnology Research Center of Shandong Academy of Sciences, KeyLaboratory for Applied Microbiology of Shandong Province
Jinan, 250014 , China; 2 School of LifeSciences, Shandong University of Technology, Zibo 255049 , China)
Abstract: Bacillus megateriumAp25 which can produce endoglucanasewas provedas a biocontrol agent of plant disease .
Theaim of this study is to enhance the biocontrol effect of this strain by introduction of a chitinase gene . A 1 .8 kb DNA
fragment containing chitinase gene and SD sequence was amplified with the template pMSDChi113 and was inserted into
shuttle vector pHY300PLK to construct a newplasmid, pHYChi113 . Therecombinant plasmid was transformed into B. m-
egterium, resulting in a new strain named Ap25-chi113 . Chitin plate culture and PCR amplification confirmed that Ap25-
chi113 containeda functional chitinasegene . Comparingwith thewild type Ap25 in dural cultureexperiment, Ap25-chi113
increased its effect against the pathogenic fungi . Especially, the inhibition percentage against Coniothyrium fuckellii in-
creasedabout 13% . In pot experiment, Ap25-chi113 also increased the effect on suppression of wheat sheath blight and
cotton Fusariumwilt caused by Rhizotonia cerealis and Fusariumoxysporum respectively, comparing with the wild strain .
Key words: Chitinase; Bacillusmegaterium; Shuttle vector; Transfer
云 南 植 物 研 究 2007 , 29 (6) : 666～670
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence . Tel : 86 - 531 - 82605386; Fax: 86 - 531 - 82965634 ; E-mail: yanght@ keylab.net
收稿日期 : 2007 - 06 - 01 , 2007 - 08 - 17 接受发表
作者简介 : 张新建 (1978 - ) 男 , 山东苍山人 , 博士 , 助理研究员 , 主要从事微生物遗传改造及生物防治方面的研究。
E-mail : zhxjmail@ sohu. com ?
基金项目 : 国家“863”计划现代农业技术领域重大项目资助 (2006AA10A211)
几丁质 (Chitin) 是广泛分布于自然界的生物
多聚物 , 其储量仅次于纤维素 , 位居第二。几丁
质酶 ( chitinase) 可将由β-1 , 4-N-乙酰-D-葡聚糖
(NAG) 残基组成的几丁质降解为低分子量的
NAG, 是一类催 化降解几 丁质的糖基 水解酶
(Gooday, 1990)。自然界中生防菌株大多数都能产
生一种或几种几丁质酶 , 通过水解除卵菌外的病
原真菌的细胞壁而有效地抑制其生长 ( Tomokazu
等 , 2004; Zhu等 , 2001) , 因此几丁质酶作为一种
抗菌蛋白是生防菌抑制病原真菌的重要机制之一。
在生防菌中 , 芽孢杆菌是目前研究较多的一
类菌 , 在植物病害生物防治中发挥了重要的作
用。de la Vega等 (2006) 报道了 Bacillus thuring-
iensis subsp . aizawai 中外切几丁质酶对病原真菌
的作用 , Kishore and Pande ( 2007 ) 报道了几丁质
水解菌 Bacillus cereus 对鹰嘴豆叶部病害灰霉病
的应用。目前已经在多种芽孢杆菌中克隆到了几
丁质酶 编 码 基 因 , 例 如 Watanabe and Oyanaqi
(1990 ) 在 B. circulans WL-12 中克隆了几丁质酶
基因 chiA。黄玉杰等 (2006) 在 B. subtilis Ap113
中克隆了 chi113。前人的工作主要侧重于芽孢杆
菌几丁质酶基因分子特性等方面 , 利用芽孢杆菌
几丁质酶基因构建生防菌株研究表达及抑菌活性
还鲜有 报 道。本 研 究 目 的 是 利 用 穿 梭 载 体
pHY300PLK 通过芽孢杆菌感受态转入方法将几
丁质酶编码基因导入到本身几丁质酶活性较低的
巨大芽孢杆菌 Ap25 中 , 研究在巨大芽孢杆菌中
的表达能力 , 以提高生防菌的抑菌能力 , 为进一
步开发应用打下基础。
1 材料与方法
1 .1 材料
1 .1 .1 菌株、质粒及培养条件 本研究使用的菌株和质
粒列于表 1。大肠杆菌 JM109 生长培养基 LB , 37℃培养
12～16 h, 芽孢杆菌及其工程菌分别在 LB 平板或液体培
养基中 28℃培养 24～48 h。抗生素使用浓度分别是 : 氨
苄青霉素 (Ap) 50μg?ml , 四环素 (Tet) 20μg?ml。
1 .1 .2 培养基 大肠杆菌培养基 LB、SOC 见参考文献
(颜子颖 , 1998)
几丁质培养基见参考文献 (Wang and Tang, 1998)
SPⅠ培养基 : 100 ml 的蒸馏水中加入以下物质 :
(NH4 ) 2 SO4 0 .2% , K2 HPO4 1.4 % , KH2 PO4 0 .6 % , 柠檬
酸钠 0 .1 % , MgSO4 7H2 O 0 .02% , 葡萄糖 0 .5% , 酪蛋白
水解物 0.02% , 酵母抽提物 0 .1% , L-leucine 50 μg?ml,
L-Methionine 50μg?ml, 其中葡萄糖、酪蛋白水解物、酵
母抽提物、L- leucine和 L-Methionine配成母液分别灭菌 ,
接菌前加入到培养基中。
SPⅡ培养基 : 100 ml 的 蒸馏水中加入以 下物质 :
(NH4 )2 SO4 0.2% , K2 HPO4 1.4% , KH2 PO4 0.6% , 柠檬酸钠
0.1% , MgSO4 7H2 O 0.02% , 葡萄糖 0.5% , MgCl2 5 mmol?L ,
酵母抽提物 0.1% , L-leucine 50μg?ml , L-Methionine50μg?ml,
其中葡萄糖、MgCl2 、酵母抽提物、L- leucine和 L-Methionine
配成母液分别灭菌 , 接菌前加入到培养基中。
1 .1 .3 酶和试剂 各种限制性内切酶、T4 DNA ligase等
分别购自上海生工、TaKaRa Biotech公司 , DNA 凝胶回收
试剂盒购自 TaKaRa Biotech 公司 , DNA 片段回收试剂盒
购自上海生工。X-gal、IPTG购自 TaKaRa Biotech公司。
1 .2 方法
1 .2 .1 重组质粒 pHYChi113 的构建 质粒 pMSDChi113 为
pMD18-T连接枯草芽胞杆菌 ( B. subtilis) Ap113 的几丁质
酶基 因 chi113 , 已 在 GenBank 上 登 陆 , 登 陆 号 为
DQ661650 , 具有几丁质酶活性。经测序发现该基因同
GeneBank中已发表的 B . subtilis的几丁质酶 chi 基因同源
性为 99% , 并且该基因 chi113 的 5′端引入 SD 序列 (黄
玉杰等 , 2006)。以质粒 pMSDChi113 为模板 , 设计引物
chiEcoRIup: 5′-CGGAATTCAGGAGGTTGATATGAAAAAAG 和
chiEcoRIdo: 5′-CGGAATTCTTATTTG CAATCACCAATT-3′,
进行 PCR 扩增 , 反应条件为 : 94℃预变性 5 min, 其次
94℃变性 1 min, 39℃退火 1 .5 min, 72℃延伸 2 min, 共 10
个循环 , 然后 94℃变性 1 min, 41℃退火 1 .5 min, 72℃延
伸 2 min, 共 25 个循环 , 最后 72℃延伸 20 min。利用
EcoRI 酶切 PCR 产物 , 同 EcoRI 酶切并去磷酸化的大肠
杆菌?芽胞杆菌穿梭质粒 pHY300PLK 连接 , 转化 E. coli
表 1 菌株和质粒
Table 1 Strain and Plasmid
菌株?质粒 Strains?Plasmids 特性 Characteristics 来源 Sources
B ?. subtilis Ap113 生防菌株 , 具有几丁质酶活性 实验室保存
B ?. megateriumAp25 生防菌株 , 具有内切葡聚糖酶活性 实验室保存
pHY300 ?PLK Ampr , Tetr , 穿梭质粒 , 可在大肠杆菌和芽孢杆菌中复制 中国农业大学张力群老师惠赠
pMSDChi113 TAmpr , 携带几丁质酶基因 , 并在几丁质酶基因前具有 SD 序列 本室连接重组获得
pHYChi113 *Ampr , Tetr , 携带有几丁质酶基因 本室连接重组获得
7666 期 张新建等 : 通过导入几丁质酶基因提高巨大芽孢杆菌的生防效果
DH5α, 根据几丁质酶基因及穿梭载体 pHY300PLK 的酶切
位点 , 利用 PstI 和 EcoRI 酶切该质粒 , 以确定质粒的连
接及其连接方向 , 经酶切检测确认后 , 获得重组载体
pHYChi113。
1 .2 .2 重组质粒 pHYChi113 向芽孢杆菌的转化 按照芽
孢杆菌感受态细胞转化方法进行转化。
将纯化的巨大芽孢杆菌 Ap25 单菌落接种到 5 ml LB
的培养基上 , 37℃振荡培养过夜 ; 含有芽孢杆菌的 LB
培养基接种到新鲜的 SPⅠ培养基上 (接种体积大约是
1 % ) , 37℃振荡培养 , 当细胞长到对数期后期时 , 在培
养液中加入甘油 , 最终浓度为 12 .5% ; 将含有甘油的培
养基每 400μl 一份装到微离心管中 , 在乙醇 - 干冰上迅
速冷冻 , - 70℃保存 , 一直到使用时 ; 使用保存的菌种
时 , 37℃解冻 , 利用 SPⅡ培养基稀释 7 .5×体积 , 振荡
混匀 , 37℃振荡培养 90 min, 利用此培养物作为感受态
细胞。芽胞杆菌的感受态冰上融化 , 取 1 .5 ml 的灭菌的
离心管 , 依次加入 50μl 的感受态细胞和 50μl 的质粒溶
液混匀 , 37℃振荡培养 30 min; 加入 100μl LB 培养基 ,
37℃振荡培养 60 min; 用弯曲玻棒接菌在含 20μg?ml 的四
环素的 LB 平板上 , 28℃培养 24～48 h。将得到的转化子
同时接种到几丁质平板上和含四环素的 LB 平板上 ,
28℃培养 3～5 d, 观察转化子在几丁质平板上的水解情
况。设计引物 JChi113-R 和 JChi113-F 对重组芽孢杆菌进
行 PCR 扩增 (黄玉杰等 , 2006) , 以具有几丁质酶活性的
转化子为模板 , 检测几丁质酶基因的转化 , 并提取质
粒 , 进行酶切检测。
1 .2 .3 几丁质酶活性测定 将芽孢杆菌 Ap25、工程菌
Ap25-chi113 按照 1 %接种量接种到几丁质液体培养基中 ,
摇床培养 48 h后 , 8 000× g离心 10 min, 上清液即为待
测样品 , 采用冷冻干燥和聚乙二醇浓缩待测样品。几丁
质酶活性测定用 DNS ( 3 , 5-二硝基水杨酸 ) 比色法
(Tsukamoto等 , 1984)。1 ml 磷酸缓冲液 ( 0 . 2 mol?L , pH
4 .5) , 0 . 5 ml 待测样品 , 0 . 5 ml 胶体几丁质 , 混匀 , 37℃
恒温水浴 1 h。加入 DNS 试剂 1 .0 ml , 混匀后沸水浴 10
min, 冷却至室温 , 离心后取上清液在波长 530 nm下测
吸光度 , 重复 3 次 , 取平均值。以 100℃高温灭活处理
一个酶活力 15 min的待测样品为对照。酶活单位定义 :
每小时水解几丁质产生 1μmol 还原糖所需的酶蛋白量。
1 .2 .4 重组芽孢杆菌平板拮抗和温室生物测定实验 表
2 中供试病原菌在 PDA 培养基上培养 3 天后 , 用灭菌打
孔器取带菌丝的圆盘型培养基块 , 将该培养基块放在
PDA 平板的中央 , 将 Ap25、其工程菌株分别点接在距中
央 2 cm的周围 , 28℃下培养 5～ 8 d 后记录抑菌带的宽
度 , 检测野生菌及其工程菌的平板拮抗能力。抑制率 =
1 - (接细菌处病原菌扩展半径/ 对照病原菌扩展半径) ×
100%。
以小麦纹枯病和棉花枯萎病为防治对象 , 对 Ap25
和 Ap25-Chi113 进行防病生物测定 , 操作方法、病害调查
标准及防治效果计算参照文献 ( 中华人民共和国农业
部 , 2002 ; 杨合同等 , 2003)。
表 2 病原真菌
Table 2 Pathogenic fungi
菌株 Strains 特性 Characteristics 来源 Sources
Rhizoctonia solani
植物病原菌 , 棉花等
立枯病
实验室保存
Coniothyriumfuckellii
植物病原菌 , 引起枣
的叶斑病
实验室保存
Fusariumgraminearum
植物病原菌 , 引起小
麦赤霉病
实验室保存
Macrophoma kawatsukai
植物病原菌 , 引起棉
花红腐病 实验室保存
Fusariumoxysporium
植物病原菌 , 引起棉
花枯萎病 实验室保存
Botrytis cinerea
植物病原菌 , 引起瓜
类灰霉病 实验室保存
Rhizoctonia cerealis
植物病原菌 , 引起小
麦纹枯病
实验室保存
Colletotrichum
gloeosporioides
植物病原菌 , 引起棉
花炭疽病
实验室保存
Bipolarls sorohlulana
植物病原菌 , 引起小
麦等根腐病
实验室保存
2 结果
2 .1 J穿梭质粒 pHYChi113 向芽孢杆菌 Ap25 中
的转化
按照 pHY300PLK 转芽孢杆菌的方法 , 将重
组载体 pHYChi113 转化巨大芽孢杆菌 Ap25。将
转化后长出的菌落转移至几丁质平板上培养 , 3
～5 天后明显观察到部分菌落消解几丁质在自身
周围产生的透明圈 ( 图 1 ) , 说明导入的几丁质
酶基因得到了表达 , 并且分泌到培养基中。挑取
具有几丁质酶活性的菌株为模板 , 利 用引物
JChi113-F 和 JChi113-R 进行 PCR 扩增 , 进一步确
定几丁质酶编码基因导入到巨大芽孢杆菌中 , 筛
选转化子。提取转化子质粒 , 利用 EcoRI 和 PstI
酶切鉴定 , 鉴定结果同质粒 pHYChi113 的酶切结
果一样。依据平板上对几丁质水解圈的大小 , 确
定水解圈最大的转化子进入下一步实验 , 转化子
编号为 Ap25-chi113。
2 .2 几丁质酶活性检测
利用 DNS 比色法对芽孢杆菌 Ap25 及其工程
菌 Ap25-chi113 进行几丁质酶活性测定 , 结果见表
3。由表 3 可以看出 , 通过摇床培养获得的粗酶
866 云 南 植 物 研 究 29 卷
图 1 野生菌株 Ap25 和工程菌株
Ap25～Chi113 对几丁质的消解作用
Fig . 1 Digestion of the chitin on
plate by wild type Ap25
and engineered strain
图 2 巨大芽孢杆菌 Ap25 与工程菌
Ap25～ chi113 对病原菌的抑制率
Fig . 2 Inhibition percentage of Ap25 and
Ap25-chi113 to pathogenic fungi
1 . R. solani ; 2 . C . fuckellii ; 3 . F . graminearum;
图 3 野生菌 Ap25 与工程菌对
Rhizoctonia cerealis的室内
平板拮抗性比较
Fig . 3 Inhibition effects of Ap25
and Ap25-Chi113 to Rhizoctonia
4 . M . kawatsukai ; 5 . F . oxysporium; 6 . B. cinerea;
7 . R. cerealis; 8 . C . gloeosporioides; 9 . B . sorohlulana
表 3 芽孢杆菌及工程菌几丁质酶活性测定
Table 3 Detection of chitinase activity from
Bacillus and the recombinant
样品
Treatment
酶活力 Chitinase activity ( U?ml)
Ap25 ?Ap25-chi113
粗酶液 0 ?. 14 4 .02
5 D倍浓缩液 1 ?. 23 13 .10
10 V倍浓缩液 2 ?. 08 26 .91
液进行几丁质酶活性测定时 , 原始菌株 Ap25 及
工程菌株 Ap25-chi113 几丁质酶活性分别是 0 .14
和 4 .02 , 利用冷冻干燥和聚乙二醇对粗酶液进
行浓 缩测 定几 丁质 酶活 性 , 工 程 菌株 Ap25-
chi113 的 10 倍浓缩粗酶液中几丁质酶活性为
26 .91 , 是原始菌株 Ap25 几丁质酶活性的 13 倍 ,
由此可见将几丁质酶编码基因导入到巨大芽孢杆
菌 Ap25 中 , 使 Ap25 获得了几丁质酶活性 , 进一
步进行抑菌实验以确定几丁质酶基因的导入是否
提高了芽孢杆菌 Ap25 的抑菌活性。
2 .3 重组芽孢杆菌 Ap25-chi113 的平板拮抗试验
巨大芽孢杆菌 Ap25 与工程菌株 Ap25-chi113
对病原菌的抑制效果见图 2、3。结果表明 , 野
生菌株 Ap25 与工程菌株 Ap25-chi113 对所用供试
病原菌均有一定的抑制效果 , 且经改造后的工程
菌株抑菌能力明显增强 , 尤其是工程菌 Ap25-
chi113 对 C . fuckellii 的抑菌率达到了 80% 以上 ,
相对于野生菌 Ap25 的抑制率提高了 13% 以上。
工程菌 Ap25-chi113 对 F . graminearum的抑菌能
力较差 , 其抑菌率为 66 .5% , 提高了 7% , 以上
说明几丁质酶编码基因的导入提高了巨大芽孢杆
菌 Ap25 的抑菌能力。
2 .4 野生菌株及其工程菌株温室生物测定实验
温室实验中 , 野生菌株与工程菌株对小麦纹
枯病和棉花枯萎病防治效果见表 4。由表 4 可见
野生菌株和工程菌株均可显著降低小麦纹枯病和
棉花枯萎病病情指数 , 同对照相比在 0 .01 水平
上达到了显著差异。工程菌 Ap25-chi113 对小麦
纹枯病和棉花枯萎病的防效分别达到了 70 .34%
和 58 .51% , 同野生菌相比分别提高了 27 .54%
和 21 .28% , 在 0 .01 水平上达到了显著差异 , 进
一步说明几丁质酶基因的导入确实提高了芽孢杆
菌对小麦纹枯病菌和棉花枯萎病菌的防病效果。
表 4 巨大芽孢杆菌 Ap25 及其工程菌对小麦纹枯病和棉花枯萎病的防治效果
Table 4 Effects of Ap25 and Ap25-Chi113 on control of two plant diseases
处理 Treatment
小麦纹枯病 wheat sheath blight
病情指数 Disease index ( % ) 防效 Efficacy ( % )
棉花枯萎病 cotton Fusariumwilt
病情指数 Disease index ( % ) 防效 Efficacy ( % )
对照 CK 78 ?. 67a±7 .13 ——— 78 .33a±2 !. 20 ———
Ap25 ?45 .00b±3 . 21 42 t. 80 49 .17b±0 . 83 37 v. 23
Ap25 ?-chi113 23 ?. 33c±0 .88 70 t. 34 32 .50c±2 !. 89 58 v. 51
注 : 结果为均值±SE , 不同小写字母表示在 0 .01 水平上差异显著
Note: Results are mean ±standard error of mean small letters with different superscripts mean differences significantly ( P < 0 . 01)
9666 期 张新建等 : 通过导入几丁质酶基因提高巨大芽孢杆菌的生防效果
3 结论
本实验中所用的巨大芽孢杆菌出发菌株具有
内切葡聚糖酶活性 , 对病原菌具有一定的抑制作
用 ( 杨合同等 , 2002 )。几丁质酶基因在生防菌
的抑菌机制及植物抗病能力中具有重要的作用 ,
利用该基因转化得到的工程菌较野生菌相比具有
更强的抑菌活性 , 例如徐小静等 ( 2004 ) 将 Ser-
ratia marcescens的几丁质酶基因转入荧光假单胞
杆菌中 , 在平板拮抗实验中工程菌株的抑菌效果
明显高于野生菌株 , Jayaraman等 (2004) 通过穿
梭质 粒 pDSK519 将水稻几丁质酶基因 导入到
Azospirillumbrasilense中 , 得到了具有抑菌能力的
工程菌株。本研究利用已获得的枯草芽孢杆菌几
丁质酶基因 chi113 , 通过穿梭质粒 pHY300PLK
导入到巨大芽孢杆菌 Ap25 中 , 得到的重组芽孢
杆菌 Ap25-chi113 其 10 倍粗酶液中几丁质酶活性
达到了 26 .91 , 增强了生防芽孢杆菌 Ap25 的抑菌
能力 , 提高了对植物病害的防治效果 , 同原始菌
株相比 , 防效分别提高了 27 .54% 和 21 .28%。
本实验结果与上述报道是一致的 , 但是本研究所
采用的出发菌株为能够产生内切葡聚糖酶的巨大
芽孢杆菌 , 所获得的转化子应该具有更为广谱的
作用 , 比如对低等真菌病害的作用 ; 因此在下一
步的研究中 , 将尝试把几丁质酶基因整合到巨大
芽孢杆菌的染色体 DNA 上 , 提高芽孢杆菌的防
病效果 , 扩抑菌范围 , 以获得具有生态安全性的
可用于田间的生防菌株。
〔参 考 文 献〕
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