全 文 ：拟南芥神经酰胺酶基因对氧化胁迫的响应
?
刘润华1 ,2 , 江文波1 , 2 , 余迪求1
??
(1 中国科学院西双版纳热带植物园 , 云南 昆明 650223 ; 2 中国科学院研究生院 , 北京 100049)
摘要 : 以拟南芥哥伦比亚生态型 (Col ) 和神经酰胺酶突变体为实验材料 , 通过对突变体的一系列生理生
化指标的测定 , 来研究拟南芥神经酰胺酶基因 ( AtCER) 对 H2 O2 的响应。利用 PCR 和 Northern blot 获得了
9 个 AtCER纯合单突变体。不同浓度 H2 O2 处理野生型和突变体后 , 发现突变体对 H2 O2 的反应比野生型更
加敏感。H2 O2 处理后突变体叶片出现比野生型更严重的黄化现象和坏死斑点 , 总叶绿素含量也比野生型
下降的更快 , 电导率测定也发现突变体比野生型的电导率增加得更多。抗氧化酶活性的分析结果发现
H2 O2 处理后 , 突变体的抗氧化酶活性比野生型提高了 1 .5～3 倍。上述研究结果说明 AtCER参与了 H2 O2
诱导的氧化胁迫反应。
关键词 : 拟南芥 ; 神经酰胺 ; 神经酰胺酶 ; H2 O2
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2009) 04 - 326 - 09
The Response of AtCER to Oxidative Stress
in Arabidopsis thaliana
LIU Run-Hua
1 , 2
, J IANG Wen-Bo
1 , 2
, YU Di-Qiu
1 **
( 1 Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223 , China;
2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China)
Abstract : Ceramide is a secondmessenger involved inmany significant signal pathways of plants, suchas cell growth, re-
duplication, differentiation, senescenceandapoptosis . Thiswork investigatedthe AtCER function inoxidativestresscaused
by H2 O2 . The leaves of AtCER mutants cer1 , cer2 and cer3 , exhibited more severe levels of yellowing and necrotic le-
sions than wild-type with H2 O2 treatment . Further investigation by the physiological and biochemical methods, indicated
that chlorophyll content of thesemutants decreased more quickly than do wild type plants, andtheir conductivity increased
significantly, and the antioxidases activity in leaves of AtCER mutantswere approximately 1 .5 or 3-fold higher than that in
wild-type after H2 O2 treatment . All of those results suggestedthat AtCER may involved in H2 O2 -induced Oxidative stress .
Key words: Arabidopsis thaliana; Ceramide; Ceramidease; Hydrogen peroxide
神经酰胺 ( Ceramide) 是鞘脂 ( Sphingolip-
ids) 的基本结构单位 , 由鞘氨醇长链上的氨基
与一分子脂肪酸以酰胺键共价结合而生成。许多
研究表明 , 神经酰胺是鞘脂信号途径的中心分
子 , 在植物许多信号途径中充当第二信使的重要
作用 , 调控细胞的功能如细胞生长、增殖、分
化、衰老和凋亡等信号过程 ( Lynch and Dunn,
2004; Sperling and Heinz, 2003; Dunn 等 , 2004 )。
研究证实神经酰胺介导一些拮抗剂可以引起细胞
分化、抑制细胞生长、促进程序性细胞死亡和衰
云 南 植 物 研 究 2009 , 31 (4) : 326～334
Acta Botanica Yunnanica DOI : 10 .3724?SP. J . 1143 .2009.09033
?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : ydq@ xtbg. ac. cn; Tel : 0871 - 5143017
收稿日期 : 2009 - 02 - 23 , 2009 - 03 - 30 接受发表
作者简介 : 刘润华 (1982 - ) 女 , 在读硕士研究生 , 主要研究方向 : 植物基因功能分析。 ?
基金项目 : ?国家高科技研究发展计划 (863 计划 ) (2006AA02Z129)、国家自然科学基金 (90408022) 、科技部项目 (2005DKA21006 )
和中国科学院“百人计划”择优支持
老 (Venable等 , 2006 ) , 神经酰胺和它的磷酸化
衍生物之间的动态平衡能调控植物程序性细胞死
亡的总量 (Liang等 , 2003) 。神经酰胺及其代谢
产物在许多方面的功能也是相互作用的 , 如神经
酰胺和鞘氨醇-1-磷酸 ( Sphinganine-1-phosphate)
在凋亡信号调节方面的功能是相互拮抗的 , 神经
酰胺在不同细胞类型中都促进细胞死亡 , 但细胞
内的鞘氨醇-1-磷酸却能刺激细胞生长和抑制程
序性死亡的信号途径 (Morita 等 , 2000; Xia等 ,
2000)。近 10 年来的研究发现神经酰胺也参与与
人类健康密切相关的生理病理过程 , 如癌症、病
毒或细菌感染、动脉硬化和心血管炎症、提高免
疫等 ( Li 等 , 2007; Heung等 , 2006)。
神经酰胺水平的调节受多种酶的调控 , 目前
已克隆出一些神经酰胺相关酶。神经 酰胺酶
(Ceramidase) 是以神经酰胺为中心的鞘脂代谢途
径的重要组成部分 , 它水解神经酰胺生成脂肪酸
和长链基团 ( Wright 等 , 2003; Bromley等 , 2003;
Neill 等 , 2002 )。但是植物神经酰胺酶的功能目
前还不清楚。
过氧化氢 ( H2 O2 ) 是 活性氧 簇 ( ReActive
Oxygen Species, ROS) 的一种 , 是细胞有氧代谢
的产物 , 许多外界刺激 ( 如紫外辐射、热激、机
械损伤、水分缺乏、病原菌等 ) 或细胞内信号分
子都可以导致细胞内 H2 O2 的积累 ( Zhang 等 ,
2003; Kwak 等 , 2003; Park 等 , 2003; Yoshioka等 ,
2003; Cheng and Song, 2006 )。许 多证 据 表 明
H2 O2 在信号转导途径中作为第二信使参与细胞
程序性死亡、激素响应、生物和非生物胁迫响应
等 ( Laloi 等 , 2004; Foreman 等 , 2003; Finkel ,
2006; Rhee, 2006; Rahman等 , 2005; Kotchoni and
Gachomo, 2006)。H2 O2 可引起细胞内游离 Ca2 + 浓
度增加 , 从而导致气孔关闭。在 ABA 诱导气孔
关闭的过程中也发现了过氧化氢酶相关基因的表
达 , 表明 H2 O2 可能是信号转导链的一个中间环
节。H2 O2 还能调控 Ca2 + 信号系统、胞质碱化以
及 K + 通 道 的 变 化 ( Pei 等 , 2000; Zhang 等 ,
2001a, b; Zhang等 , 2008) 。高浓度 H2 O2 可以直
接损伤许多细胞内的生物大分子 , 使细胞膜遭受
损害 , 从而加速细胞的衰老和解体 , 最终导致细
胞死亡 ; 低浓度 H2 O2 却能促进细胞生长 , 增强
植物对多种外界逆境和病原菌的抵抗力 ( Huwiler
等 , 2000; Kwak等 , 2003)。此外 , H2 O2 能正调控
与抗氧化防御系统相关基因的表达 , 而且拟南芥
中已经鉴定出 175 个受 H2 O2 调控的不可逆表达
序列 , 其中有 113 个受诱导 , 62 个被抑制 (Sung
等 , 2008; Desikan 等 , 2001; Mullineaux 等 ,
2000)。因此 H2 O2 是研究细胞对氧化胁迫响应的
一个重要活性分子。
神经酰胺酶是调控神经酰胺水平的关键酶 ,
所以神经酰胺酶的相关代谢功能和生物学功能的
研究非常必要而且重要。但是到目前为止 , 动物
方面关于神经酰胺酶的功能还不太清楚 , 植物神
经酰胺酶的功能也未见报道。因此本文以拟南芥
神经酰胺酶突变体为实验材料 , 选用拟南芥野生
型 ( Col ) 作对照实验材料。通过对 H2 O2 处理后
突变体和野生型叶片的一系列生理生化指标的测
定 (如叶绿素含量、电导率、抗氧化酶活性等 ) ,
我们发现 AtCER参与了 H2 O2 诱导的氧化胁迫反应。
1 材料与方法
1 .1 植物材料和培养条件
拟南芥野生型 ( Col ) 和拟南芥神经酰胺酶突变体种
子经表面灭菌后点播在 1?2 MS 培养基 (含 0 .65 % Agar)
上 , 4℃春化 2 d后 , 转移到 26℃光照培养箱生长一周 ,
然后移栽到土里 , 于 14 h光照?10 h黑暗条件的 22℃温室
中生长。
为了避免植物发育对实验的影响 , 本实验中所用的
叶片材料选用第三片莲座叶 , 在其叶片出现后的 12 天 ,
子叶完全展开时取材。用于 H2 O2 处理的拟南芥幼苗叶
片取材后 , 立即以叶正面朝下 , 背面朝上漂浮在不同浓
度 H2 O2 (含 3 mmol L - 1 pH = 5 .8 MES buffer) 的玻璃培养
皿中 , 放入 22℃全光照 (光照强度 12 000 lx) 培养箱中
处理相应时间。用于 Northern杂交的材料为生长 4 周后
经 3 % H2 O2 喷洒处理 8 h的整株幼苗。
1 .2 Northern blot
用 H2 O2 处理突变体和野生型幼苗 , 提取总 RNA。
使用 1.5 %甲醛-MOPS 琼脂糖凝胶分离 RNA , 转移到尼
龙膜上压膜 16 h。分别用 AtCER 三个基因的 PCR 产物做
为探针 , 探针通过 Klenow fragment (Takara) 进行32 P-dATP
标记 , 选用 PerfectHybTM Plus buffer (Sigma-Aldrich) 杂交液
于 68℃杂交过夜。然后洗膜 , 压片放射自显影。
1 .3 植物叶片内源 H2 O2 含量的测定
称取生长 20 d的新鲜拟南芥叶片 0 .1 g左右 , 加入
7234 期 刘润华等 : 拟南芥神经酰胺酶基因对氧化胁迫的响应
4℃预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆 , 转入离心管 ,
8 000 r min- 1 离心 10 min, 弃去残渣 , 留上清液。取上清
液加入 5 %硫酸钛和浓氨水 , 形成沉淀后于 8 000 r min- 1
离心 10 min, 弃上清液。沉淀用丙酮反复洗涤 3～5 次 ,
直到去除色素。在洗涤后的沉淀中加入 2 mol L - 1 硫酸 ,
待完全溶解后 , 在 415 nm波长下比色。
1 .4 电导率的测定
用不同浓度 H2 O2 处理拟南芥第三片莲座叶一天 ,
然后用电导率仪测定溶液的电导率。
1 .5 总叶绿素含量的测定
取 H2 O2 处理的拟南芥叶片加入 80% 丙酮溶液 , 于
干净的研钵中快速研磨成匀浆后转移到装有滤纸的漏斗
内过滤。收集滤液于 625 nm波长下比色 , 以测定叶片的
总叶绿素含量。
1 .6 酶的提取和分析
称取 H2 O2 处理后的拟南芥叶片 0 .1 g左右 , 加入 50
mmol L - 1 ( pH = 7) 含 1 %PVP 的冰磷酸提取液 , 于冰冻
的研钵中快速研磨成匀浆后倒入离心管中 , 4℃ , 10 000 r
min
- 1 离心 10 min, 弃残渣 , 留上清液作为粗酶液测定超
氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶
(CAT )、抗坏血酸过氧化物酶 (APX) 活性。在酶活性测
定前 , 用考马斯亮兰法测定各个样品的总蛋白浓度 , 对
各个样品的总蛋白浓度归一化。SOD酶活性测定参照 Gi-
annoplitis and Ries ( 1977) 的方法 ; POD 酶活性测定参照
陈少裕 (1991) 的方法 ; CAT 酶活性测定参照 Beers and
Sizer (1952 ) 的方法 ; APX 酶活性测定参照沈文飚等
(1996) 的方法。
2 结果与分析
2 .1 拟南芥神经酰胺酶基因突变体的获得
拟南芥神经酰胺酶基因家族有三个成员 ,
CER1 ( Atceramidase1 ) , CER2 ( Atcerami-dase2 )
和 CER3 ( Atceramidase3 )。根据神经酰胺酶的最
适 pH 值 , 分为酸性、中性和碱性神经酰胺酶 ,
拟南芥三个神经酰胺酶均为中性?碱性神经酰胺
酶 (Dangl 等 , 2000 )。
cer 突变 体从 The Arabidopsis Biological Re-
source Center ( ABRC ) 获得 ( Alonso 等 , 2003 )。
根据 T-DNA 插入位置 , 我们设计了特异引物进
行 PCR 扩增 , 同时利用基因特异性引物和 KO 引
物 (AAACGTCCGCAATGTGTTAT) 再次验证 , 获
得了纯合插入突变体。为了进一步验证 , 我们采
用 300 bp左右的探针 , 进行 Northern blot 分析。
用该基因 T-DNA 插入位点后的下游片断作为探
针 , 以避免和排除实验中假阳性的杂交条带。
Northern blot结果如图 1 , 野生型 (wt) 有条带 ,
而突变体没有条带。根据实验结果我们获得了拟
南芥神经酰胺酶三个基因的 9 个 T-DNA 插入单
突变体 , 其中 cer1 有 5 个 , cer2 有 2 个 , cer3 有
2 个 ( 图 2)。这 9 个 T-DNA 插入单突变体的基因
位点和编号 , 以及 PCR 筛选的引物序列见表 1。
图 1 拟南芥神经酰胺酶基因突变体的 Northern blot 鉴定
Fig . 1 Characterization of T-DNA insertion mutants of AtCER
2 .2 cer 突变体对 H2 O2 的响应更敏感
动物方面的研究已经证实神经酰胺酶参与调
控细胞的衰老 (Venable 等 , 2006; Futerman and
Hannun, 2004) , 而氧化胁迫导致植物受损 , 是
植物叶 片 衰老 的 主 要原 因 之 一 ( Quirino 等 ,
2000; Woo 等 , 2004) , 因此我们首先检测了突变
体和野生型叶片对不同浓度 H2 O2 处理的反应 ,
以了解神经酰胺酶基因是否参与了 H2 O2 引起的
氧化胁迫。由于各个基因中不同插入位点的突变
体对 H2 O2 的敏感性基本一致 , 因此每个基因都
只选取一个突变体来进行实验。本文所用的三个
突变体分别是 : cer1 (SALK— 020682) , cer2 (SAL-
K — 054725 ) , cer3 (SALK — 087134 )。
将突变体和野生型叶片于 0、10、20、30、
40 mmol L - 1 H2 O2 ( 含 3 mmol L - 1 pH = 5.8 MES
buffer) 中处理 4 天。从图 3 可以明显看出三个突
变体在 H2 O2 处理后表现出比野生型更严重的黄
化现象和坏死斑点。 cer3 在 10 mmol L - 1 H2 O2 处
理下就开始出现黄化现象和坏死斑 , 而且随着
H2 O2 浓度的提高 , 其黄化和坏死程度逐渐加重。
823 云 南 植 物 研 究 31 卷
cer1、 cer2 的表型虽然比 cer3 轻一些 , 但其黄化
和坏死程度仍然比野生型强 , 在 30 mmol L - 1
H2 O2 处理条件下突变体和野生型的黄化和坏死
现象差异最明显。这些结果表明 : 与野生型相
比 , cer 对 H2 O2 的响应更敏感。
同时我们对突变体和野生型叶片 的内源
H2 O2 含量也进行了分析 , 结果发现三个突变体
和野生型叶片的内源 H2 O2 含量并没有显著差异。
图 2 拟南芥神经酰胺酶基因突变体的 T-DNA 插入位点
Fig . 2 The T-DNA insertion sites of AtCER in CER1 , CER2 and CER3
表 1 拟南芥神经酰胺酶基因 T-DNA 插入突变体的基本信息
Table 1 The basic information of AtCER T-DNA insertion mutants
基因名称
Gene
基因位点
Gene locus
突变体编号
Accession number
引物序列 Primer sequence
CER1 ?AT5G58980
SALK — 150505 @
F : 5 \′-TCTTCCTCCACTGGAAGGTT-3′
R : 5′-TTGATTTCCTGCTCTTAAACCA-3′
SALK — 086045 @
F : 5 \′-AATGTGGCAATATACTGCGAA-3′
R : 5′-AGGAACAAGTACGATGCCAA-3′
SALK — 020138 @
F : 5 \′-ACATATGCATGACGATAGTCAACT-3′
R : 5′-AAATGGCATCCTCGTTACTGT-3′
SALK — 020682 @&SALK — 008536
F : 5 \′-ATGAGTTGCAAACCAATTGAA-3′
R : 5′-TGAAGATGACGAGGTGGTCT-3′
CER2 ?AT1G07380
SALK — 055109 @&SALK — 054725
F : 5 \′-TTCACGTTGTGATAGCTGGAT-3′
R : 5′-CAAGTTTTTAGGAACATCCGAA -3′
CER3 ?AT2G38010
SALK — 033707 @
F : 5 \′-AAACAACGACTTAGAAGCTCCA-3′
R : 5′-TCAACGTTATACGGACGACA -3′
SALK — 087134 @
F : 5 \′-TCGCACGATAGATAATTGCA-3′
R : 5′-ACAATGGTAGTGAAACAGCCA-3′
9234 期 刘润华等 : 拟南芥神经酰胺酶基因对氧化胁迫的响应
图 3 不同浓度 H2 O2 处理的突变体和野生型植物叶片
Fig . 3 Effect of various concentrations of H2 O2 on leaves fromwild-type and mutant plants
2 .3 H2 O2 处理后叶片总叶绿素含量的变化
植物叶片对氧化胁迫的反应可以通过测定其
叶绿素含量来鉴定 ( Woo 等 , 2004; Miyagawa等 ,
2000) 。而且前面的实验结果表明不同浓度 H2 O2
处理突变体和野生型叶片时 , 突变体出现明显的
黄化现象 , 因此我们进一步检测了 H2 O2 处理后
突变体和野生型叶片的总叶绿素含量的变化。由
于在 30 mmol L - 1 H2 O2 处理下突变体和野生型的
黄化程度差异最明显 , 因此我们分别用 0 mmol
L
- 1 和 30 mmol L - 1 H2 O2 处理来检测突变体和野
生型在 H2 O2 处理后总叶绿素含量的变化。
将突变体和野生型叶片分别放入 0 mmol L - 1
和 30 mmol L - 1 H2 O2 ( 含 3 mmol L - 1 pH = 5 .8 MES
buffer) 的培养皿中处理 , 每天选取部分叶片测
量总叶绿素含量 , 连续检测 3 天。结果发现 0
mmol L
- 1
H2 O2 处理的突变体和野生型的叶片的
总叶绿素含量没有明显差异。突变体和野生型的
总叶绿素含量在 30 mmol L - 1 H2 O2 处理一天后开
始出现差异 , 并且随着时间的延长 , 差异更加明
显 (图 4)。与第一天相比 , 第二天突变体的叶
绿素含量比野生型下降的更快 : 野生 型下降
11 .67% , cer1 下降 30 .75% , cer2 下降 20 .06% ,
cer3 下降 48 .49%。30 mmol L - 1 H2 O2 处理后三个
突变体的总叶绿素含量明显比野生型低很多 , 而
033 云 南 植 物 研 究 31 卷
图 4 30 mmol L - 1 H2 O2 处理对突变体和野生型
叶片总叶绿素含量的影响
Fig . 4 Effect of 30 mmol L - 1 H2 O2 on chlorophyll content
in detached leaves fromwild-type and mutant plants
且突变体的叶绿素含量也下降更快。结果进一步
表明 cer 对 H2 O2 的响应更敏感。
2 .4 H2 O2 对植物叶片电导率的影响
H2 O2 可以直接损伤许多细胞内的生物大分
子 , 使细胞膜遭受损害 , 从而加速细胞的衰老和
死亡 (Kwak 等 , 2003)。当细胞膜受到损害时 , 细
胞膜的选择透过性发生改变或者丧失 , 导致细胞
内的电解质外渗 , 使电导率增大。因此我们进一
步检测了 H2 O2 处理后野生型和突变体的电导率。
将完全成熟的第三片叶于 0、10、20、30、
40 mmol L - 1 H2 O2 处理一天 , 然后测定各个处理
样本的电导率 ( 图 5 )。在 0、10 mmol L - 1 H2 O2
处理下突变体和野生型的电导率没有明显差异。
20 mmol L - 1 H2 O2 处理下突变体和野生型的电导
率开始出现差异 , 并且随着 H2 O2 浓度的增加差
异逐渐增大。在 40 mmol L - 1 时它们的差异最明
显 , wt 电导率增加了 72 .37% , 而 cer1 增加了
115 .85% , cer2 增加 了 126 .92% , cer3 增加 了
135 .94% , 这些数据表明 H2 O2 处理后突变体和
野生型叶片的电导率都呈上升趋势 , 但是突变体
的电导率上升得更快。这些结果进一步表明 cer
突变体比野生型对 H2 O2 的响应更加敏感。
2 .5 H2 O2 处理下植物叶片的抗氧化酶活性变化
超氧 化 物 歧 化 酶 ( SOD )、过 氧 化 物 酶
(POD)、过氧化氢酶 ( CAT) 和抗坏血酸过氧化
物酶 (APX) 等抗氧化酶也称保护酶 , 是植物体
图 5 不同浓度 H2 O2 处理对突变体和野生型叶片电导率的影响
Fig . 5 Effects of various concentrations of H2 O2 on relative
electric conductivity in detached leaves
fromwild-type and mutant plants
内活性氧的清除剂 , 以缓解逆境对植物的伤害 ,
H2 O2 代谢主要由 SOD、CAT 和 POD 控制 (Grant
等 , 2000; Polidoros 等 , 2001 )。为了确认 cer 对
H2 O2 的敏感性是否是由于其抗氧化酶活性引起
的 , 我们检测了突变体和野生型叶片中 4 种抗氧
化酶活性 : SOD、CAT、APX 和 POD。
图 6 显示了 0 mmol L - 1 和 30 mmol L - 1 H2 O2
处理后突变体和野生型的 4 种抗氧化酶活性的变
化。结果表明 0 mmol L - 1 H2 O2 处理后突变体和
野生型叶片的 4 种抗氧化酶活性基本没有差异。
30 mmol L - 1 H2 O2 处理后突变体和野生型的 SOD、
CAT、APX 和 POD酶活性都明显增强 , 但是突变
体的 4 种抗氧化酶活性比野生型增强得更多 , 几
乎是野生型的 1 .5～3 倍。因此 cer 对 H2 O2 的响
应更敏感并不是由于这些抗氧化酶活性变化引起
的 , 而很可能是因为突变体受到 H2 O2 的伤害程
度比野生型更加严重。
3 讨论
大量实验证实 H2 O2 作为信号分子参与植物
发育、逆境适应和程序性细胞死亡 , 分子和生化
方面的证据也进一步证明 H2 O2 和鞘脂相互作用
共同参与程序 性细胞死亡 ( Gechev and Hille,
2005)。H2 O2 通过激活鞘磷脂酶的活性 , 使得神
经酰 胺 大量 积 累 从 而诱 导 程 序性 细 胞 死 亡
(Gechev and Hille, 2005; Goldkorn等 , 2003) 。而
1334 期 刘润华等 : 拟南芥神经酰胺酶基因对氧化胁迫的响应
图 6 H2 O2 处理后突变体和野生型叶片的 4 种抗氧化酶活性
Fig . 6 Effect of H2 O2 treatment on the four species activities of antioxidant enzymes in leaves fromwild-type and mutant plants
神经酰胺酶是神经酰胺代谢的关键酶 , 把神经酰
胺水解成脂肪酸和长链基团。当神经酰胺酶减少
或者缺乏时 , 神经酰胺的动态平衡被打破 , 神经
酰胺过度积累 , 从而诱发一系列生理生化反应 ,
诱导细胞死亡 (Liang等 , 2003 )。我们的实验也
发现拟南芥神经酰胺酶基因的确参与了 H2 O2 诱
导的氧化胁迫反应。不同浓度 H2 O2 处理后 , cer
对 H2 O2 的反应比野生型更加敏感。与野生型相
比 , H2 O2 处理后突变体出现更明显的黄化现象
和坏死斑点 , 而且其总叶绿素含量也比野生型下
降更多 , 这表明突变体叶片受到 H2 O2 的胁迫程
度比野生型强 , 因此突变体对 H2 O2 的反应比野
生型更加敏感 , 细胞衰老速度加快。
H2 O2 的氧化胁迫首先会损伤细胞膜 , 使其
选择透过性发生改变或者丧失 , 导致细胞内电解
质外渗 , 因此我们推测 H2 O2 处理后植物叶片的
电导率肯定会增加。为此我们检测了 H2 O2 处理
后突变体和野生型叶片的电导率 , 结果发现不同
浓度 H2 O2 处理后突变体和野生型叶片的电导率
都增加了 , 但是突变体比野生型增加得更多。因
而进一步证实了 H2 O2 对突变体的细胞膜的伤害
比野生型更大 , 所以 cer 对 H2 O2 的反应更敏感。
抗氧化酶是植物体内的重要保护酶 , 主要清
除植物体内产生的大量活性氧 , 缓解各种逆境产
生的活性氧对植物的伤害 (Grant等 , 2000; Poli-
doros等 , 2001 )。然而我们的实验发现 , H2 O2 处
理后突变体的 4 种抗氧化酶活性比野生型更强 ,
这说明突变体对 H2 O2 的敏感性并不是由于这些
抗氧化酶活性变化引起的 , 而很可能是因为突变
体受到 H2 O2 的伤害程度比野生型更加严重。对
双突变体的进一步分析中 , 我们发现双突变体对
H2 O2 的响应比单突变体更加敏感 ( 数据未报
233 云 南 植 物 研 究 31 卷
道 ) , 因此我们推测 AtCER 在氧化胁迫过程中的
确起着重要作用。虽然目前还没有直接的证据 ,
但是我们的实验结果表明 AtCER 很可能通过调
节神经酰胺的代谢水平 , 使得神经酰胺过度积
累 , 从而通过神经酰胺的途径来参与调控植物的
抗氧化胁迫反应。
综上所述 , 拟南芥神经酰胺酶基因的确参与
了 H2 O2 诱导的氧化胁迫反应。但是我们并不清
楚在这过程中 AtCER 基因与 H2 O2 究竟是怎样相
互作用 , 是跟植物鞘脂代谢途径有关 , 还是有特
殊的信号途径 , 还需要后续实验来证明。而且植
物中 H2 O2 作为信号分子参与信号转导的机制目
前仍然不清楚 , H2 O2 在生物学中的多重角色也
有待进一步发现。
〔参 考 文 献〕
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