全 文 ：激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析*
关艳龙1,李婉莎2,殷奎德1,杨永平2,胡向阳2**
(1黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院,黑龙江 大庆暋163319;2中国科学院昆明植物研究所
中国科学院青藏高原研究所昆明部,云南 昆明暋650204)
摘要:以拟南芥 (Arabidopsisthaliana)野生生态型 (Columbia)植株为实验材料,以含有激活标记双元
质粒pCB260的农杆菌进行转化,并以抗除草剂Basta为筛选标记,构建了拟南芥激活标签突变体库,所
用pCB260双元质粒含有两个Ds位点、一个GFP标记基因与一个抗basta标记基因,可以方便高效地筛
选转基因植物。目前经初步筛选获得了约10000个独立转化株系 (T1代),其中约50个株系具有明显的
表型变化,包括花期改变、株型变异、叶形特异、育性降低、花发育异常、种子颜色变浅等。运用TAIL灢
PCR技术,成功获得了其中10个表型特异株系的T灢DNA侧翼序列,分别分布于拟南芥基因组的5条染
色体上。
关键词:激活标签法;拟南芥;突变体;TAIL灢PCR
中图分类号:Q945,Q75暋暋暋暋暋文献标识码:A暋暋暋暋暋暋文章编号:0253灢2700(2010)01灢053灢07
ConstructingandPhenotypicAnalyzinganActivation灢
TaggingArabidopsisMutantPool
GUANYan灢Long1,LIWan灢Sha2,YINKui灢De1,
YANGYong灢Ping2,HUXiang灢Yang2**
(1ColegeofLifeScience,HeilongjiangBayiAgriculturalUniversity,Daqing163319,China;
2KunmingInstituteofBotany,ChineseAcademyofSciences,Kunming650204,China)
Abstract:Activationtaggingmethodisaneffectivetoolofobtaininggain灢of灢functionmutantandinvestigating
thegenefunction,whichplaysanimportantroleinplantfunctionalgenomicsstudy.Inthispaper,weused
ArabidopsisColumbiawildtypeasmaterialtoconstructanactivationtaggingmutantpoolbyAgrobacterium
tumefaciens灢mediatedtransformation,thebinaryvectorpCB260containedtwoDselements,oneGFPreport
geneandonebastaresistanceselectiongenes,whichshowmoreconvenientandefficienttoscreenthetrans灢
genicplant.Untilnow,overtenthousandtransformedplantsweregenerated.Amongthem,about50domi灢
nantmutantswithobviousphenotypeswereisolated,includingearlyorlatefloweringtime,unmoralleaf
shapeandflower,sterilityandthinseedcapsulecolor.T灢DNAflankingsequencesoftenspecialmutantswere
validatedbyTAIL灢PCRandsequencing,whoseT灢DNAinsertionfragmentsdistributedinalfivechromo灢
somesofArabidopsisgenome,respectively.
Keywords:Activationtagging;Arabidopsisthaliana;Mutant;TAIL灢PCR
暋暋拟南芥 (Arabidopsisthaliana)是十字花科植物,因其个体矮小、生长周期短、繁殖系数高、基因
云 南 植 物 研 究暋2010,32(1):53~59
ActaBotanicaYunnanica暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋DOI:10灡3724/SP灡J灡1143灡2010灡09167
*
**
基金项目:国家自然科学基金面上项目 (30871704)、中国科学院百人计划项目、黑龙江省研究生创新科研基金项目 (YJSCX2009灢
119HLJ)
通讯作者:Authorforcorrespondence;E灢mail:huxiangyang@mail灡kib灡ac灡cn
收稿日期:2009灢09灢02,2009灢11灢24接受发表
作者简介:关艳龙 (1984-)男,在读硕士研究生,主要从事植物功能基因克隆的研究。
组小、易于人工诱变及遗传转化等生物学特性,
成为植物生物学研究中的模式植物,广泛应用于
植物 生 物 学 的 各 个 研 究 领 域 (Meyerowitz,
1987)。特别是2000年12月拟南芥基因组的测
序完成,极大地推动了植物生物学研究的进程
(Federspiel,2000)。近年来,继拟南芥测序完
成之后,水稻、杨树等植物基因组计划相继完
成,植物功能基因组的研究成为后基因组时代的
焦点。而从突变体入手,通过分离突变体,鉴定
基因功能,进而研究生物有机体内各基因的生物
学作用成为植物功能基因组研究的重要方法,构
建饱和基因突变体库是分离鉴别基因功能最直
接、最有效的方法之一。
传统构建植物突变体库的方法主要有:快中
子、毭射线等介导的物理诱变、甲基磺酸乙酯
(EMS)等化学诱变剂介导的化学诱变 (Meyerowi灢
tz,1987)、农杆菌介导的 T灢DNA标签法 (Tin灢
land,1996;Zupan等,2000)、转座子标签法等
(Sundaresan,1996;RamachandranandSundaresan,
2001)。这些方法是通过基因敲除技术,产生功能
缺失突变体来分离基因并研究基因功能,然而对于
较多功能冗余的基因及那些植物生存所必需、缺失
会引起致死效应、功能丧失的基因以及一些无表型
的基因来说,功能缺失型突变往往无能为力,而通
过构建功能获得型突变体来研究基因功能就显得非
常有效,因而基因激活标签法 (activationtagging)
等技术应运而生,其在植物功能基因组学研究中具
有重要的作用。1992年,Hayashi及其研究小组,
首次发现并将该技术应用于拟南芥基因的分离和鉴
定 (Hayashi等,1992),他们在T灢DNA的右侧边
缘区构建了一个携带除草剂抗性标记基因和花椰菜
花叶病毒35S启动子单元的四聚体,将其作为增强
子,通过农杆菌侵染的方法,随机插入到拟南芥的
基因组中,由于增强子的作用,在插入位点附近的
基因会被激活而得到过量表达,由于被激活的基因
与T灢DNA插入紧密联系,因而比较易于基因的分
离鉴定,故称为基因激活标签法。研究发现,发生
过量表达的基因,大多数在距增强子380bp~3600
bp的范围内 (Weigle等,2000)。应用激活标签法
获得的过表达突变体为显性突变,突变体表型在
T1代即可直接观察到,因而极大的弥补了传统方
法构建隐性突变体的不足。目前,利用该方法已
经成功分离到了许多表型特异的突变体,Weigel
等 (2000)就利用此法分离到了30多个具有明
显表型的突变体。
本实验以野生型拟南芥 (Columbia)为研究材
料,通过基因激活标签系统构建拟南芥功能获得型
突变体库。该系统中所运用的转化质粒pCB260,
含有4个串联的CaMV35S启动子,并且在4x35S
的两端分别有一段Ds序列。我们将激活源与Ac灢
Ds系统结合起来,这样能够得到更多的突变位点。
该增强子的超强表达,能使邻近基因过量表达,便
于分析特殊表型性状,从而研究相关基因功能。其
中的除草剂抗性标记基因,使筛选工作简单易行。
该基因激活标签系统及所构建的功能获得型突变体
库具有其他T灢DNA插入标签系统无法比拟的优点,
因而在功能基因组研究中具有重要作用。目前利用
此方法已初步筛选得到约10000株拟南芥基因
激活标签突变株,经初步筛选观察,其中有约
50株植株具有特殊表型性状。我们挑选了其中
一些具有特殊表型的突变体植株,运用 TAIL灢
PCR技术扩增 T灢DNA 侧翼序列,成功定位了
10个突变植株中T灢DNA的插入位点。该拟南芥
基因激活标签突变体库的建立对于后期研究拟南
芥中重要功能基因打下了良好的基础。
1暋材料与方法
1灡1暋材料
植物材料:实验所用的材料为拟南芥 (Arabidopsis
thaliana)生态型Columbia。种子为实验室保存。
菌株和质粒:实验所用的农杆菌菌株为GV3101,激
活标签载体为pCB260 (图1),该质粒含有卡那霉素抗性
筛选标记,在T灢DNA右边界具有4个串联的CaMV35S
增强子序列,T灢DNA左边界含有一个Basta抗性筛选标
记基因。其他试剂为国产或进口分析纯试剂。
图1暋pCB260激活标签载体结构图
Fig灡1暋ThestructureofactivationtaggingvectorpCB260
45暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
1灡2暋TAIL灢PCR分离T灢DNA侧翼序列
参照Liu等 (1995)的方法。TAIL灢PCR的6个特异引物:
pCB260LB1:GATTATTGCTCGGGTAGATCGTCTTG
pCB260LB2:CATATGTGGGTTAGCATTCTTTCTG
pCB260LB3:GGTACCAAAACCACCCCAGT
pCB260RB1:ACCTTTTCGAGTATCAATGGAAACTTAACCG
pCB260RB2:CAACGGAGAGTGGCTTGAGATCGGCA
pCB260RB3:CAATGGCCCTTATGGTTTCTGCATCTAG
六个兼并引物:
AD1:NGTCGASWGANAWGAA
AD2:TGWGNAGSANCASAGA
AD3:AGWGNAGWANCAWAGG
AD4:STTGNTASTNCTNTGC
AD5:NTCGASTWTSGWGTT
AD6:WGTGNAGWANCANAGA
第一轮PCR反应程序:94曟 2min;95曟 1min;
[94曟 30s,62曟 1 min,72曟 2灡5 min]5 个循环;
[94曟30s,25曟3min(50%ramp),72曟3min(32%
ramp)]2个循环; [94曟 10s,68曟 1min,72曟 2灡5
min,94曟10s,68曟1min,72曟2灡5min,94曟10s,
44曟1min,72曟2灡5min]15个循环;72曟7min。将
第一轮产物稀释50倍取1毺l作为第二轮反应的模板,
第二轮PCR反应程序为:94曟 3 min; [94曟 10s,
64曟1min,72曟2灡5min]5个循环;[94曟10s,64曟
1min,72曟2灡5min,94曟10s,64曟1min,72曟2灡5
min,94曟10s,44曟1min,72曟2灡5min]15个循环;
[94曟10s,44曟1min,72曟2灡5min]5个循环;72曟
7min。将第二轮产物稀释12灡5倍取1毺l做第三轮模板,
第三轮反应程序为:[94曟10s,44曟1min,72曟2灡5
min]30个循环;72曟7min。三轮反应体系均为20毺l。
2暋结果
2灡1暋拟南芥植株的转化
本实验中采用拟南芥Columbia生态型用于
转化,平均转化效率约为1%,目前我们已筛选
到约10000株含有pCB260质粒的转化植株。研
究发现,植株抽薹开花生长至花蕾旺盛期时转化
效率最高,无需打顶,以免植株受损影响生长;
连续转化两次有利于提高植株的转化效率,采用
花序浸泡法或喷雾法均可;另外,筛选植株时,
用0灡1%的除草剂Basta即可得到较好效果,小
苗刚长至3~4片真叶时喷洒除草剂Basta效果
最好。
2灡2暋T1代转基因植株的表型分析
本实验所构建的功能获得型基因激活标签突
变体库,T1代筛选出的转化植株即可直接观察
表型变化。目前已经发现约50株具有特殊表型
的转化植株,主要包括:花期改变 (早花、晚
花)、株型变异 (株型矮小、多分蘖)、叶型特异
(叶柄变长、叶片翻卷、叶面皱缩、无叶表皮毛)、
育性降低、花发育异常、花粉异型、种子颜色改
变等。典型的突变株表型见图2、图3所示。
2灡3暋T灢DNA侧翼序列的分离
利用TAIL灢PCR的方法,目前已分离到10
个突变株中 T灢DNA 的侧翼序列,测序结果在
NCBI上比对,找出T灢DNA的插入位点 (htp://
www灡ncbi灡nlm灡nih灡gov/BLAST),如表1显示,激
活标签在拟南芥5条染色体上均有插入。
表1暋TAIL灢PCR扩增部分侧翼序列在拟南芥基因组中的比对分析
Table1暋BlastanalysisofpartialflankingsequencesamplifiedbyTAIL灢PCRinArabidopsisgenome
突变体编号
Numberof
mutantlines
表型
Phenotype
染色体
No灡of
chromosome
暋暋暋暋暋基因信息
暋暋暋暋暋Descriptionofgene
BlastN结果暋BlastNresults
分数
(Score)
E值
(E灢value)
相关性%
Identity
PCB1 败育 2 ATPbinding/ATPase/nucleoside灢triphosphatase 1235 0灡0 99
PCB2 败育 2 RapidALkalinizationFactor(RALF)familyprotein 654 0灡0 99
PCB3 败育 1 unknownprotein 706 0灡0 99
PCB4 败育 3 histoneH2B,putative 1116 0灡0 99
PCB5 种子白化 5 OriginRecognitionComplexsubunit3 440 3e灢122 99
PCB6 早花 4 lipid灢associatedfamilyprotein 538 1e灢151 99
PCB7 晚花 1 diseaseresistanceprotein(CC灢NBS灢LRRclass) 1011 0灡0 97
PCB8 矮小不育 1 AUXINRESPONSEFACTOR17 73 le灢11 95
PCB9 种子白化 1 Encodesthecytosolicminorisoformofnitratereductase(NR). 948 0灡0 99
PCB10 晚花 3 cytosolicsmalribosomalsubunit 900 0灡0 97
551期暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋关艳龙等:激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
图2暋部分典型拟南芥突变株表型
1.晚花;2.早花 (右);3.多分蘖;4.败育;5.多层莲座、不抽薹;6.叶片上卷;7.叶片下卷;8.野生型;9.叶柄长;
10.叶柄短;11.叶片无表皮毛;12.叶片发黄;13.种子颜色变浅 (左)、野生型 (右)
Fig灡2暋PhenotypesofsometypicalArabidopsismutants
1.Lateflowering;2.Earlyflowering(right);3.Moreramus;4.Sterile(left);5.Dwarfmoreleaves;6.Unnormal
crimpingleaves;7.Unnormalcrimpingleaves;8.WT;9.Longpetiole;10.Shortpetiole;11.Trichomeless;
12.Yelowleaves;13.Thinseedcapsulecolor(left),WT(right)
3暋讨论
3灡1暋pCB260激活标签突变体库的优势与特色
激活标签载体是由 Walden研究组最早设计并
应用的突变体的功能研究中 (Hayashi等,1992)。
该载体含有一个4x35S增强子,该增强子在
CaMV35S的启动子下组成性表达。后来由 Weigel
65暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋 暋暋暋暋暋暋暋云暋南暋植暋物暋研暋究暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋第32卷
等 (2000)在此基础上构建了pSKI015,该载体
增加了pUC19的一段序列以及T3测序序列,从
而可以利用质粒拯救的方法,方便地分离到T灢
DNA侧翼序列。Weigel等 (2000)最早将pS灢
KI015应用于拟南芥大规模功能获得型突变体库
的构建中。本突变体库所使用的pCB260激活标
签载体,在筛选标记BAR后面加入了GFP,这样
可以通过GFP观察进一步验证转基因的可靠性,
特别是我们在4x35S两侧分别加入了Ds元件,利
用这种载体转化获得的转基因植物可以进一步与
含Ac元件的转基因拟南芥杂交,利用Ac灢Ds系
统将4x35S元件移到其它位置,从而转变为Ac灢
Ds系统的突变体库,也就是说我们的突变体库是
将T灢DNA插入的activationtag与Ac灢Ds系统融合
在一起,综合了以前单一利用activation灢tag或者
单一利用Ac灢Ds系统的优点。
图3暋部分特异拟南芥突变株花及花粉形态
1.野生型花;2.野生型花;3.花丝较短;4.无花粉粒;5.三花丝;6.三叶片;7.野生型花粉;8.突变体花粉
Fig灡3暋PhenotypesofflowerandpoleninsomespecialArabidopsismutants
1.FlowerofWT;2.FlowerofWT;3.Shortfilaments;4.Nopolen;5.Fewfilament;
6.Fewpetal;7.PolensofWT;8.Polensofmutant
751期暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋关艳龙等:激活标签法构建拟南芥突变体库及其表型分析暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋暋
3灡2暋激活标签突变株表型及特殊功能基因研究
目前,在拟南芥中,利用激活标签系统已经
筛选获得了较多与植物发育、代谢调控、抗逆、
抗病等相关的基因。例如,与抗病相关的基因
(CDR1、FMO灢1),控制叶柄发育的基因 (LEP),
与茎强度有关的基因 (STRUDY),影响开花时间的
基因 (FT),调控花青素合成途径的基因 (PAP1、
ANT1),与油菜素内酯合成有关的基因 (BRI1)等
(Borevitz等,2000;Koch等,2006;Clouse等,1996;
Grant等,2003;Helen等,2004;Kardailsky等,1999;
Xia等,2004;Li等,2002;Park等,2002)。
本实验所筛选的突变株,表型变化主要涉及
早花、晚花、种子白化、育性降低4个方面。我
们对50个表型特异的突变株,运用TAIL灢PCR
方法扩增得到了其中10个突变植株T灢DNA侧
翼序列 (表1)。T灢DNA 侧翼序列经比对后发
现,T灢DNA插入位点处的基因涉及到:RALF
家族蛋白、生长素应对转录因子、组蛋白、脂质
相关蛋白、疾病抗性相关蛋白、硝酸盐还原酶
等。其中PCB8突变株与 AUXIN RESPONSE
FACTOR17 (ARF17)相关,该突变株表现为
株型矮小且部分不育。2005 年,Malory 等
(2005)报道ARF17受 miR160的转录后调控,
他们将ARF17与 miR160作用的序列引入点突
变后,使得 miR160不能正常剪切ARF17 的
mRNA,致使ARF17的 mRNA量较原来提高
几倍,然后导致生长素诱导的 GH3灢like基因,
YDK1/GH3灡2,GH3灡3,GH3灡5, 和 DFL1/
GH3灡6等转录水平变化,最终导致叶型不对称、
花瓣变小、花药发育不正常等发育缺陷。PCB8
突变株由于ARF17基因突变导致部分不育,进
一步印证了ARF17在调控拟南芥个体发育中的
重要作用。PCB9突变株对应的基因为nitrate
reductase(NR),该植株的种子颜色呈白色。
NR是产生信号分子NO的一个重要成员 (Desi灢
kan等,2002;Modolo等,2006),NO参与很多
植物发育及生理生化过程 (Neil等,2003;Wil灢
son等,2008),但 NO在种子颜色形成方面尚
未发现报道。下一步我们将针对这些基因,结合
其相关表型进行深入地研究探讨。
3灡3暋基因激活标签法的发展
随着植物功能基因组研究工作的飞速发展,
基因激活标签方法也在不断的完善和发展。例
如,激活标签法与玉米的非自主转座子元件Ds
结合而形成的转座子激活标签法,可比普通的非
转座子标签系统成功率提高10倍 (Marsch等,
2002)。将诱导性启动子引入基因激活标签系统,
通过各种诱导条件处理,如化学物质诱导、雌激
素诱导、热激诱导等,激活基因表达而产生各种
条件诱导型突变体 (Zuo等,2002;Matsuhara
等,2000)。另外,为了避免基因激活标签法筛
选功能获得突变体成功率低的缺陷,研究者将拟
南芥甲基化缺陷型突变体ddm 应用于该系统中
可以避免4暳CaMV35S启动子甲基化而导致的
基因沉默,以大幅提高功能获得突变株的筛选效
率 (Weigel等,2000;Chalfun等,2003)。
总之,基因激活标签系统已经成功应用于大
规模植物突变体库的构建筛选,并在拟南芥、水
稻、玉米等多种植物的功能基因组学研究中发挥
了重要作用 (Weigel等,2000;Nakazawa等,
2003;Jeon 等,2000; Marsch灢Martinez 等,
2002;曹冬梅等,2008)。因其特殊的性质,已
成为发现和研究新基因的有效工具。今后,结合
各种突变体库构建方法,基因激活标签系统必将
在植物基因工程研究中发挥更大的作用。本实验
室利用基因激活标签技术构建拟南芥突变体库、
分析特殊表型突变植株,从中筛选感兴趣的突变
体,为后续研究特殊功能基因构建了一个较好的
平台。
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