全 文 ：杨柳田头菇 B交配型基因信息素受体片段的克隆与分析*
陈卫民1,2,3, 柴红梅1,2,3, 张小雷1,2,3, 李树红1,2,3, 赵永昌1,2,3**
(1 云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 云南 昆明摇 650221; 2 云南省农业生物技术重点实验室,
云南 昆明摇 650221; 3 农业部西南作物基因资源与种质创制重点实验室, 云南 昆明摇 650221)
摘要: 利用简并 PCR及 DNA步移法, 从杨柳田头菇 Agrocybe salicacola YAASM0711 菌株中扩增得到了一个
4 231 bp的核酸片段。 经过比对及序列预测, 所获得序列中含有杨柳田头菇交配型编码基因中的信息素受
体部分, 其序列长度为 1 194 bp, 包含 4 个内含子, 5 个外显子的长度分别为 217 bp, 113 bp, 67 bp, 138
bp, 449 bp。 拼接后的 ORF全长 984 bp, 编码 327 个氨基酸残基。 该序列与灰盖鬼伞 Coprinus cinerea、 双
色蜡蘑 Laccaria bicolor信息素受体氨基酸序列较为相似, 含有 7 个跨膜区。 信息素受体遗传进化分析显示,
其与多个物种信息素受体聚集在一起, 可能与真菌信息素受体的多种起源有关。
关键词: 杨柳田头菇; 信息素受体; 交配型; 简并 PCR; 氨基酸序列
中图分类号: Q 75 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2012)05-519-06
Cloning and Analysis of Partial B Mating Gene Pheromone
Receptor in Agrocybe salicacola (Strophariaceae)
CHEN Wei鄄Min1,2,3, CHAI Hong鄄Mei1,2,3, ZHANG Xiao鄄Lei1,2,3,
LI Shu鄄Hong1,2,3, ZHAO Yong鄄Chang1,2,3**
(1 Biotechnology and Germplasm Resources Institute, Yunnan Academy of Agricultural Sciences, Kunming 650221, China;
2 Yunnan Provincial Key Lab of Agricultural Biotechnology, Kunming 650221, China; 3 Key Lab of Southwestern
Crop Gene Resources and Germplasm Innovation, Ministry of Agriculture, Kunming 650221, China)
Abstract: A 4 231 bp DNA fragment of B mating type pheromone receptor from strain YAASM0711 of Agrocybe sali鄄
cacola was obtained by using degenerate PCR and DNA walking techniques. The result of alignment and structure
prediction of DNA sequences showed that one 1 194 bp nucleotides gene ASRcb1 encoding B mating pheromone re鄄
ceptor was found, including four introns (72 bp, 49 bp, 48 bp and 41 bp) and five extrons (217 bp, 113 bp, 67
bp, 138 bp and 449 bp). The spliced open reading frame (ORF) contains 984 bp nucleotides encoding 327 amino
acid residues, and includes seven transmembrane protein regions as in its similar sequences of Coprinus cinerea and
Laccaria bicolor pheromone receptors. The genetic evolution of pheromone receptor showed ASRcb1 was clustered
with more receptors, which suggested multiple ways of evolution occurred in fungi.
Key words: Agrocybe salicacola; Pheromone receptor; Mating type; Degenerate PCR; Amino acid sequence
摇 作为四极异宗结合的担子菌, 在有性生殖
阶段的初期, 交配系统由位于不同染色体上的
A、 B双因子控制。 其中 A 交配因子位点基因编
码类似同源结构域的蛋白质, 控制两个亲本细胞
的配对, 并诱导锁状细胞的形成; B 位点基因编
码信息素及其受体, 控制着锁状细胞的融合和核
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2012, 34 (5): 519 ~ 524
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 3724 / SP. J. 1143. 2012. 12028
*
**
基金项目: 国家自然科学基金项目 (31101591), 云南省应用基础研究计划 (2011FZ214) 及现代农业产业技术体系建设专项资
金 “国家食用菌产业技术体系冶 (CARS鄄24)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: yaasmushroom@ yahoo. com. cn
收稿日期: 2012-03-07, 2012-07-11 接受发表
作者简介: 陈卫民 (1978-) 男, 博士, 副研究员, 主要从事大型真菌遗传学研究。 E鄄mail: chwmkm@ yahoo. com. cn
迁移过程 (Swiezynski 和 Day, 1960; Raper, 1966;
Riquelme等, 2005)。
以往有关担子菌交配型基因数量的研究多利
用传统遗传统计的方法。 根据自交不亲和理论,
对收集不同来源的菌株进行杂交, 发现自然界中
裂褶菌 ( Schizophyllum commune) 和灰盖鬼伞
[Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus)] A 和 B
位点存在极高的多态性, 在灰盖鬼伞中可能存在
160 个 A位点和 79 个 B 位点 (Raper 等, 1960;
Day, 1963)。 我国学者通过对香菇 ( Lentinula
edodes) 自然群体估测认为存在着 121 个不同的
A因子和 151 个不同的 B 因子 (林芳灿等,
2003)。 担子菌中存在如此之多的交配型基因,
也就为克隆及清楚了解 A 和 B 位点基因信息造
成了很大的障碍。
随着有关高等真菌交配型基因信息的不断扩
充, 研究者发现很多真菌信息素前体分子的羧基
端存在保守的 CAAX 模体 (B觟lker 和 Kahmann,
1993), 另外也发现了信息素受体具有一些保守
的氨基酸序列。 根据这些特征, 运用兼并 PCR
的方法分别克隆出黑木耳 (Auricularia auricula)
及香菇 B位点基因片段 (肖扬等, 2006; Li 等,
2007; 鲍大鹏等, 2008; 李苏等, 2009 )。
杨柳田头菇 (Agrocybe salicacola) 是目前仅
在云南发现的种 (杨祝良等, 1993)。 由于其味
道鲜美及较高的药用价值, 是一种潜在的可驯化
珍稀种类。 另外, 已证明杨柳田头菇是独立的生
物学种 (周会明等, 2010, 2011; 陈卫民, 2011;
Chen 等, 2012), 菌株 YAASM0711 具有容易出
菇、 部分单孢菌株自交形成无孢 /少孢菌株等特
点, 是担子菌遗传研究很好的材料。 在本研究
中, 通过简并引物的方法, 克隆杨柳田头菇信息
素受体片段, 分析结构组成, 并用特异性引物对
单核菌株进行验证分析, 为杨柳田头菇有性生殖
遗传及育种研究提供重要的信息。
1摇 材料和方法
1. 1摇 实验菌株
杨柳田头菇 YAASM0711 菌株采自云南省香格里拉
县建塘镇, 利用栽培的子实体获得 210 个单核菌株, 并
通过对峙培养进行 4 个极性 (周会明等, 2010) 的确定。
其中的 110 菌株为 A1B1 型, 作为本实验的出发菌株。
1. 2摇 菌株培养及 DNA提取
接种少量菌丝体到 5 mL YPD (0. 2%蛋白胨, 0. 2%
酵母粉, 2%葡萄糖, pH自然) 液体培养基中, 25 益恒
温培养两周。 取菌丝体置于 2 mL离心管中, 液氮冷冻条
件下研磨至粉末状, 使用 CTAB法抽提基因组 DNA。
1. 3摇 信息素受体 DNA序列扩增
以简并引物 Len鄄F 及 Len鄄R 扩增信息素受体编码保
守区序列 (鲍大鹏等, 2008), 所得片段回收后连接到
pMD18鄄T载体 (TakaRa) 进行克隆测序。 根据所得的序
列, 用染色体步移法, 设计巢式引物, 扩增信息素受体
编码基因全长。 所用 PCR反应引物见表 1, 反应体系及
条件按照 Genome Walking Kit试剂盒说明书进行 (TaKa鄄
Ra)。 PCR 产物用 1%的琼脂糖凝胶电泳检测, 符合预测
片段大小的进行载体测序。 本实验所用引物的合成及序
列测定均在上海生工生物工程有限公司完成。
表 1摇 简并 PCR、 染色体步移及特异验证引物序列
Table 1摇 Primers for degenerate PCR、 DNA
walking and special test
引物
Primers 核酸序列 DNA sequences
简并引物 Degenerate primers
Len鄄F 5忆鄄CCNTGGCAYHTNCARGCNTGGAA鄄3忆
Len鄄R 5忆鄄DATRTCRA ANCKRTGNCCYTGNAC鄄3忆
染色体步移引物 (第一轮)
Primers for DNA walking (First round)
1F1 5忆鄄TGTGCGTCTCGCTTTCGTTATTCATTTCTC鄄3忆
1F2 5忆鄄TTTGCATCAGCCGCCGCCTCTACTA鄄3忆
1F3 5忆鄄GAAGATGTGCGTTCTGTGTTTTGTCCC鄄3忆
1R1 5忆鄄GTGAGGTAGTAGAGGCGGCGGCTGATG鄄3忆
1R2 5忆鄄AGAAATGAATAACGAAAGCGAGACGCACAGAT鄄3忆
1R3 5忆鄄GGTTCCTGAGATTGCCACTCCATACGATAG鄄3忆
染色体步移引物 (第二轮)
Primers for DNA walking (Second round)
2F1 5忆鄄ATCACCTCCCCGCCGTTGTTGTTCC鄄3忆
2F1 5忆鄄TGCTGAGAAACGAGAAACAATGG鄄3忆
2F3 5忆鄄CGGATGCCAGCGACAGAGACTATT鄄3忆
2R1 5忆鄄AGCAGCCGCAGTAGTTCCAAGCC鄄3忆
2R2 5忆鄄AGAGGTCCACGGGAGGGTTAGGT鄄3忆
2R3 5忆鄄GGCAGCGTTTCGGTTAGTGTTGG鄄3忆
1. 4摇 序列分析
所得的序列用 DNAStar 软件包里的 SeqMan 进行拼
接, 并将序列在 NCBI 数据库里进行搜索, 获得序列相
近的编码基因。 并根据相近基因的序列特征, 以及内含
子两端的特征 (GT鄄AG), 拼接信息素受体全长基因,
并翻译成氨基酸。 蛋白质二级结构预测通过 TMHMM 程
序在线提交完成, 网址为 http: / / www. cbs. dtu. dk / serv鄄
ices / TMHMM鄄2. 0。
025摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
拼接得到的受体基因和 GenBank 上下载获得的信息
素受体序列一起用 Cluxtal X 进行序列比对 (Thompson
等, 1997), 去除两端长短不一及模糊的比对的部分, 使
序列长度基本一致。 将比对好的序列转换为 nexus 格式
文件, 系统树的构建采用 PAUP 4. 0b10 软件 (Swofford,
2002) 中的邻接法 (neighbour joining analysis, NJ)。 在
分析过程中, 将 Alignment 序列中出现的空缺作为信息
丢失 (missing)。 子矩阵使用 PAM250。 采用随机方式添
加序列搜索得到进化树, 重复次数为 1 000。 分支的支
持率 (bootstrap proportions, BP) 使用自举法进行分析
(bootstrap analysis), 1 000 次重复。
2摇 观察结果
2. 1摇 保守区及上下游序列扩增
以 YAAS0711 菌株分离得到的单核 110 菌株
DNA为模板, 采用兼并引物进行扩增, 获得一
个 530 bp左右的片段, 分离纯化得到的扩增片
段连接载体并转化到感受态细胞, PCR 检测片
段大小正确的克隆送交测序。 获得的核酸序列在
NCBI数据库中进行搜索, 与灰盖鬼伞、 双色蜡
蘑及裂褶菌信息素受体编码基因有较高的相似
性。 由此推测所获得的核酸为 A. salicacola信息素
受体编码基因 (ASRcb1) 片段。
根据得到的序列, 设计特异性引物 (表 1),
并按照 Genome Walking Kit试剂盒说明书, 特异
性引物和试剂盒随带引物配对, 先后经过两轮染
色体步移对上下游序列进行扩增。 经拼接后最终
共获得 4 231 bp的核酸序列 (GenBank JQ765701)。
2. 2摇 信息素受体序列分析
根据所获得的序列, 并参照数据库里已知
相似基因的序列信息, 以及内含子的结构特征
(GT鄄AG), 信息素受体编码全长基因 ASRcb1 共
1 194 bp, 包含 4 个内含子, 长度分别为 72 bp,
49 bp, 48 bp, 41 bp, 5 个外显子的长度分别为
217 bp, 113 bp, 67 bp, 138 bp, 449 bp。 拼接后
的 ORF 全长 984 bp, 编码 327 个氨基酸残基
(图 1)。 经过比对, ASRcb1 与灰盖鬼伞、 双色
蜡蘑信息素受体氨基酸序列较为相似, 相同率及
相似率均超过 70%及 80% 。 其氨基酸序列保守
区与相似基因序列相比有明显的保守区, 高度相
似的有WCDISS, 但与已报道的保守片段 PWHQAW
不同 (O爷Shea等, 1998), ASRcb1 中的 HQ中间
插入了一个异亮氨酸 (I)。
图 1摇 ASRcb1 基因的核酸及氨基酸序列 (阴影部分为内含子)
Fig. 1摇 Nucleic and amino acid sequence of ASRcb1 (shaded sequences were introns)
1255 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈卫民等: 杨柳田头菇 B交配型基因信息素受体片段的克隆与分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
摇 作为信号接受分子, 信息素受体嵌在膜上。
使用 TMHMM 在线提交软件, 预测出 ASRcb1 共
有 7 个跨膜区 (表 2), 这一结果与已知的信息
素受体跨膜区个数相同。
2. 3摇 信息素受体遗传进化分析
经过序列比对和进化树的构建, 所分析序列
大致分为 5个类群, 其中 ASRcb1 (Agrocybe salica鄄
cola YAASM0711) 位于类群玉中, 与双色蜡蘑、
灰盖鬼伞等物种信息素受体聚在一起 (图 2)。 另
外在类群玉还有 Coprinellus disseminatus、 Postia pla鄄
centa、 Serpula lacrymans、 Flammulina velutipes 和香
菇等物种, 聚集了大部分的供试物种。 类群玉进
一步和包含有裂褶菌 ( Schizophyllum commune)
的类群域聚在一起, 并逐级和类群芋、 郁、 吁聚
集。 在其它的几个类群中 (除吁类群) 也都有
多个物种信息素受体聚集在一起。 在形态及遗传
进化分类上与杨柳田头菇较为相近的光滑环锈伞
(Pholiota nameko) 则位于离其较远的类群芋中。
图 2摇 基于信息素受体序列分析构建的邻接树 (分支处数字代表 1 000 次重复的支持率, 大于 50%者在图中显示)
Fig. 2摇 Neighbour鄄joining tree based on analysis of pheromone receptor sequences
(The numbers at the nodes represent bootstrap supported from 1 000 replicates, and the values above 50% were shown)
225摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 34 卷
表 2摇 ASRcb1 基因氨基酸跨膜区
Table 2摇 The transmembrane regions of ASRcb1 amino acid sequence
编号 No. N末端 N鄄terminal 跨膜区域 Transmembrane region C末端 C鄄terminal 长度 Length
1 10 LFPTFAFLGFVVSLIPLPWHIQA 32 23
2 39 AFMLWTAISCLTGFVNSIVWSGN 61 23
3 76 IIIGVSVGIPAAILCISR 93 18
4 114 MVIIDLCIAVGIPVIIMTLHYIV 136 23
5 163 YLMWPVVLGAISFVFSVFVALTL 185 23
6 213 LVLLAIIDMMCTVPLGVYTIWIG 235 23
7 277 LTRWLPVLCAFLFFALFGFASEA 299 23
摇 从物种信息素在类群中分布情况来看, 存
在具有多个供分析信息素受体序列的物种, 如香
菇分布在类群玉、 域和郁中, 灰盖鬼伞信息素受
体在除类群吁外的其它类群中均有分布。
3摇 讨论
3. 1摇 ASRcb1 基因结构组成
真菌交配型基因是控制有性生殖过程最重要
的基因之一, 控制着整个循环的进行, 因而其结
构成为真菌有性生殖研究最需要了解清楚的内
容。 本研究通过简并引物扩增及染色体步移的方
法, 获得了杨柳田头菇 YAASM0711 菌株的 B1
信息素受体全长序列 ASRcb1, 并进行了序列分
析及预测, 保守区域组成信息表明信息素受体与
已知的序列有较高的相似性, 这是田头菇属
(Agrocybe) 有性生殖基因研究的首次报道。 由
此可见, 简并引物扩增结合染色体步移法成为真
菌未知交配型基因分析的有效途径。
在已知的 B交配型基因中, 信息素前体编码
基因与受体基因多为串联, 因而在获得信息素受
体片段的基础上, 可以进一步克隆信息素基因
(Koltin, 1978; James等, 2004)。 在裂褶菌中, B琢
位点含有 3 个信息素编码基因和 1 个受体基因,
B茁1位点有至少 3 个信息素基因和 1 个受体基因
(Vaillancourt等, 1997); 灰盖鬼伞 B6菌株 B位点
有 3个单元, 每个由 3 个基因组成, 负责编码 2
个信息素和 1 个受体基因 (O爷Shea 等, 1998)。
在杨柳田头菇中, ASRcb1 上游约 1 800 bp 及下游
约 800 bp范围内没有预测到信息素前体, 而香菇
的信息素受体与信息素前体编码基因仅有 690 bp
左右距离 (李苏等, 2009), 灰盖鬼伞 B位点基因
中, 信息素受体与信息素前体间的距离也都小于
500 bp (O爷Shea等, 1998), 可见在真菌 B位点中
串联基因之间的片段长度相差较大, 并且信息素
前体编码基因较短, 因而在以后的基因克隆过程
中需要在上下游区域较大范围内进行序列分析。
3. 2摇 信息素受体蛋白组成特征
信息素受体的氨基酸组成最终决定了其功能,
其与信息素的结合会激发细胞内有关有性生殖的
信号传导过程, 进而控制着交配行为 (Kurjan,
1993)。 然而, 目前有关信息素受体氨基酸组成与
其功能相关的研究还未见报道, 这与其组成的多
样化程度较高相关, 可能阻碍了其规律性探索,
因而需要更多的信息素受体相关信息的扩充。
与其它已知的信息素受体一样 (Wendland
等, 1995; Vaillancourt等, 1997; Kothe, 2001; 李
苏等, 2009), ASRcb1 包含 7 个跨膜区域。 同样,
氨基酸组成具有多个保守区, 如 WCDISS 片段为
高度保守, 还有 PWHQAW片段, ASRcb1 仅比其
它担子菌中的受体多了 1 个氨基酸。 经过跨膜区
预测, 前 1 个片段位于膜外, 后 1 个片段位于跨
膜区, 在香菇中, 这两个保守区所在跨膜区的位
置与 ASRcb1 较为相似 (李苏等, 2009), 这些特
征是否与受体与信息素的识别及结合有关, 还有
待深入的研究。
3. 3摇 信息素受体蛋白的遗传进化
由于信息素及受体的组成比较复杂, 数量庞
大, 相关的遗传进化研究较少, 只有在灰盖鬼伞
的几个菌株相关信息素受体进行过遗传进化分析
(Riquelme等, 2005)。 在本研究中, 结合已有的
信息素受体信息资源, 探索杨柳田头菇和担子菌
信息素受体的遗传进化特征。 如进化树所示, 杨
柳田头菇受体和大部分的供试菌株受体聚在一起,
而且具有多个供试序列的菌株受体分布在多个类
3255 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 陈卫民等: 杨柳田头菇 B交配型基因信息素受体片段的克隆与分析摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
群中, 推测是多个受体序列在进化过程中, 经过
自然选择保留下来, 类群内序列保守性较高, 而
类群之间相差较大, 并且重组等方式造成类群多
样性很高的分布状态, 但一些保守区仍然很好的
遗传下来。 在灰盖鬼伞中, 作者认为该物种信息
素受体有两个起源, 并在以后的进化中经突变、
重组等方式形成了较为复杂的多样性 (Riquelme
等, 2005)。 这些研究为以后的物种鉴定、 遗传分
析, 乃至以后的育种研究都提供了可借鉴的依据。
也参摇 考摇 文摇 献页
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