全 文 ：馆藏植物标本与 iFlora*
方摇 涛, 曾春霞, 杨俊波**, 李德铢**
(中国科学院昆明植物研究所中国西南野生生物种质资源库, 云南 昆明摇 650201)
摘要: 构建准确、 有效的物种遗传信息库并运用其作为主要的物种鉴定检索数据库, 是新一代植物志
(iFlora) 与传统植物志的本质区别。 采集并准确鉴定数以万计的植物样品用于建立遗传信息库存在一定困
难, 随着遗传信息获取技术的快速发展, 使馆藏植物标本成为获取遗传信息的重要补充, 并具有提升遗传
信息库建设速度和可靠性的较大潜能。 本文结合已有的研究和实验室多年工作实践, 论述了植物标本作为
iFlora物种遗传信息提取材料的可行性和不可替代性; 总结了标本遗传信息提取过程中的主要困难和存在
问题, 并提出一些解决方法; 阐述了使用馆藏标本特别是利用模式标本材料构建遗传信息标准库对 iFlora
构建的重要作用和意义。
关键词: 新一代植物志 (iFlora); 植物标本; 遗传信息; 物种鉴定
中图分类号: Q 94-34, Q 948. 2摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 文章编号: 2095-0845(2013)06-687-06
Herbarium Collections and iFlora*
FANG Tao, ZENG Chun鄄Xia, YANG Jun鄄Bo**, LI De鄄Zhu**
(Germplasm Bank of Wild Species in Southwest China, Kunming Institute of Botany,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650201, China)
Abstract: The new generation flora, iFlora, is essentially different from other traditional floras, in that it will con鄄
tain a library of genetic information for use in specimen identification. Based on a combination of recent research and
our own laboratory work, we aim in this paper to: 1) discuss the feasibility and irreplaceability of herbarium speci鄄
mens as materials for use in the iFlora; 2) summarize the major difficulties apparent in the process of genetic infor鄄
mation acquisition from herbarium specimens and provide some viable solutions; 3) clarify the importance and sig鄄
nificance of herbarium specimens especially the holotype for building the reference library in the iFlora.
Key words: New generation Flora (iFlora); Herbarium specimens; Genetic information; Species identification
摇 近年来, 随着生态环境的急剧变化和社会
经济生活的快速发展, 人们对物种认识的要求与
日俱增。 如何让专业研究者和普通公众都能快
速、 准确识别植物, 并按需提取相关信息, 新一
代植物志 (或智能装置) iFlora 的研发将给出答
案 (李德铢等, 2012)。 iFlora是以计算机和信息
数字化等相关技术为基础, 融入最新 DNA 测序
技术, 有机整合并能进行物种信息存储、 更新的
人机互动开放式智能装置。 它能方便快捷地进行
物种准确鉴定, 并为使用者提供所需物种信息。
构建准确、 有效的物种遗传信息库 (reference
library) 是 iFlora从概念到现实的关键步骤和内
容。 采集并准确鉴定数以万计的植物样品用于建
立遗传信息库存在较大困难, 然而, 经过研究者
们 250 多年的标本采集, 标本馆已经积累了大量
标本。 近 30 年来, 对标本材料遗传信息提取已
植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 2013, 35 (6): 687 ~ 692
Plant Diversity and Resources摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 DOI: 10. 7677 / ynzwyj201313185
*
**
基金项目: 科技部科技基础性工作专项项目 (2013FY112600); 中国科学院仪器设备功能开发技术创新项目实施方案项目 (植
物遗传信息高效获取技术体系集成研制); 国家高技术研究发展计划 (863 计划) 主题项目 (2012AA021801)
通讯作者: Author for correspondence; E鄄mail: dzl@ mail. kib. ac. cn; jbyang@ mail. kib. ac. cn
收稿日期: 2013-09-11, 2013-09-29 接受发表
作者简介: 方摇 涛 (1987-) 男, 硕士, 主要从事特殊植物材料遗传信息获取研究。 E鄄mail: fangtao@ mail. kib. ac. cn
有一定研究, 特别是近年来遗传信息获取技术的
快速发展, 使馆藏植物标本成为包括遗传信息在
内的物种信息获取的重要补充, 并对遗传信息库
建设速度和可靠性提供了较大的提升潜能。
本文结合已有的研究和我们实验室工作实
践, 阐述馆藏植物标本在 iFlora 创建中的重要作
用, 存在的主要困难及其解决方法。
1摇 馆藏植物标本是 iFlora重要的实物基础
馆藏植物标本是植物名称及其主要形态学性
状的承载者, 是经典植物分类学的物质基础, 也
是传统植物志编研的原始数据和信息获取来源。
目前世界上 3 400 多个植物标本馆内收集了数以
亿计的标本 (Brooke, 2000)。 馆藏植物标本不仅
数目巨大, 且多数标本经过各类群分类专家的研
究, 为物种鉴定的准确性奠定了重要基础。 然而,
由于学科发展不平衡, 特别是分子生物学技术在
植物分类和系统学领域的影响 (Chase 等, 1993;
APG, 1998, 2003, 2009), 从事传统分类的研究者
越来越少, 并有进一步减少的趋势 (Li 等, 2011)。
进入 20 世纪后, 随着生态环境恶化加剧, 地球
上的植物开始以一种前所未有的速度灭绝, 种群
数量也大幅缩减, 物种生存空间不断收缩、 生存
环境日趋恶化、 分布区逐渐减少、 多样性急剧下
降, 使得物种的采集愈发困难 (庞峻峰和张亚
平, 2001; 田婕, 2006)。 因此, 馆藏植物标本不
仅具有重要的价值, 同时在发掘和利用好馆藏标
本获取物种信息和遗传信息方面具有重要意义。
iFlora的创建必须基于馆藏标本有目的的对物种
采集和鉴定, 而且按标准采集鉴定的植物标本也
能进一步充实标本馆的馆藏 (高连明等, 2012)。
2摇 馆藏植物标本是 iFlora重要的信息来源
通过对馆藏标本的研究, 不仅能准确掌握物
种的分布范围, 帮助研究者制定实验材料采集计
划, 同时有利于对物种形态特征变异度和物候等
信息的了解和提取, 为 iFlora 创建提供第一手准
确可靠的物种信息; 同时, 对于一些分布狭窄、
濒危等难以采集的材料, 直接从标本提取遗传信
息为 iFlora创建起到重要的补充; 另外, 对馆藏
植物标本材料遗传信息提取的深入研究, 为鉴定
困难类群的遗传信息提取和在相关领域的应用打
下坚实基础 (Savolainen 等, 1995; Cozzolino 等,
2007; Andreasen等, 2009; Lister等, 2010)。
2. 1摇 馆藏植物标本可以提供 iFlora 中重要的形
态学数据
在对植物标本的采集和研究中, 已经建立起
了较为完善和规范的植物形态描述的术语体系。
掌握整套术语, 几乎可以对任何分类群进行最基
本的形态描述。 从植物标本中可以直观地获得除
色彩外的大部分形态特征, 如根、 茎、 叶、 花和
果等特征, 基于形态特征的模式识别技术具有重
要的参考价值。
目前, 植物形态特征数据积累相对较多, 基
于形态数据的植物模式识别技术也取得了一些进
展 (杨雅等, 2012)。 美国史密森研究院、 哥伦
比亚大学和马里兰大学开发了世界上第一个植物
识别的移动应用程序———Leafsnap ( Belhumeur
等, 2008)。 Leafsnap 通过计算机视觉图像技术
将叶片图像与数据库进行对比, 用户可以快速比
较与提供照片的标本是否属于同一物种, 并由此
建立了 Leafsnap系统, 与 iPhone 手机等相结合,
实现手持设备的应用, 通过图像对比, 结果正确
率达到 80%以上 (Kumar 等, 2012)。 可见, 应
用计算机模式识别技术, 对大量植物种类进行全
方位的特征提取、 度量以及数学建模, 可以实现
对植物图像的计算机自动识别和分类, 将模式识
别技术应用于物种识别, 有可能开辟智能植物鉴
定的新局面 (方伟和刘恩德, 2012)。
2. 2摇 馆藏植物标本可以提供 iFlora 中植物分布
数据
植物分布数据主要包括植物生长位置及生
长环境两个方面, 它是研究者了解植物分布区和
进行样品采集等工作的基础。 目前, 中国数字植
物标本馆 (简称 CVH) 已完成中国科学院系统
13 家标本馆标本, 共计 2 850 000 份标本信息
(其中, 模式标本 6 500 多号) 及 1 550 000 张标
本图像的电子化 (http: / / www. cvh. org. cn / cvh_ /
aboutcvh)。 数字化标本信息包括标签信息, 即
标本采集人、 采集日期、 地点、 生境与海拔以及
鉴定信息和标本存放地点 (标本馆) 等和图像信
息。 基于已有的标本数据, CVH 支持基于省名
或县名的植物分布式检索 (http: / / pe. ibcas. ac.
cn / sptest / syninvok. aspx)。 这些丰富的标本数据,
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特别是采集地点、 海拔、 生境等信息, 为 iFlora
植物分布式检索提供了海量的参考信息。
2. 3摇 馆藏植物标本是 iFlora中遗传信息的潜在来源
建立植物 DNA 参考数据库是 iFlora 区别于
传统植物志的新内容, 也是 iFlora 用于物种快速
鉴定和检索的主要途径, 它的获取和应用技术是
实现智能化的核心之一 (李德铢等, 2012)。 现
代分子生物学技术可以较便捷地获取物种或个体
DNA序列信息, 并进行序列相似性比较, 从而
确定它们是否相同或在多大程度上相似。 虽然可
以很容易的获得未知植物材料的 DNA序列信息,
却没法在物种档案中进行查询、 比对, 因为到目
前为止还没有完成对全世界物种统一的 DNA 身
份档案建立。 标本馆的馆藏标本不仅为按标准采
集 DNA材料提供了准确的地理分布信息和广泛
的物种多样性信息, 同时也可能是一条有效获取
DNA材料样品的途径, 建立标本 (特别是模式
标本) 的 DNA条形码库已受到较为广泛的关注
(中国科协学会学术部, 2012)。 同时, 需要特别
关注的是基于植物标本材料获取遗传信息技术对
于 DNA高度降解的各类植物制品, 如中药材、
木制家具、 茶叶、 卷烟等, 以及土壤植物种子、
根系和动物消化物等材料中的遗传信息获取均有
较大参考价值。
2. 3. 1摇 馆藏植物标本遗传信息获取的难点
馆藏标本与常规材料不同之处在于: 1) 标
本 DNA高度降解 (Baker和 Morse, 2001)。 DNA
的化学性质极不稳定, 可以通过水解或氧化作用
自发降解。 储藏 50 年以上的植物标本, DNA 的
平均长度在 400 bp 左右 ( Rogers 和 Bendich,
1985)。 2) DNA 化学修饰作用。 化学修饰作用
广泛存在于标本 DNA 的 4 种碱基上, 如甲基化
(Masuda 等, 1999)。 3) PCR 抑制子。 在标本
DNA的提取物中有 PCR 抑制子的存在, 这些抑
制子是随 DNA 一起从标本中抽提出来的, 其成
分十分复杂, 例如卟啉残基、 未知盐离子或金属
离子、 糖降解产物等。 这些抑制子是 Taq酶的强
力抑制剂。 已有研究表明, 虽然使用 CTAB 法能
获得较高含量的 DNA, 但是由于 PCR 抑制子的
存在, 其扩增效果并不如提取 DNA 含量相对较
低的试剂盒方法 (S覿rkinen 等, 2012)。 4) 细菌
或真菌污染。 即使从标本中提取出了 DNA, 也
有可能不是植物本身所有的, 而是在储存过程中
大量快速生长繁殖的真菌或细菌的 DNA, 这些
外源 DNA 的污染使得核 DNA 片段 (如: ITS /
ITS2) 的获取相对困难, 必须设计植物特异性引
物 (方涛, 2013)。
2. 3. 2摇 馆藏植物标本遗传信息获取技术
2. 3. 2. 1 摇 国内外研究积累 摇 早在上世纪 80 年
代, 馆藏植物标本就开始被用于 DNA提取的相关
研究 (Rogers和 Bendich, 1985)。 国外对此研究
相对较多, 主要集中在不同提取方法比较优化等
方面 (Dr觃bkov觃 等, 2002; Ribeiro 和 Lovato, 2007;
S覿rkinen等, 2012)。 目前已公认基于二氧化硅吸
附的 Qiagen DNeasy Plant Kit试剂盒可以获得质量
较好的 DNA (Dr觃bkov觃 等, 2002; S覿rkinen 等,
2012)。 即使是一些上百年的植物标本中仍可提取
到适于 PCR 扩增的标本 DNA (Telle 和 Thines,
2008)。 随着标本遗传信息获取方法的不断优化,
从标本材料中已经可以有效获取 DNA片段, 特别
是条形码片段 (Steinke等, 2009)。 近年研究也发
现, 尽管标本质体序列中存在 C寅T / G寅A 的转
变, 但是获得的序列是可靠的, 可用于遗传信息
获取相关研究 (Staats 等, 2011)。 因此, 分子生
物学技术的发展使得利用标本材料获取遗传信息
成为可能, 并取得了较大的进展, 即使是高度降
解的材料, 也能在新技术的应用下通过改进 DNA
提取技术和方法、 缩短扩增片段等来加以利用
(Gugerli 等, 2005; Willerslev 和 Cooper, 2005;
Caramelli和 Lago, 2006)。
如果从馆藏标本上提取 DNA 形成共识, 那
么模式标本做为供试材料就需要重点考虑。 从模
式标本上进行 DNA 取样, 不用担心物种鉴定的
问题。 当然, 任何标本馆对模式标本的管理都非
常严格, 如果因为 DNA 取样而造成模式标本的
损坏, 是必须杜绝的。 随着 DNA 的提取和基因
测序技术的发展, 可能只需微量 DNA 样品就可
实现有效扩增和测序, 这将进一步增加使用模式
标本的安全性和有效性。
2. 3. 2. 2摇 iFlora研究团队对馆藏植物标本遗传信
息获取研究新进展摇 近年来, 通过对馆藏种子植
物 20 科 236 份标本材料遗传信息获取技术较为
系统的研究表明 (方涛, 2013), 多数标本通过
选择和优化 DNA 提取程序, 能提取到可满足
9866 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 方摇 涛等: 馆藏植物标本与 iFlora摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
DNA标准条形码扩增实验要求的 DNA (图 1),
且其提取时的最小样品量可以降低到 5 mg (约
0. 5 cm2叶片材料)。 在优化的遗传信息获取体系
下, 低于 500 bp 的目的片段, 其遗传信息获取
效率可以达到 40% (图 2)。 同时, 对于标本材
料这类困难模板, 加入优化剂, 如海藻糖 ( tre鄄
halose), DMSO, BSA和 Betaine等可能消除 DNA
抑制子对 PCR扩增的影响, 提高 PCR 扩增成功
率, 增加序列的读取长度 (高连明等, 2012; Sa鄄
marakoon等, 2013)。
图 1摇 标本材料总 DNA凝胶电泳图
“1 ~ 28冶 表示标本材料。 “M冶 表示 GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder, 100-3 000 bp, Thermo Scientific (Cat. SM0321)。
电泳结果表明: 绝大多数标本提取的总 DNA多为 1 000 bp以下片段
Fig. 1摇 Agarose gel electrophoresis of total DNA
“1-28冶, the ID for each sample. “L冶, GeneRulerTM 100 bp Plus DNA Ladder, 100-3 000 bp, supplied by Thermo Scientific (Cat. SM0321)
图 2摇 20 个科标本材料测序效率图。 山茶科标本 86 份; 虎耳草科、 杜鹃花科、 禾本科、 列当科标本各 15 ~ 16 份,
其它科标本材料各 4 ~ 9 份。 对于取样较少的科, 该结果只能作为参照, 还需后续验证
1. 木兰科; 2. 五味子科; 3. 樟科; 4. 毛茛科; 5. 木通科; 6. 金粟兰科; 7. 罂粟科; 8. 虎耳草科; 9. 葫芦科; 10. 秋海棠科;
11. 蔷薇科; 12. 胡颓子科; 13. 杜鹃花科; 14. 龙胆科; 15. 报春花科; 16. 天南星科; 17. 兰科; 18. 禾本科; 19. 山茶科; 20. 列当科
Fig. 2摇 Sequencing efficiencies of herbarium specimens from 20 families. Eighty鄄six accessions were sampled from Theaceae. Fifteen to Sixteen
accessions were sampled from Saxifragaceae, Ericaceae, Poaceae and Orobanchaceae respectively. Four to nine accessions were sampled for
other families. The result might be used for references only and required to be verified further for the families with relatively few samples
1. Magnoliaceae; 2. Schisandraceae; 3. Lauraceae; 4. Ranunculaceae; 5. Lardizabalaceae; 6. Chloranthaceae; 7. Papaveraceae;
8. Saxifragaceae; 9. Cucurbitaceae; 10. Begoniaceae; 11. Rosaceae; 12. Elaeagnaceae; 13. Ericaceae; 14. Gentianaceae;
15. Primulaceae; 16. Araceae; 17. Orchidaceae; 18. Gramineae; 19. Theaceae; 20. Orobanchaceae
096摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 植 物 分 类 与 资 源 学 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 第 35 卷
3摇 馆藏植物标本提取遗传信息的建议方案
3. 1摇 取样
由于馆藏标本数量巨大, 多数物种均有多份
可供 DNA提取的标本, 在取样时应仔细观察标
本的保存状况, 尽量选取表面无明显霉斑, 叶片
数目较多且明显处于快速生长期的标本。 在可能
的情况下尽量考虑优先使用模式标本材料; 尽量
选取保存时间较短的标本; 如果标本袋中有种子
也可优先考虑使用标本种子作为 DNA提取材料。
3. 2摇 总 DNA提取
在标本 DNA提取中, 外源污染的控制是决定
实验成败的关键。 作为 DNA提取的标本叶片首先
要经过外部消毒, 一般情况下需用 70%的乙醇溶
液擦洗干净。 DNA 提取过程中所有使用到的试
剂器皿均要保持无菌, 并需作平行对照试验。
DNA提取方法上, 商用试剂盒法具有较强的去
除 DNA附属干扰物、 较小的标本材料使用量和
提取 DNA浓度较为稳定等优点, 可优先考虑。
3. 3摇 目的片段的 PCR扩增
目前对于 PCR扩增已有很多优化程序和选择
(方涛, 2013; P覿覿bo 等, 1990), 针对来源于标本
DNA的总量往往偏低、 DNA 分子损伤、 降解严
重、 有效分子含量较低的特点 (Staats等, 2011),
在 PCR扩增时应尽量控制目的扩增片段的长度在
500 bp以内, 并适当增加模板 DNA 量和 PCR 扩
增反应循环次数。 由于 PCR的极端灵敏性, 使用
标本 DNA进行 PCR 扩增很容易受到实验室其它
DNA样品的影响, 严格的质量控制和平行对照实
验是必要的措施 (Handt等, 1994; Yang等, 1997)。
4摇 结语
馆藏植物标本有序的储藏了大量植物物种信
息, 是植物志编研和植物学相关研究的实物基础
和信息来源。 特别是自上世纪 80 年代分子生物
学技术的迅猛发展及其在生物学各领域的快速渗
透, 馆藏植物标本逐渐成为提供物种遗传信息的
重要来源。 目前对植物标本来源的 DNA的提取、
PCR扩增和目的片段的测序和核定都有了较为
系统和成熟的认识, 为 iFlora 创建工作中物种信
息的采集提供了重要基础。 iFlora 创建过程中按
标准采集的植物标本也将进一步丰富馆藏标本的
储量。 基于标本材料获取植物遗传信息的技术应
用对于 DNA高度降解的各类植物制品, 如中药
材、 木制家具、 茶叶、 卷烟等, 以及土壤植物种
子、 根系和动物消化物等材料中的遗传信息获取
均有较大参考价值。 目前快速发展的以短片段、
高通量、 高测序倍数为标志的新一代测序 (NGS)
技术的出现, 为使用馆藏植物标本作为遗传信息
的来源提供了极大的空间 (Taberlet 等, 2007;
Knapp 和 Hofreiter, 2010; Shokralla 等, 2012 ),
也是 iFlora创建的重要构件。 iFlora 的创建是一
种全新的对物种信息的采集和对各类相关技术的
集成, 将进一步改变人们对物种的鉴定方式和对
生物多样性的认识。
致谢摇 感谢中国科学院昆明植物研究所王红研究员在本
文撰写和修改过程中提出的宝贵意见。
也参摇 考摇 文摇 献页
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