全 文 ：一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响!
段瑞君!，沈竹夏
（! 青海大学生物系，青海 西宁 #!$$!%； 浙江大学生命科学院，浙江 杭州 &!$$’）
摘要：以一个缺磷胁迫诱导的钙调蛋白类基因 ()*+,-./为研究对象，采用拟南芥浸润转基
因方法获得了 ()*+,-./基因的 &01增强转基因植株。经 234)5647杂交检测表明，在 ()*+,-./
基因的增强转基因株系中，该基因的转录水平明显增强。实验结果表明 ()*+,-./基因降低
了增强转基因植株叶片的气孔指数和气孔导度，并且影响了植株的气孔分布。
关键词：拟南芥；钙调蛋白类基因；气孔分布
中图分类号：8 ’90 文献标识码：( 文章编号：$0&:;$$（$$0）$9: $&’$: $0
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A/B C#*3)：;%$<,=)#4,4 &1$-,$($；*?).),I6 J.KL3M?K,7 F676（()*+,-./）；1)3L.).K M,+)4,N?),37
钙调蛋白（-.KL3M?K,7；-./）是植物中主要的钙离子感受器，在一系列发育和胁迫相
关事件中起着重要的调控作用。许多环境刺激信号如光、温度、盐、触摸、重力、辐射、
激素等都会引起植物胞内游离钙离子浓度（［-.V］JO)）的变化，其浓度变化可以被钙调
蛋白所认知，并刺激信号传导途径的下游元件，从而引发植物的应激反应（W4..L .7M
<.I,+，!’’$；1.7M64+等，!’’’，$$；176MM67 .7M X43LL，!’’#；Y.7F .7M *33I.,.5，$$&；
U46Q.I.+ .7M /.K53，!’’#；D,6K,7+S,，!’’#）。Z?.7等（$$）提出将钙调蛋白分为 &类，即
典型的钙调蛋白、钙调蛋白类似蛋白、钙调蛋白相关蛋白。根据拟南芥基因库获得钙调蛋
云 南 植 物 研 究 $$0，D<（9）：&’$ [ &’9
95% E#%-(5% F,--%-(5%
! 收稿日期：$$9:!:，$$0:$9:%接受发表
作者简介：段瑞君（!’;9:）男，讲师，硕士。研究方向：植物生物化学与分子生物学。U6K：$’;!:0&!$$#%
C : L.,K：4?,\?7M?.7]O.533^ J3L^ J7
白类基因（!#$%&&’(）的有关信息，该基因注释为 ) *+),-. /)0123+0,4 $.4.，基因分析得
知该基因属于钙调蛋白类基因，由于该基因受低磷、低钾胁迫条件特异性诱导，故命名为
!56,7)8。
气孔是植物地上部分器官的特殊化的细胞结构，它通过调控两个保卫细胞之间的孔的
开度来调控叶和大气之间的气体交换（水的释放和二氧化碳的吸收）（9/:;2.3.;等，<((#）。
叶表皮上的气孔是有特色的间距分布而不是随机分布，并且气孔密度受内源和环境因子所
控制（=.)4..等，<((<），例如光照、温度、7>< 浓度和水分条件等的变化，都会导致气
孔数量的变化（?,/:)，#@A<；B;2C40..，<((#）。
我们在拟南芥芯片杂交分析中发现了一个推测的钙调蛋白基因（D.4E)4F )//.66,24
G2H!#$%&&’(）与低磷胁迫有关，命名为 !56,7)8（!;)E,32*6,6 5,I6);-),24 ,43+/.3 7)8）。
为了研究 !56,7)8基因在植物信号传导中的分子机制，我们构建了 !56,7)8基因的 J’9
增强转基因植株，在此基础上对 !56,7)8基因的转基因植株的叶片气孔指数和气孔导度
进行了研究，旨在了解该基因对拟南芥叶片气孔分布的影响。
! 材料与方法
!! 植物材料的处理
以拟南芥（!#$%&’()%) *+#,%#-#）720+1E,)生态型为试验材料，生长的适宜温度白天为 << K
拟南芥正常培养基采用 #O< 89培养基。将拟南芥种子消毒，移入培养基，冷处理 < 3后转入生长箱
培养。将蛭石与珍珠岩按（JP#）的比例混好，培养 J个星期的拟南芥苗移入其中正常生长。
!# $%&’()*+基因的 ,-.增强转基因植株的构建
以拟南芥基因组 QG!为模板，引物 7)8RIS*、7)8RIT2C（根据 G7BU公布的拟南芥基因组序列，在
!56,7)8基因上游包括启动子区域设计引物）进行 57V扩增得到 A(( E*长度的片段，作为增强片断，将
此增强片段 构入 ?载体。取其反向克隆用 .$#/ 和 0)*/ 酶切切取该增强片断，?L 聚合酶平滑化，插入
*7!8BU!#J(#的 12#/ 位点，得到增强载体，酶切检测并测序。检测正确的质粒经 < ’((伏电击转入农杆
菌菌株 RW!#(’，加入 #&N的甘油 X %(M保存，备转基因用。采用拟南芥浸润转基因方法进行转化。转
化后的植株，正常生长，进行抗性筛选，得到转基因植株的纯合体，G2;:.;4检测得到 ?< 代植株。
引物序列如下：
7)8RIS*： ’Y !!7!?!!!!D777???7777?!???7 JY
7)8RIT2C：’Y ?D!7?!?D!D7!!!?7!?DD?7!!!7 JY
!, /0$提取和 012%3425杂交检测
将样品在液氮中研磨成粉末，然后加入 # 10 ?;,Z20，研磨后转入 #H’ 10 离心管中，剧烈摇匀，室温放
置 ’ 1,4。LM，低于 #< ((( O1,4离心 #( 1,4。取上清液，加入 (H< 10氯仿O异戊醇（
上层是无色水相，含 VG!。将无色水相转入一新的离心管，加入 (H’ 10异丙醇于上清液，颠倒混匀，室
温放置 #( 1,4。LM、不超过 #< ((( O1,4离心 #( 1,4，去上清液，加入 # 10 %’N乙醇，振荡，LM、不超
过 % ’(( O1,4离心 ’ 1,4。去上清液，空气干燥 #( 1,4，用 QR57处理水溶解。VG!样品检测完成后取 #(
!$ VG!进行 VG!电泳，G2;:.;4转膜，用
J< 5放射性同位素标记的基因全长序列引物（引物 7)8RIS*、
7)8RIT2C）进行杂交。
!6 气孔指数和气孔导度的测定
#@JL期 段瑞君等：一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响
取拟南芥座叶成熟叶片，采用指甲油影印法，用脱脂棉蘸酒精拭去叶片下表皮灰尘，在下表皮中部
涂抹上一层薄薄的指甲油。待其干后，剥取指甲油，放在载玻片上，使之自然伸展，盖上盖玻片，置于
显微镜下观察。取 !叶分别制成装片，同一装片选取 #个视野，在网形目镜测微尺下统计单位面积内
（$% &&’ $% &&）的气孔指数（即单位面积内气孔数目与所有细胞数目的比值），求平均值和方差，进
行显著性方差统计。
取成熟叶片中部，采用 ()*%+恒态气孔计测定在离体状态下的气孔阻力，则气孔导度为该气孔阻
力的倒数。
! 结果与分析
!# $%&’()*+增强载体的验证
将克隆得到的 ,-./0123基因构入 41,35),%6%载体，获得 ,-./0123基因的超表达的
增强载体，该增强载体采用 !#$ 7%&’$ 双酶切进行检测，结果如图 %所示，酶切得到 8
94大小的增强片段，表明构建的 ,-./0123基因增强载体已经构建成功，可以进行转基因
步骤。
图 % ,-./0123基因增强载体的酶切检测
:0;< % =>->?-0@A @B -C> ,-./0123 @D>E*>F4E>//0@A
D>?-@E 9G >AHG&2-0? I0;>/-0@A
图 ! 增强植株的 J@E-C>EA验证
:0;< ! KJ, ;>L 9L@- 2A2LG/0/ @B -C> ,-./0123 -E2A/?E04-
!! $%&’()*+增强转基因植株的验证
将 ,-./0123基因的增强载体通过拟南芥浸润转基因方法获得 ,-./0123基因的增强转
基因植株 M! 代。以 ,-./0123基因全长序列（引物 123N*O4、123N*(@P）作为探针，采用
J@E-C>EA杂交验证 ,-./0123基因的 6#Q增强转基因植株，结果如图 !所示，,-./0123基因
的增强两个株系 6#Q*,-./0123%、6#Q*,-./0123!都已明显增强了该基因的转录水平。
!, $%&’()*+增强转基因植株气孔指数的测定
取野生型拟南芥和增强转基因拟南芥成熟叶片，采用指甲油影印法，平均选取叶片 #
个部位（叶尖、叶中部、叶基部、叶尖边缘和叶基部边缘部位）在显微镜下统计单位面积
内（$% && ’ $% &&）的气孔指数，求其平均值和方差，进行显著性方差统计，试验结果
如表 %所示，,-./0123基因的 6#Q增强转基因的两个株系的气孔指数相对于野生型都有所
减小，气孔指数下降约 6R，表明 ,-./0123基因增强表达后会引起拟南芥叶片气孔指数
下降约 6R。
!S6 云 南 植 物 研 究 !T卷
表 ! #$%&’()基因的 *+,增强株系的气孔指数
!#$% & ’()*($ +,-%. ), #.+$ $%/ 012/3%0 +, 4(50+67
)8%29%.:2%00+), (2,0;%,+3 :$,(0（. < 0）
=2)1: , ’()*($ +,-%.
>( ?@ @A?BB < @A@@C
DB’!4(50+679& ?@ @A&EE < @A@@E
DB’!4(50+679? ?@ @A&FC < @A@@G
与 >(组比较 ! H @A@@&
表 - #$’()基因的 *+,增强转基因株系的气孔导度
!#$% ? ’()*($ 3),-13(,3% ), $%/ 012/3%0 +, 4(50+67
)8%29%.:2%00+), (2,0;%,+3 :$,(0（. < 0）
=2)1: , ’()*($ 3),-13(,3%
>( ?@ @AE&E < @A@&?
DB’!4(50+679& ?@ @ABEC < @A@@C
DB’!4(50+679? ?@ @AB@& < @A@&D
与 >(组比较 ! H @A@@&
-./ #$%&’()增强转基因植株气孔导度的测定
取野生型拟南芥和增强转基因拟南芥成熟叶片中部，采用 IJ9&F@@恒态气孔计测定在
叶片离体状态下的气孔阻力，气孔导度为该气孔阻力的倒数。求其平均值和方差，进行显
著性方差统计，结果如表 ?所示，4(567基因的 DB’增强转基因株系的气孔导度相对于
野生型均有所减小。
* 讨论
目前植物中，对逆境信息感受和传递的研究已引起了普遍的重视，这方面的研究结果
为植物对环境刺激信号转导提供了很好的证据。其中一个例子就是由 6?K 信使途径参与
了干旱和 4L4引起的地上部叶片气孔开闭的胞间信号传导过程（4$$%,等，?@@@；I+等，
?@@@）。钙调蛋白作为钙离子的主要感受器，在逆境信号传导中必然起着重要的作用。我
们在研究中发现 4(50+67基因属于钙调蛋白类基因（另文发表）。在一个单 MN9O,-结构
域的钙离子结合蛋白 PJ6的研究中，该基因的增强表达导致了拟南芥表皮毛形状的改变
（Q%--R等，?@@C）。本文通过对 4(50+67基因的转基因植株表型的研究，结果表明 4(50+9
67基因的 DB’增强转基因植株的气孔指数比野生型植株降低了 D@S左右（表 &），也发
现了 4(50+67基因的 DB’增强株系的气孔导度下降（表 ?），从这些变化我们推测是由于
4(50+67基因的超表达所导致的。当 4(50+67基因超表达，可能影响了植物的逆境信号
传导机制，从而影响了气孔的分布。
文献报道缺磷条件会导致植株叶片气孔导度的下降（T8+- ,- 6O2$)((%，&UG?），而在
缺磷条件下，4(50+67基因受缺磷信号的诱导表达增强；本文的研究结果也证明 4(50+67
基因增强表达导致气孔导度下降，所以推测缺磷条件下叶片气孔分布变化可能是与 4(50+9
67基因有关。
〔参 考 文 献〕
4$$%, =V，6O1 ’5，’3O1*3O%2 P， # $%，?@@@W 4$(%2,(+), )/ 0(+*1$1090:%3+/+3 ;12- 3%$$ 3$3+1* )03+$$(+),0 ,- 0()*($ 3$)0+,; +,
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DUDC期 段瑞君等：一个钙调蛋白类基因对拟南芥叶片气孔分布的影响
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SR/ 云 南 植 物 研 究 <3卷