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The Ployploid Induction and Identification of Platycodon grandiflorus (Campanulaceae) in China

中国桔梗多倍体诱导与鉴定



全 文 :中国桔梗多倍体诱导与鉴定 ?
王小华1 , 熊 丽2 , 屈云慧2 , 杨 静3 , 顾志建3
( 1 云南农业大学 , 云南 昆明 650201; 2 云南农业科学院花卉研究所 , 云南 昆明 650205 ;
3 中国科学院昆明植物研究所 , 云南 昆明 650204)
摘要 : 在离体培养条件下 , 比较了不同浓度、不同处理时间的秋水仙素对中国桔梗 ( Platycodon grandiflorus
A . CD) 进行染色体加倍的诱导效果。结果表明 : 用含 0 .1%秋水仙素处理 40 h后诱导频率可达 50% , 诱
导效果最佳。经秋水仙素诱导后形成的多倍体植株与原二倍体植株比较 , 在形态上 , 多倍植株叶片变宽变
大 , 叶色变深 , 茎变粗且节距长 , 气孔增大而单位叶面积气孔数目减少。对变异植株进行细胞学研究发
现 , 体细胞中期染色体数目为 2n= 4x= 36 , 而原二倍体的染色体数目为 2n= 2x= 18 , 基数 x= 9 , 因此 , 变
异植株 (2n= 4x= 36) 为四倍体。前者的核型公式为 2n= 4x= 14m+ 20sm+ 2st, 核型属于 2B ; 后者的核型
公式为 2n= 2x= 7m+ 10sm+ 1st, 核型也属于 2B。检测发现有少数个体有非整倍体变异。
关键词 : 中国桔梗 ; 多倍体诱导 ; 形态学和细胞学鉴定
中图分类号 : Q 943 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700(2006)06 - 593 - 06
The Ployploid Induction and Identification of Platycodon
grandiflorus (Campanulaceae) in China
WANG Xiao-Hua1 , XIONG Li2 , QU Yun-Hui2 , YANG Jing3 , GU Zhi-Jian3
(1 Yunnan Agricultural University, Kunming 650201 China; 2 Flower Research Institute ( FRI ) Yunnan Academy of Agricultural
Sciences, Kunming 650205 China; 3 Kunming Instituteof Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204 China)
Abstract : In in vitro culture of Platycodon grandifloruswas treatedwith colchicineat different concentration andtime du-
ration . It showed that the induction rate could reach 50% with colchicine at 0 .1% for 40 h . Compared with the normal
diploid plants, the polyploid plants had thicker and larger leaves, darker leaf color, stronger stemswith longer length per
stemstalk, larger stomata and fewer stomata per unit area . Cytological observation showed the chromosome number of
variant plants is 2n= 4x= 36 , while that of normal diploid plant is 2n= 2x = 18 , x= 9 . Therefore, the variant plants
(2n= 4x= 36) belongto tetraploid plants . Karyotype formula of the former is 2n= 2x = 14m+ 20sm+ 2st, and that of
the latter is 2n= 4x= 7m+ 10sm+ 1st . Both of the karyotype belong to Stebbins’s2B type . It was also found that a few
induced plantswere aneuploid .
Key words: Platycodon grandiflorus; Polyploid induction; Identification of morphology and cytology
中国桔梗 ( Platycodon grandiflorus A . DC )
属于桔梗科 ( Campanulaceae) 桔梗属 ( Platycodon
A . DC) 多年生草本植物 , 原产我国东北、华
北、华东、华中各省以及广东、广西北部、贵
州、云南东南部 ( 蒙自、砚山、文山 )、四川
(平武、凉山以东 ) 、陕西。朝鲜、日本、苏联的
远东和东西伯利亚地区的南部也有 ( 洪德元等 ,
1983) 。桔梗具有药用价值 , 其根入药 , 有清肺
利目、咽嗌、祛痰 , 止咳消痛散结的作用 ; 既具
食用价值 , 也具观赏价值 , 其花色淡雅 , 花期
云 南 植 物 研 究 2006 , 28 (6) : 593~598
Acta Botanica Yunnanica

? ?基金项目 : 云南野生花卉商品化开发关键技术研究 ( 中国桔梗 ) ( No . 08008)
收稿日期 : 2006 - 02 - 06 , 2006 - 05 - 10 接受发表
作者简介 : 王小华 (1974 - ) 女 , 湖南娄底人 , 在读硕士 , 从事花卉育种研究。E - mail : wangxiaohua270 . @yahoo. com. cn
长 , 抗逆性强 , 管理简便 , 被广泛应用于园林
中 , 或作切花或盆栽材料 ( 秦梅等 , 2004 )。由
于桔梗用途广 , 因而市场需求量大。Cho (2002)
利用野生桔梗有紫花、白花和黄花类型 , 经人工
自花授粉 , 获得了淡红色桔梗 , 魏建等 ( 2002 )
通过将不同地区的桔梗进行杂交 , 培育出了粉花
型桔 梗 , 两者皆 具观赏价值 ; 高山林 和舒娈
(2002) 用桔梗愈伤组织进行多倍体诱导 , 以期培
育出药用价值较高的品种 , 取得了一定的成果。
云南野生桔梗资源丰富 , 我们于 2004~2005 年在
对野生桔梗进行引种驯化选育的基础上 , 利用秋
水仙素对桔梗试管苗的茎尖进行多倍体诱导 , 以
期培育出花大、色艳、颜色丰富的桔梗。本文拟
对桔梗多倍体的诱导方法和变异株形态特征、细
胞学特性的观察结果等阶段性成果进行报道 , 为
桔梗多倍体育种研究奠定一定的理论基础。
1 材料与方法
1 .1 材料
试验材料 : 云南省农业科学院花卉所技术人员从云
南省丽江采集的野生桔梗经栽培选育出的株系。
对照材料 : 取选育株系上一个芽变 , 经灭菌消毒后 ,
接种于 MS+ BA 0.1 mg?L + KT 0.1 mg?L + NAA 0 .1 mg?L 培
养基上培养 , 每日光照 16 h, 光强 1 200 lx, 温度 25℃。
1 .2 方法
1 .2 .1 多倍体的诱导 将部分对照材料嫩茎按每段 0.5
cm且带一个节截取 , 并将每节两个叶片去半 , 然后用
0 .05% , 0 .1%秋水仙素处理 , 时间分别为 10 h, 24 h, 40
h, 60 h, 72 h, 处理后用无菌水漂洗 3 次 , 接种到 MS +
BA 0 .1 mg?L + KT 0 .1 mg?L + NAA 0.1 mg?L 培养基上培养。
每日光照 16 h, 光强 1 200 lx, 温度 25℃。
1 .2 .2 多倍体的鉴定 采用形态学和细胞学两种方法进
行鉴定
形态学鉴定 : 对经秋水仙素处理的外植体在培养基
上培养一段时间所形成的植株 , 待长出 2~3 轮叶片后 ,
撕取其叶下表皮制片 , 用显微镜观测气孔的大小及单位
面积内气孔的数量变化并拍照。然后与二倍体植株的相
应数据进行对比分析。
细胞学鉴定 : 对气孔显著增大的植株 , 待长出 2~3
轮叶片时 , 在上午 8: 00~9: 00 切取幼嫩芽尖 , 用自来
水洗净 , 10~20℃下 0 .002 % 8-羟基喹啉溶液预处理 2~
3 h, 无水乙醇 - 冰醋酸 (3∶1 ) 置 4℃冰箱中固定 2 h,
蒸馏水漂洗 3 次 , 每次 10 min, 60℃水浴中 0 .2 mol?L 盐
酸离析 5 min, 蒸馏水后低渗 30 min, 小心切取芽尖 , 置
载玻片中央 , 加卡宝品红 1 滴 , 染色 30 min后 , 压片 ,
镜检并拍照。然后与二倍体植株的相应数据进行对比分
析。染色体核型分析按李懋学和张赞平的方法 ( 1996 )
进行 , 核型不对称性按 Stebbins (1971 ) 的标准划分。
1 .2 .3 多倍体的纯化扩繁 对发现有加倍的嵌合体植株
采用分割技术进行纯化 , 再对确认为纯化了的多倍体植
株予以稳定并扩繁。
2 结果与分析
2 .1 C组织培养条件下秋水仙素对中国桔梗的诱
导效果
试验结果见表 1 , 其变异指标以气孔增大为
标准。从表中可看出 , 秋水仙素对桔梗多倍体的
诱导有一定的效 果。数据显示 : 药剂浓 度为
0 .1% , 处理时间为 40 h的效果最佳 , 变异率可达
50%。但随着秋水仙素浓度的增高 , 组培材料的
死亡率也上升 , 总诱导率下降。这里所指的死亡
率是指培养一个月后仍不能发芽的畸形体 , 呈透
明状 , 特别粗大 , 以后逐渐死亡。试验过程中发
现 : 培养基中琼脂浓度为 3 .5 g?L , 比正常琼脂
浓度 4 .5 g?L 稍低。这样 , 能提高诱变材料的成
活率和方便进行细胞学鉴定。
表 1 秋水仙素对中国桔梗的诱导效应
Table 1 The induction effect of colchicines on Platycodon grandiflorus
秋水仙素浓度 时间 ( h) 处理苗数 (株 ) 死亡数 ( 株 ) 死亡率 ( % ) 变异苗数 (株 ) 变异率 ( % )
Colchicines concentration Time Number of treated plants Number of dead plants Death rate Number of variation Variation rate
10 ?30 E0 f0 ?0 0
24 ?30 E0 f0 ?3 10 )
0 ?. 05 % 40 30 E0 f0 ?11 36 .7
60 ?30 E15 y50 28 26 ?. 7
72 ?30 E21 y70 24 13 ?. 3
10 ?30 E0 f0 ?0 0
24 ?30 E0 f0 ?5 16 .7
0 ?. 1 % 40 30 E2 f6 .7 15 50 )
60 ?30 E24 y80 22 6 .7
72 ?30 E30 y100 D0 0 ?
495 云 南 植 物 研 究 28 卷
2 .2 变异植株的形态学观察
与对照株比较 , 经秋水仙素处理的植株中 , 形
态上明显发生变异的植株的叶片比二倍体的叶片大
而且厚 , 颜色也较深 , 茎粗且节距长 , 生长旺盛
(图 1)。我们选择以观察其气孔来研究其形态指标 ,
发现变异株气孔明显增大 , 单位面积上气孔数目减
少 , 由此可认为 , 气孔明显增大是桔梗多倍体的形
态特征 , 可作为其形态学上的标志 (表 2, 图 2)。
2 .3 多倍体的细胞学鉴定
经细胞学观察 , 中国桔梗的体细胞染色体数
目为 2n= 18 , 基数 x= 9 , 核型公式为 2n= 2x= 7m
+ 10sm+ 1st, 核型属于 2B (图 3 , 表 3) 。其中第
1 , 2 , 7 对两条同源染色体为近中着丝点 (sm) ;
第 8 , 9 对两条同源染色体为中部着丝点 (m) ;
图 1 桔梗组培苗图 ( 在相同的条件下培养 30 天后拍摄 )
Fig . 1 Young plant tissue cultureof Platycodon grandiflorus
A . DC 30 days at the same cultural conditions)
表 2 变异株与二倍体植株的外部形态比较
Table 2 A comparision of morphological characteristics between variants and diploids
形态值 气孔长直径 (平均值 ) 短直径 ( 平均值 ) 气孔长直径?短直径 气孔面积 (平均值 ) 单位面积气孔数
Morphological (μm) (μm) (平均值 ) (μm2 ?) ( 个?10 ?μm2 )
data Stoma longdiameter Stoma shortdiameter Stoma longdiameter? Stoma area The number of
( mean) ( mean) shortdiameter ( mean) ( mean) stoma?10 ?μm2
变异株 variant 9 ?. 5 7 (1 N. 36 211 .13 6
对照株 diploid 5 ?. 5 4 (1 N. 38 69 .36 9
注 : 均取基部第 2 片叶 , 气孔面积 s (平均值 ) = 3 .14×长径 (平均值 ) ×短径 (平均值 ) , 样本数为 20
图 2 桔梗气孔
Fig . 2 Stomataof Platycodon grandiflorus
第 3 , 4 , 5 对同源染色体中有一条染色体为 m中
部着丝点 , 另一条为 sm近中着丝点 ; 第 6 对同
源染色体中有一条为 sm近中着丝点 , 另一条为
st近端着丝点。这几对不同型的同源染色体可能
是染色体臂间臂内倒位和互换发生变异造成的结
果。经加倍诱导后形成的变异植株的体细胞染色
体数目为 : 2n= 36 , 其染色体数目为原二倍体的
两倍 , 即为同源四倍体 ( 图 3 )。其核型公式为 2n
= 4x = 14m+ 20sm+ 2st, 核型也属于 2B (图 3, 表
3)。其中第 2 组 , 第 3 组 , 第 5 组都为 sm近中着丝
点; 第 8 组都为中部着丝点。第 1 组中两条染色体
为 sm近中着丝点 , 另两条为 st 近端着丝点; 第 4,
5956 期 王小华等 : 中国桔梗多倍体诱导与鉴定
6组中两条染色体为 m中部着丝点 , 另两条为 sm
近中着丝点; 第 7, 9 组中一条染色体为 m中部着
丝点 , 另三条为 sm近中着丝点。这几组同源染色
体发生的变异与原二倍体变异的方式相同。
图 3 桔梗体细胞中期染色体及核型
Fig . 3 Somatic karyotypes of Platycodon grandiflorus
3 讨论
3 .1 在本试验中 , 对经过不同浓度秋水仙素处
理过的存活下来的外植体 , 进行染色体数目的细
胞学观察时 , 发现它们的体细胞除了有完全的二
倍体细胞或完全的四倍体细胞外 , 还有既有二倍
体细胞又有四倍体细胞 , 有时甚至还有非整倍性
细胞的嵌合体植株。我们知道秋水仙素对中期细
胞的纺锤丝起作用 , 阻止其形成 , 影响染色体分
向两极而形成多倍体细胞 , 又因为在一个生长周
期中 , 处于分裂中期的细胞比较少 , 虽然 , 秋水
仙素对细胞有一定的毒害作用 , 但处理较短的时
间后去掉秋水仙素 , 使细胞恢复正常的分裂功
能 , 由于二倍体细胞的数量多于多倍体细胞 , 所
以二倍体细胞数目的增长指数快。当经过一段时
间的情况下 , 由于二倍体细胞的数目占绝对优势
而排挤掉多倍体细胞 , 最后分化成二倍体植株。
这与纪风高 ( 1987 ) 提出的秋水仙素药液浓度
低 , 处理时间短的情况下 , 成苗率高 , 但诱变低
的看法基本相同。另一方面 , 当处理的时间延长
时 , 间歇的二倍体细胞到了中期 , 由于秋水仙素
695 云 南 植 物 研 究 28 卷
表 3 桔梗二倍体和四倍体染色体参数
Table 3 Parameters of chromosome in diploid and tetraploid plants
Chromosome
No .
二倍体 diploid plants
2 Bn= 7m+ 10sm+ 1st
RL AR Type
Chromosome
No .
二倍体 diploid plants
2 ?n= 7m+ 10sm+ 1st
RL AR Type
Chromosome
No .
二倍体 diploid plants
2n= 7m+ 10sm+ 1st
RL AR Type
1 ?7 .14 1 B. 89 sm 4 5 b. 98 2 .50 sm 7 >4 .56 2 . 20 sm
1 ?6 .84 2 B. 43 sm 4 5 b. 70 1 .50 m* 7 >4 .56 1 . 83 sm
2 ?6 .84 2 B. 43 sm 5 5 b. 98 1 .63 m 8 >4 .84 1 . 13 m
2 ?6 .84 2 B. 00 sm 5 5 b. 41 2 .17 sm 8 >4 .56 1 . 29 m
3 ?6 .55 2 B. 83 sm 6 5 b. 13 2 .00 sm 9 >3 .70 1 . 60 m
3 ?6 .55 1 B. 56 m 6 4 b. 84 3 .25 st 9 >3 .70 1 . 60 m
Chromosome
No .
四倍体 tetraploid plants
2 0n= 14m+ 20sm+ 2st
RL AR Type
Chromosome
No .
四倍体 tetraploid plants
2 ?n= 14m+ 20sm+ 2st
RL AR Type
Chromosome
No .
四倍体 tetraploid plants
2n= 14m+ 20sm+ 2st
RL AR Type
1 ?3 .70 1 B. 89 sm 4 2 b. 99 1 .33 m 7 >2 .42 1 . 43 m
1 ?3 .70 1 B. 89 sm 4 2 b. 99 2 .00 sm 7 >2 .42 1 . 13 m
1 ?3 .70 3 B. 33 st 4 2 b. 85 2 .33 sm 7 >2 .28 1 . 29 m
1 ?3 .56 3 B. 17 st 4 2 b. 85 1 .50 m 7 >2 .28 2 . 20 sm
2 ?3 .70 2 B. 25 sm 5 2 b. 99 2 .00 sm 8 >2 .42 1 . 43 m
2 ?3 .42 3 B. 00 sm 5 2 b. 85 1 .86 sm 8 >2 .42 1 . 13 m
2 ?3 .28 2 B. 29 sm 5 2 b. 85 1 .86 sm 8 >2 .14 2 . 00 m
2 ?3 .28 1 B. 88 sm 5 2 b. 56 2 .60 sm 8 >2 .14 1 . 50 m
3 ?3 .13 2 B. 14 sm 6 2 b. 56 2 .00 sm 9 >2 .14 1 . 50 m
3 ?2 .99 2 B. 50 sm 6 2 b. 56 2 .00 sm 9 >2 .14 1 . 50 m
3 ?2 .99 2 B. 50 sm 6 2 b. 56 1 .57 m 9 >1 .97 1 . 69 m
3 ?2 .99 2 B. 00 sm 6 2 b. 42 1 .43 m 9 >1 .71 2 . 00 sm
RL , 相对长度 ; AR 臂比值 ; Type, 染色体类型。 RL , Relative length; AR , arm ratio; Type, typeof chromosome .
的作用而变成多倍体细胞 , 致使外植体中染色体
加倍细胞的数量增多 , 而二倍体细胞的数量不断
减少。当外植体中二倍体染色体数目和四倍体的
细胞数量差不多时 , 去掉秋水仙素的抑制作用 ,
进行正常情况下的培养 , 当恢复分裂能力后 , 由
于二倍体细胞一时难以排挤掉四倍体细胞 , 而表
现出即使培养一段时间后 , 植株中仍然还有两种
细胞存在的嵌合体植株 , 同时 , 也会出现少数加
倍细胞 , 在细胞分裂过程中可能会由于姊妹染色
体出现滞后而造成非整倍性细胞 , 并由于培养时
间不够长 , 而暂时没被其它倍性细胞完全排挤掉
而剩下极个别的非整倍细胞的情况 ; 当然 , 还会
有加倍后的细胞又继续加倍而成为八倍或更高倍
性的细胞也未被排挤掉 , 但本试验未检测到此种
情况。随着时间的继续延长 , 二倍体细胞的数量
越来越少 , 四倍体细胞数量越来越多 , 当多倍体
细胞的数量明显多于二倍体细胞时 , 去掉秋水仙
素的抑制作用 , 进行正常情况下的培养 , 由于多
倍体细胞的增殖速度快 , 经过一段时间后 , 整个
二倍体细胞由竞争不过整个四倍体细胞而最后形
成四倍体植株。当秋水仙素的浓度提高或处理的
时间达到一定的限度后 , 即便被诱导的外植体的
体细胞都变成多倍体的体细胞 , 但会由于细胞的
活力近于完全丧失 , 难于恢复分裂能力而死亡。
3 .2 组织培养过程中 , 用秋水仙素诱导中国桔
梗有 3 个特点 : ( 1) 以试管苗为材料 , 经秋水仙
素处理后 , 变异十分明显 , 变异芽粗壮矮小 , 以
0 .1%秋水仙素处理 40 h可获得较好的效果。 ( 2)
采用不定芽技术结合组织培养可以稳定四倍体桔
梗。秋水仙素诱导后有部分植株形成嵌合体 , 变
异细胞往往发生在 L-Ⅰ层或 L-Ⅱ层 , 或成扇形
突变。产生的变异细胞往往生活力弱 , 分裂速度
慢 , 而正常二倍体细胞生活力强 , 分裂快 , 从而
淹没变异细胞 , 产生与二倍体竞争 , 表现为回复
突变。将变异的器官或组织诱导产生不定芽 , 由
于不定芽由一个或几个表皮细胞发育而来 , 若这
部分细胞是多倍体 , 则形成的不定芽为多倍体 ,
及时从不定芽中分割下来继续培养 , 从而达到稳
定的目的。 (3) 组织培养能提高变异株的繁殖速
率 , 从而加速多倍体育种进程。
3 .3 气孔鉴定可作为多倍体鉴定的间接方法。
试验表明 , 桔梗多倍体 ( 即四倍体 ) 气孔一致地
明显大于二倍体气孔 , 鉴定结果较可靠。不过 ,
气孔鉴定结果只能是间接的证据 , 最终确定为多
7956 期 王小华等 : 中国桔梗多倍体诱导与鉴定
倍体要通过细胞学染色体鉴定。
3 .4 经细胞学染色体鉴定中国桔梗的体细胞中
期染色体数目为 2n= 2x= 18; 经加倍后的体细胞
中期染色体数目为 2n= 2×2x= 2×18 = 36 , 是原
二倍体的二倍 , 为同源四倍体。
3 .5 我们在检测中发现有极少数个体出现非整
倍变异。如 : 2n = 4x = 36 + 1; 2n = 4x = 36 + 2 ,
2n= 4x = 36 - 1 的情况。这可能是在细胞分裂过
程中姊妹染色体出现滞后的原因造成的。
3 .6 多倍体是植物进化的途径之一 , 多倍体因
其巨大性、抗逆性强及克服远源杂交的不育性等
特点而被园艺育种家所青睐。多倍体若用于无性
繁殖的花卉上 , 则可使花卉器官增大、色彩更好
或使某些种类花期延迟 , 可大大提高花卉的观赏
价值和商品价值。现已在兰花、百合、金鱼草、
萱草、矮牵牛等花卉上取得了优良成果 ( 孙敏红
和张蜀宁 , 2004)。另一兰花品种蝴蝶兰的原球
茎在含有 50 mg?L 的秋水仙素液体培养基中培
养 , 也得到四倍体植株 (陈振光 , 1996 )。贾敬
芬等用秋水仙素处理百合花丝组织培养的再生植
株 , 诱导产生了大花型的四倍体百合 (杨增海 ,
1987) 。黄济明 ( 1983) 则用百合的根段、茎段、
叶片、株芽等为材料 , 也获得了大花的百合新类
型 , 其茎秆、叶片、花果都显著大于二倍体类
型 , 为百合增添了新品种。本试验中桔梗多倍体
组培苗叶片较二倍体叶片明显大而厚 , 叶色深 ,
生长快 , 初步体现了多倍体在形态上的优势。根
据其他观赏花卉多倍体的观赏价值明显优于二倍
体 , 并结合目前我们培育出的四倍体桔梗组培苗
所呈现的生长优势 ( 巨大性 ) , 我们预测桔梗四
倍体植株的花应会大于二倍体花 , 观赏价值也会
优于二倍体植株。四倍体桔梗与二倍体桔梗的生
物学特性的比较 , 我们将会继续报道。
〔参 考 文 献〕
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