全 文 ：羽叶金合欢的 DNA 提取和 SSR 引物筛选
?
高 洁1 ,2 , 李巧明1
??
( 1 中国科学院西双版纳热带植物园植物系统与保护生物学实验室 , 云南 昆明 650223;
2 中国科学院研究生院 , 北京 100049 )
摘要 : 利用 SSR 分子标记对羽叶金合欢 ( Acacia pennata) 的野生种和栽培种进行了分析 , 利用改良的 CTAB
方法优化了其总 DNA 的提取方法 , 并优化了 PCR 扩增条件。从已有的金合欢属植物的 82 对 SSR 引物中筛
选出多态性高 , 稳定性好的 12 对引物作为羽叶金合欢的 SSR 分析引物 , 为进一步对其进行遗传多样性研
究提供了依据。
关键词 : 羽叶金合欢 ; DNA 提取 ; SSR 引物筛选
中图分类号 : Q 945 文献标识码 : A 文章编号 : 0253 - 2700 (2008) 01 - 064 - 05
The DNA Extracting and SSR Primer Screening of
Acacia pennata (Leguminosae)
GAO Jie1 , 2 , LI Qiao-Ming1 **
(1 Laboratory of Plant Phylogenetics and Conservation Biology, Xishuangbanna Tropical Botanical Garden,
Chinese Academy of Sciences, Kunming 650223 , China;
2 GraduateUniversity of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049 , China)
Abstract: The total DNA of wild Acacia pennata and cultivated variety were analyzed using SSR markers . We improved
CTAB DNA isolation method and PCR amplified conditions . 12 primerswere screened from82 primers existing in Acacia
genus, which had high polymorphism and stability . The results provided references for genetic diversity research of Acacia
pennata using SSR marker .
Key words: Acacia pennata; DNA extracting; SSR primer screening
羽叶金合欢 ( Acacia pennata ( Linn .) Willd)
又名臭菜 , 隶属于豆科 ( Leguminosae) 金合欢属
( Acacia Miller)。为大型木质藤本 , 分布于云南、
广东、福建、广西及印度东部、中南半岛和非
洲 ; 喜温耐热 , 多分布在海拔 1 900 m以下的低
山丘陵、村寨附近或林地边 ( 中国科学院中国植
物志编辑委员会 , 1988 )。其嫩叶 , 根 , 及树皮
均具有药用价值 ; 茎可用作木材 , 且臭菜营养丰
富 , 具有较高的经济价值 ( 中国科学院国家计划
委员会自然资源综合考察委员会 , 1990 )。由于
人类的过度采伐 , 野生臭菜已濒临灭绝 ( 许又凯
等 , 2004)。我们曾对云南西双版纳地区的野生
臭菜进行考察 , 发现大面积的野生臭菜林已经很
少见到 , 只有少数的零星分布。目前 , 对于臭菜
的研究主要包括民族植物学 , 扦插繁殖 , 人工栽
培 ( 潘奇 , 2004 ) , 营养成分分析等方面 ( 许又
凯等 , 2004 ) , 其遗传多样性方面的研究未见报
导。
云 南 植 物 研 究 2008 , 30 (1) : 64～68
Acta Botanica Yunnanica

?
?? ?通讯作者 : Author for correspondence; E-mail : lqm@xtbg. ac. cn
收稿日期 : 2007 - 04 - 02 , 2007 - 08 - 03 接受发表
作者简介 : 高洁 ( 1982 - ) 女 , 在读硕士研究生 , 主要从事保护遗传学研究。
基金项目 : ?中国科学院方向性项目 (KSCX2-YW-Z-002) , 云南省自然科学基金 ( 2002C0018Q) 及中国科学院知识创新工程青年
人才领域前沿项目
由Moore等 ( 1991 ) 创立的 SSR (simple se-
quence repeats) 简单重复序列即微卫星 DNA , 微
卫星 DNA 是中性的 , 呈共显性的孟德尔式遗传
(Levinson, 1987) , 它具有比其它分子标记 (如等
位酶、RFLP、RAPD等 ) 更多的可检测等位基因
位点 , 能够提供更细致的基因变化分析范围。该
方法在居群遗传学研究中表现出很大的潜力 ( 张
军丽等 , 2000) 。SSR 标记需要特异性的引物 , 而
且不同的引物所要求的反应条件也不同 , 因此对
引物的筛选和反应条件的优化是非常必要的 , 筛
选出多态性高 , 稳定性和可重复性好的引物是整
个实验成功的关键。本实验以羽叶金合欢叶片为
材料 , 研究了其基因组 DNA 的提取和 SSR 引物
筛选 , 为从 DNA 水平揭示羽叶金合欢的遗传多
样性奠定了基础 , 具有重要的科学价值。
1 材料和方法
1 .1 材料
实验所用的羽叶金合欢栽培种采自当地少数民族村
寨混农林系统中的庭园绿篱生态系统 ; 通过询问当地村
民确定栽培种的引种来源 , 即在野生种的分布地对相应
的野生居群进行采样。栽培种和野生种均随机取样 , 每
株取其幼嫩叶片 , 用变色硅胶干燥 , 室温保存。各个居
群的位置及采样个体数详见表 1。
供筛选的引物来自国外对金合欢属其余种马占相思
Acacia mangium ( Buteher等 , 2000 ) , 阿拉伯金合欢 Acacia
nilotica ssp. indica (Wardill 等 , 2004) , 大叶相思 Acacia au-
riculiformis (Ng等 , 2005 ) 和短穗金合欢 Acacia brevispica
Harms subsp. dregeana (Adriana等 , 2005) 研究开发出的 82
对 SSR 引物 , 所有引物均由上海生物工程有限公司合成。
1 .2 方法
1 .2 .1 DNA 的提取 采用常规 CTAB 法提取的羽叶金合
欢 DNA 中含有部分白色杂质。我们经过反复实验 , 对
Zeng等 ( 2002 ) 的方法做了稍许修改 , 先用 BufferⅠ
(200 mmol Tris-HCl, 50 mmol EDTA , 250 mmol NaCl ) 1 .5
ml , 6μlβ-巯基乙醇加入磨成粉状的材料冰浴 10 min, 不
时摇匀→4℃ , 7 000 r?min离心 10 min→再加入提前预热
的 950μl 3×CTAB 裂解→64℃水浴 1 h→用氯仿 - 异戊醇
(24∶1 , v?v) 萃取→1 000 r?min离心 10 min, 取上清 (重
复 2 次 ) →用 700μl 异丙醇沉淀 , - 20℃过夜→然后用
70%乙醇洗 3 次→加入 100μl 1×TE 溶解→4℃保存。增
加了 BufferⅠ 1 .5 ml, 6μlβ-巯基乙醇和材料冰浴的步骤
洗去杂质后所得 DNA 质量明显提高 , 杂质减少。
1 .2 .2 引物筛选 从两个栽培居群和一个野生居群中各
挑选一个质量较好的 DNA 样品 , 共 3 个样品 , 从金合欢
属植物的 82 对 SSR 引物中筛选合适的引物 , 进行扩增。
1 .2 .3 PCR 扩增 PCR 扩增反应在 ABI 9700 上完成 , 所
需的 Mg2 + 、DNA 聚合酶、10×Buffer 均来自 TaKaRa公司
(宝生物工程 (大连 ) 有限公司 ) , 根据实际情况对
Mg
2 + 、DNA 及酶的浓度进行了优化 ; 每次 PCR 做一个负
对照来检测试剂是否污染。
引物 P1 , P9 , P10 , P11 , 采用 25μl 反应体系 : 25
mmol MgCl2 2μl , 50 mmol KCl , 10 mmol Tris-HCl (pH8.3) 5
μl , 10 mmol dNTPs (TaKaRa) 2μl , 10μmol 的引物 1μl , 5
U?μl 的 Taq DNA 聚合酶 0 .2μl, 10 ng?μl 的模板 DNA 2μl
以及 ddH2 O 11.3μl。扩增程序为 : 94℃ 2 min; 94℃ 30 s,
退火 (温度视不同引物而定 , 表 2 ) 30 s, 72℃ 60 s, 30
个循环 ; 72℃ 10 min。
引物 P2 , P4 , P5 , P6 , P12 , P13 , P15 采用 25μl 反应
体系 : 25 mmol MgCl2 3μl , 50 mmol KCl , 10 mmol Tris-HCl
(pH8 .3) 5μl , 10 mmol dNTPs 2μl , 10μmol 的引物 2μl , 5
U?μl 的 Taq DNA 聚合酶 0 .2μl, 10 ng?μl 的模板 DNA 2μl
以及 ddH2 O 8 .8μl。扩增程序为 : 94℃ 2 min; 94℃ 30 s,
退火 (温度视不同引物而定 , 表 2 ) 30 s, 72℃ 20 s, 35
个循环 ; 72℃ 10 min。
引物 P8 , 采用 25μl 反应体系 : 25 mmol MgCl2 2μl,
50 mmol KCl , 10 mmol Tris-HCl ( pH8 .3 ) 5μl , 0. 15 mmol
dNTPs2μl , 10μmol 的引物 1μl , 5 U?μl 的 TaqDNA 聚合酶
0 .2μl , 10 ng?μl 的模板 DNA 2μl 以及 ddH2 O 11 .3μl。扩
增程序为 : 96℃ 20 s, 退火 (温度视不同引物而定 , 表
2) (每个循环降低 0 .5℃ ) 20 s, 72℃ 30 s, 21 个 循 环 ;
表 1 羽叶金合欢居群的采样数目及地点
Table 1 Locations of Acacia pennata populations and the numbers of individuals sampled
居群编号
Population code
分布地
Locality
野生居群
大小 (株 )
Wild population
size
野生居群
采样数 ( 株 )
Wild samples
栽培居群
大小 (株 )
Cultivated
population size
栽培居群
采样数 ( 株 )
Cultivated
samples
经纬度
Latitude and
Longitude
景洪 ( JH ) 景洪市勐罕镇 18 E18 ?27 y20 ?100 .78°E 21 .93°N
勐仑 ( MDJ ) 勐腊县勐仑镇 22 E21 ?34 y20 ?101 .25°E 21 .91°N
勐腊 ( BB) 勐腊县补蚌村 23 E17 ?30 y22 ?101 .63°E 21 .53°N
总计 Total 63 E56 ?91 y62 ?
561 期 高 洁等 : 羽叶金合欢的 DNA 提取和 SSR 引物筛选
96℃ 20 s, 降至最低点的退火温度 20 s, 72℃ 30 s, 15 个
循环 ; 72℃ 10 min。
1 .2 .4 PCR 产物检测 4μl 扩增产物加入 4μl 3×Load-
ing-buffer, 94℃变性 5 min后置于冰上待用。采用凝胶浓
度 6 %的变性聚丙烯酰胺凝胶系统 , 电泳仪为 Bio-Red公
司的 Power Pac-3000 , 缓冲液为 1×TBE。80 W预电泳 1 .5
h, 然后 110 W, 电泳 2 .5 h。
卸胶后 , 用 10%乙醇 , 1%冰乙酸固定 10 min; 去离
子水漂洗 1 min; 1 .5 %硝酸轻摇 3 min取出后去离子水漂
洗 1 min; 用提前预冷的 0 .05 %硝酸银染色 20 min; 去离
子水漂洗 2 次 , 各 30 s; 最后将胶板置于 500 ml 3% 碳酸
钠 , 0 . 5%的 360μl 甲醛中充分摇动 , 直至看见第一条
带 , 再加入 1 500 ml 显色液 , 摇至所有条带都清晰可见
用 50 ml 冰乙酸和 150 ml 去离子水终止显色 ; 去离子水漂
洗两次 , 然后晾干。
2 结果与分析
2 .1 DNA 提取方法的优化
DNA 质量的好坏直接关系到实验的成败。
为了得到高质量的基因组 DNA , 我们对常规
CTAB 法进行改良 , 增加了 BufferⅠ 1 .5 ml , 6μl
β-巯基乙醇和材料冰浴的步骤洗去杂质 , 获得了
较高质量的 DNA (图 1) 。
2 .2 扩增条件的优化
为了得到较为理想的扩增产物及多态性 , 实
验中在反应体系中加入不同浓度的 MgCl2 、dNTP、
模板 DNA , 并以 46～60℃的退火温度处理 , 研
究这些因素对扩增产物的影响。我们发现关键是
要调节模板 DNA 浓度 , 引物浓度 , 以及 PCR 过
程中的 退 火 温 度 高 低 , 该 结 论 与 徐 兴 兴 等
(2006) 对苹果和丁燕红等 (2006) 对小豆的 SSR
反应条件优化所得结论一致。我们得到了上述最
佳的试剂浓度和扩增反应条件。在此条件下 , 每
个引物均能产生较为清晰的条带。
2 .3 SSR 引物的筛选
随着 SSR 标记在不同的分类单位上的应用 ,
为根据不同的分类单位设计引物提供了基础 , 也
可参考相近亲缘种来设计引物 , 一旦微卫星位点
在某一物种中分离并测序 , 它可被用于近缘种的
分析 ( 王丽和赵桂仿 , 2005 )。本研究根据国外
对金合欢属其余种马占相思 , 阿拉伯金合欢 , 大
叶相思和短穗金合欢的 SSR 标记的研究 , 从所
采用的 82 对引物中筛选合适的引物 , 进行扩增。
通过实验发现上述物种的 SSR 引物通用性较低 ,
大多数引物都不能扩增出理想 的产物 , 多态
性很低。我们淘汰了无扩增带和扩增后多态性不
理想的引物 , 选留那些扩增条带清晰而且有明显
多态性片段的引物。最终获得适用于羽叶金合欢
研究的 12 对引物 ( 引物序列及退火温度见表 2 ,
图 2 )。
图 1 羽叶金合欢 MDJ 1～15 号样品两种方法所提总 DNA
( A 为常规 CTAB 法提取的总 DNA, B 为改良的 CTAB 法提取的总 DNA )
Fig . 1 The total DNA was extracted fromfifteen samples of Acacia pennata using two methods
( A : The total DNA was extracted using theusual CTAB method; B: The total DNA was extracted using the improved CTAB method .)
66 云 南 植 物 研 究 30 卷
图 2 12 对 SSR 引物扩增出的多态性谱带
Fig . 2 SSR banding patterns were produced by the
twelve selected primers
3 讨论
SSR 是目前较为理想的遗传标记技术之一 ,
但要获得 SSR 微卫星 DNA 标记一般需要建立、
筛选基因组文库 , 克隆测序 , 引物设计等一系列
实验 , 人力、物力消耗巨大。随着对微卫星研究
技术的深入 , 由于其核苷酸序列的保守性 , 使得
一物种的微卫星引物可能被用于近缘物种 , 从而
有效地减少了设计 SSR 标记的繁琐操作 , 弥补
了其不足。本实验从金合欢属植物的 SSR 引物
中筛选出适合羽叶金合欢使用的 12 对引物 , 它
表 2 筛选出的用于羽叶金合欢扩增的
SSR 引物序列及退火温度
Table 2 Primer sequences, annealing temperatures
were used for Acacia pennata
引物
编号
Primer
number
引物序列 (5 ?′—3′)
Sequence
退火温度
Annealing
tempecture
(℃ )
P1 ?CCTTCTTCTCTCATCTACCAAACC
CCCACATCATCACTCACAACT
48 ?
P2 ?
TTCAGGCCTCTCTCTCTCT
TCGCCTAAATCCTTCCCAA
50 ?
P4 ?
GTCGCGTACACAGACACAGT
GGCGCACCTCTCTCTCTCT
50 ?
P5 ?
GGCGCAACTCTCTCTCTCT
TTGGTCACTTAGCGCATGCC
48 ?
P6 ?
GATAGCTCATAGAAACACCATACC
GGCGAAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
48 ?
P8 ?GCTTTTGGCTCTTGATA
AGGGCAAAATGGTCAT
60 ?
P9 ?GAGGTAATATTTTGAATTCCTTGAAC
GGTGTATACCTCTTTCCTGTGG
48 ?
P10 ?
CCCATTGCCGTTTCTTTG
GCATTTCCCTTGGAACAGTC
46 ?
P11 ?
CGCAACTCCATCTGATTTACTG
TTATGTTGGGTTAATACGCTAACTG
46 ?
P12 ?
GGGGAGGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
GTGACCTGAGTTAGGAAGGAGC
48 ?
P13 ?
GTGAAGGCTCTCTCTCTCT
GGAGATGGATAGAGATGGCC
48 ?
P15 ?GGGGGAGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT
GCTACTAAGGTTTCTTTCACGG
50 ?
们均能扩增出稳定的条带。我们用引物 P1 对部
分居群材料进行了扩增 , 每个样品均能获得清晰
的扩增条带 , 多态位点较多 ( 图 3 )。实验过程
中所选的材料包括了羽叶金合欢的野生和栽培居
群 , 具有一定的代表性 , 本研究初步建立了羽叶
金合欢 SSR 扩增实验体系 , 为进一步进行遗传
多样性研究奠定了基础 ; 目前国内尚未见羽叶金
图 3 引物 P1 对羽叶金合欢勐仑、景洪、勐腊自然居群扩增的结果
Fig . 3 The amplificated products of Menglun, Jinghong, and Mengla natural populations of Acacia pennata using primer P1
761 期 高 洁等 : 羽叶金合欢的 DNA 提取和 SSR 引物筛选
合欢遗传多样性方面的研究 , 对金合欢属植物的
研究也只限于生理生态方面 , 从 DNA 水平揭示
该属植物的遗传资源方面的研究还未见报导。国
外对金合欢属植物的研究包括了对杂交种的鉴
定 , 繁育系统的研究 , 本研究也为该属植物的研
究提供了有效的 SSR 分子标记引物。随着对羽
叶金合欢的进一步开发利用和研究 , SSR 分子标
记将应用于羽叶金合欢的品种鉴定 , 遗传分析 ,
遗传图谱建立 , 分类研究和种质资源鉴定等各个
领域。
致谢 本研究的野外考察与样品采集 , 得到了王洪老师
的大力支持 ; 在实验过程中得到慈秀芹、李朗、汪书
丽、郑丽等同学的积极帮助 ; 论文的绘图工作得到了甘
宏协同学的热心协助。
〔参 考 文 献〕
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