全 文 ：·2900· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月


天山雪莲愈伤组织提取物对人成骨肉瘤细胞MG-63增殖及分化的影响
王 南 1，唐 琴 1，姬芳玲 1，许 青 2*，包永明 1*
1. 大连理工大学生命科学与技术学院，辽宁 大连 116024
2. 沈阳师范大学粮食学院，辽宁 沈阳 110034
摘 要：目的 研究天山雪莲愈伤组织提取物（extract from callus of Saussurea involucrate, ESI）对人成骨肉瘤细胞MG-63
增殖及分化的影响，探讨 ESI 抗骨质疏松的作用及机制。方法 以 MG-63 为研究对象，采用 MTT 法和乳酸脱氢酶(LDH)
法检测 ESI对成骨细胞增殖的影响，相关试剂盒检测碱性磷酸酶（ALP）活性和羟脯氨酸（Hyp）水平，茜素红染色法观察
对矿化骨结节形成的影响；实时荧光定量 PCR（RT-PCR）检测骨保护素（OPG）和核因子-κB活化因子受体配体（RANKL）
基因表达水平；Western blotting法检测 OPG/RANKL蛋白水平；检测 p38特异性抑制剂 SB203580对 ESI作用于成骨细胞增
殖、分化、矿化以及 OPG/RANKL表达的影响。结果 ESI低于 125 μg/mL对成骨细胞无细胞毒性，31.25、62.5 μg/mL对
成骨细胞生长有促进作用；ESI显著提高 ALP活性、Hyp水平以及矿化骨结节形成；显著上调 MG-63细胞 OPG mRNA水
平，下调 RANKL mRNA水平，上调 OPG/RANKL蛋白水平；SB203580显著抑制 ESI对成骨细胞增殖、ALP活性、矿化结
节形成的促进作用以及对胶原蛋白积累量和 OPG/RANKL值的提高作用。结论 ESI能够促进成骨细胞增殖、分化和矿化，
其机制可能与调节 OPG和 RANKL基因表达有关，并且可能通过 p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路进行信号转导。
关键词：天山雪莲；愈伤组织；成骨细胞；I型胶原蛋白；骨保护素；核因子-κB活化因子受体配体；p38丝裂原活化蛋白激酶
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)19 - 2900 - 08
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.19.014
Effect of extract from callus of Saussurea involucrate on proliferation and
differentiation of osteosarcoma cell MG-63
WANG Nan1, TANG Qin1, JI Fang-ling1, XU Qing2, BAO Yong-ming1
1. School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China
2. College of Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China
Abstract: Objective To investigate the effect of extract from callus of Saussurea involucrate (ESI) on the proliferation and
differentiation of osteosarcoma cells MG-63 and explore its anti-osteoporosis and mechanism. Methods Using human osteosarcoma
cells MG-63 for the study, the effect of ESI on the proliferation was detected by MTT and LDH methods; The activity of alkaline
phosphatase activity (ALP) and the level of hydroxyproline (Hyp) were investigated by related reagent kit; The effect of ESI on
mineralized nodules was observed by Alizarin red staining and quantified by CPC, the expression of OPG/RANKL was measured by
RT-PCR and Western blotting, and the proliferation, differentiation, mineralization, and OPG/RANKL expression levels of MG-63
were assayed when medium contains both p38 inhibitor SB203580 and ESI. Results MTT and LDH assay showed that ESI (< 125
μg/mL) was non-toxic to MG-63, and it promoted the proliferation at the concentration of 31.25 and 62.5 μg/mL; ESI could
significantly increase the ALP activity, Hyp content, and amount of mineralized nodules; At the mRNA level, ESI could significantly
up-regulate OPG expression and down-regulate RANKL expression; At the protein level, ESI could significantly increase the ratio of
OPG/RANKL; SB203580 could reverse the acceleration of ESI on the proliferation, differentiation, mineralization, and OPG/RANKL
expression of MG-63. Conclusion ESI has the facilitating effect on the osteoblast proliferation, differentiation, and mineralization;
The mechanism may be associated with the expression of OPG and RANKL, as well as the signal transduction pathway of p38
Mitogen-activated potein kinase (MAPK).
Key words: Saussurea involucrata (Kar. et Kir.) Sch. -Bip.; callus; osteoblast; type I collagen protein; osteoprotegerin; RANKL; p38 MAPK

收稿日期：2015-01-15
作者简介：王 南（1989—），女，硕士，研究方向为药物化学与药理学。Tel: 18941411788 E-mail: dlutwangnan@hotmail.com
*通信作者 包永明（1963—），男，博士，教授，博士生导师，研究方向为蛋白质及酶工程、生物催化与转化、药物化学及药理。
Tel: (0411)84706344 E-mail: biosci@dlut.edu.cn
许 青（1964—），女，教授，主要研究方向为食品质量与安全。E-mail: xuqcqm@126.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月 ·2901·

天山雪莲 Saussurea involucrata (Kar. et Kir.)
Sch. -Bip. 是我国稀有的传统名贵药材，具有补肾
活血、强筋骨、温肾助阳等功效[1]。由于天山雪莲
野生资源十分有限，其人工培育意义重大。李燕[2]
采用植物细胞培养的方法，选取天山雪莲离体组织
通过脱分化形成的愈伤组织作为继代种子，给予一
定条件进行继代培养而获得较大愈伤组织团块，其
化学成分与野生天山雪莲成分相似，有效成分主要
为黄酮类化合物和多糖。但关于天山雪莲愈伤组织
的药理作用研究尚未见报道。
成骨细胞是承担骨重建的一类重要细胞，对维
持正常骨转换具有重要意义[3]。老年骨质疏松症主
要病理机制是成骨细胞的骨形成能力下降，从而导
致骨量低下、骨微结构损害、骨脆性增加，甚至发
生骨折[4-6]。用于骨质疏松研究的模型包括动物模型
和细胞模型，与动物模型比较，细胞模型由于样品
均一、可控性强、重复性好、通量高等特点，广泛
应用于药物筛选、活性评价等诸多研究；目前，用
于骨质疏松研究的主要细胞系有小鼠胚胎成骨细胞
MC3T3-E1、大鼠成骨肉瘤细胞 UMR-106、
ROS17/2.8和人成骨肉瘤细胞 HOS TE85、MG-63、
SaOS-2等，用于考察成骨细胞增殖、分化能力以及
功能表达。
MG-63来源于人成骨肉瘤细胞，不仅具有成骨
细胞的特点，容易培养，而且与人成骨细胞同源性
更高。因而，本实验以MG-63为对象，探讨天山雪
莲愈伤组织提取物（extract from callus of Saussurea
involucrate, ESI）对成骨细胞增殖、发育的影响及
作用机制，在细胞水平上为天山雪莲在抗骨质疏松
的药效学方面提供实验及理论依据，为 ESI的应用
及开发提供参考。
1 材料
1.1 细胞株
人成骨肉瘤细胞MG-63（KG231）购于南京凯
基生物科技发展有限公司。
1.2 试剂
DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（FBS），
美国 Gibco-BRL 生命技术有限公司；噻唑蓝
（MTT），美国 Invitrogen有限公司；西吡氯铵（CPC）、
茜素红-S（ARS）、二甲基亚砜（DMSO），美国
Sigma-Aldrich 公司；碱性磷酸酶（ALP）、乳酸脱
氢酶（LDH）、4-羟脯氨酸（Hyp）试剂盒，南京建
成生物技术有限公司；抗坏血酸、β-甘油磷酸钠，
北京索莱宝科技有限公司；Trizol 试剂、琼脂糖，
美国 Invitrogen 有限公司；Reverse Transcriptase
M-MLV（RNase H），2641Q，宝生物工程（大连）
有限公司；各种引物合成、实时荧光定量 PCR
（RT-PCR）中使用的酶，华大基因；p38 特异性抑
制剂 SB203580，碧云天生物技术研究所。
1.3 药物
ESI 由大连普瑞康生物技术有限公司提供。提
取方法：雪莲培养物干燥粉末中加入 30%乙醇溶液，
固液比为 1∶15，超声提取，温度为 85 ℃，每次提
取 60 min，连续提取 2次，合并 2次所得液体，60
℃减压浓缩获得实验样品。以芦丁作为对照品，分
光光度计法检测 500 nm 波长下吸光度值，计算总
黄酮质量浓度，结果 ESI中含总黄酮为 6.1%，ESI
使用时用培养基稀释。
1.4 仪器
SX-500 高压蒸气灭菌锅，日本 TOMY 公司；
垂直层流洁净工作台，上海净化设备有限公司；
MAXI dry lyo真空冷冻干燥机，丹麦 Heto公司；
Hera cell 150二氧化碳培养箱，美国 Thermo公司；
IX71 荧光显微镜，日本 Olympus 公司；Biofuge
Stratos 冷冻离心机，美国 Thermo 公司；Varioskan
Flash全波长扫描荧光酶标仪，美国 Thermo公司；
TakaraTP-600PCR 仪，宝生物工程（大连）有限公
司；全自动凝胶成像系统，Syngene公司；PVDF膜，
美国Millipore公司。
2 方法
2.1 细胞培养
MG-63细胞用含 10% FBS的 DMEM培养基，
在 5% CO2、37 ℃细胞培养箱培养。待细胞完全融
合时，加入磷酸缓冲液（PBS）清洗 1～2 遍，用
0.25%胰酶消化，细胞开始出现皱缩，细胞间隙明
显即可倒掉胰酶，加入培养基吹打。以 1∶3传代比
继续在 25 cm2培养瓶中培养。3～4 d传代 1次，传
代 1～2次后即可用于后续实验。
2.2 MTT法测定细胞增殖
取对数生长期、生长状态良好的MG-63细胞，
以每孔 5 000个接种于 96孔板中。培养 24 h后，给
药组加入 ESI（总黄酮质量浓度分别为 15.625、
31.25、62.5、125、250、500 μg/mL），对照组加入
等体积的培养基。药物作用 48 h后弃去培养基，加
入 100 μL MTT 溶液（0.5 mg/mL）37 ℃孵育 4 h。
小心吸弃上清液，每孔加入 150 μL DMSO 溶解紫色
·2902· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月

结晶甲瓒，混匀。使用酶标仪检测 570 nm 波长处
的吸光度（A）值，以 630 nm波长下 A值作为参照。
2.3 LDH活性测定
MG-63细胞以每孔 5 000个接种于 96孔板，24
h后给药组加入 ESI（总黄酮质量浓度分别为 31.25、
62.5、125 μg/mL），对照组加入等体积的培养基。继
续培养 48 h，取上清液，测定 LDH释放量，检测步
骤严格按照 LDH试剂盒说明书操作。
2.4 ALP活性测定
MG-63细胞以每孔 4×105个接种于 6 cm培养
板，待细胞融合度达到 80%时加入 ESI（分组及给
药情况同“2.3”项）。培养 48 h后收集细胞，PBS
洗 2 遍，加入细胞裂解液涡旋破碎细胞，14 000
r/min、4 ℃离心 15 min，取上清液，即为总蛋白，
置于冰上，严格按照 ALP 试剂盒说明书操作测定
ALP活性，检测波长为 520 nm。
2.5 I型胶原蛋白水平测定
细胞处理及分组给药同“2.4”项。培养 3 d后
收集细胞。每个处理组加入 1 mL 6 mol/L HCl，110
℃水解 2.5 h后，真空冷冻干燥。用蒸馏水重新溶解
细胞水解产物，按照 Hyp 检测试剂盒说明书测定
Hyp 水平。以此来反映成骨细胞中 I 型胶原蛋白的
水平。
2.6 ARS染色鉴定骨矿化
MG-63细胞以每孔 2×105个接种于 6孔板，待
细胞融合度达到 80%时，矿化组和给药组均加入含
50 μmol/L 抗坏血酸和 10 mmol/L β-甘油磷酸钠的
DMEM培养基继续培养，给药操作同“2.3”项，对
照组加入等体积的培养基。每 2 天换液，每天观察
细胞状态。18 d 后倒置显微镜观察可看到细胞融合
成片，并且有较多不透明的灶点，即为矿化结节。
用 PBS洗 2遍，95%乙醇固定细胞 10 min，蒸馏水
浸洗。洗净后，加入ARS-tris-HCl（40 mmol/L，pH
4.2），37 ℃染色 30～60 min。加入蒸馏水清洗 2～3
遍，将未结合的染料洗掉后室温下干燥，倒置显微
镜下观察照相。用 10% CPC溶液溶解结合的 ARS，
测定其在 550 nm下 A值，以定量钙沉积情况[7-9]。
2.7 RT-PCR 检测骨保护素（OPG）和核因子-κB
活化因子受体配体（RANKL）mRNA表达
将MG-63细胞以每孔 4×105个接种于 6 cm培
养板，24 h后加入相应浓度 ESI（分组及给药情况
同“2.3”项）。48 h 后消化收集细胞。使用 Trizol
法提取总 RNA，使用 Reverse Transcriptase M-MLV
（RNase H）将 RNA逆转录合成 cDNA。PCR扩增
引 物 序 列 及 反 应 条 件 ： OPG 上 游 引 物 为
5’-GCTAACCTCACCTTCGAG-3’， 下游 引物 为
5’-TGATTGGACCTGGTTACC-3’；RANKL上游引
物为 5’-GCCAGTGGGAGATGTTAG-3’，下游引物
为 5’-TTAGCTGCAAGTTTTCCC-3’；GAPDH上游
引物为 5’-TACATTTTGCTGATGACTGG-3’，下游
引物为 5’-TGAATGGTAGGAGCTTGACT-3’。PCR
扩增反应条件：94 ℃预变性 5 min后进入循环；94
℃变性 30 s，55 ℃复性 30 s，72 ℃延伸 1 min，循
环 35次；最后 72 ℃延伸 10 min。扩增产物经 1%
琼脂糖凝胶电泳，DNA条带的单位面积灰度用凝胶
成像仪测定，使用 Image J软件分析电泳条带灰度，
目的基因mRNA水平以与参照基因GAPDH的灰度
比值表示。
2.8 Western blotting检测OPG和RANKL蛋白表达
将 MG-63 细胞以每孔 8×105个接种于 10 cm
培养板，融合达 80%，给药组加入 ESI（总黄酮质
量浓度为 31.25、62.5 μg/mL），对照组加入等体积
的培养基。48 h后胰酶消化收集细胞，加入细胞裂
解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，提取液中
加入 5×SDS上样缓冲液，煮沸变性 5 min，制备变
性聚丙烯凝胶，浓缩胶 5%，分离胶 12%，上样，每
孔含 80～100 μg 蛋白。转膜，将膜浸泡在 5%脱脂
牛奶中，37 ℃封闭 2 h；加一抗溶液，4 ℃孵育过
夜，第 2天 37 ℃室温热孵 1 h，用 TBST液洗 3次，
每次 10 min；加入对应的荧光二抗，室温孵育 40
min，用 TBST 液避光洗 3 次，每次 15 min，压片
10 min，显影 5 min，定影 5 min。Image J软件分析
图片中条带灰度值。实验重复 3次。
2.9 SB203580对 ESI作用的影响
分别按照“2.2”“2.4”～“2.8”项方法接种培养
细胞，培养 24 h后弃培养基，对照组加入新鲜培养基，
SB203580 组和 ESI＋SB203580 组加入 10 μmol/L
SB203580，作用 2 h后，ESI加药组和ESI＋SB203580
组均加入ESI（总黄酮质量浓度 62.5 μg/mL）继续培养。
分别按照“2.2”“2.4”～“2.8”项方法检测各项指标。
2.10 数据处理及统计分析
所得数据以 ±x s表示，采用 SPSS 17.0统计软
件One-way ANOVA方差分析，组间比较采用 t检验。
3 结果
3.1 MG-63细胞增殖和 LDH活性
如图 1 所示，ESI 总黄酮质量浓度低于 125
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月 ·2903·

μg/mL 对MG-63细胞没有细胞毒性，在 31.25、62.5
μg/mL 能够显著促进MG-63细胞增殖（P＜0.01）。
LDH活性测定结果表明，31.25、62.5 μg/mL 的 ESI
能够显著降低MG-63细胞 LDH活性（P＜0.01），分
别为对照组的（90.40±3.30）%和（68.42±3.57）%，
保护了细胞膜的完整性。而 125 μg/mL 的 ESI显著
升高 LDH 活性，表明高质量浓度 ESI对 MG-63细
胞膜具有破坏作用（P＜0.01）。
3.2 MG-63细胞ALP、I型胶原蛋白水平和钙沉积变化
ALP作为成骨细胞分化的标志酶，其活性可以
反映成骨细胞的活性和状态。31.25、62.5 μg/mL 的
ESI作用于MG-63细胞 48 h后，ALP活性分别为对
照组的（141.05±8.28）%和（164.02±11.67）%，
均显著高于对照组（P＜0.01）。结果见图 2。
I 型胶原蛋白和钙的沉积均是影响骨基质矿化
的重要因素。Hyp在胶原蛋白中占 13.4%，而在弹
性蛋白中质量分数极少，其他蛋白中均不存在。因
此采用 Hyp 水平来反映胶原蛋白的水平。药物作
用 MG-63 细胞 72 h 后，Hyp 分别为对照组的
（121.04±1.20）%和（131.53±0.77）%，表明 ESI
处理MG-63细胞后，I型胶原蛋白水平均显著高于
对照组（P＜0.01）。结果见图 2。





与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 1 ESI对MG-63细胞增殖和 LDH活性的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 1 Effect of ESI on proliferation and LDH activity of MG-63 cells ( x±s, n = 3)

对照 矿化 ESI 31.25 mg·kg−1 ESI 62.5 mg·kg−1 ESI 125 mg·kg−1




与对照组比较：**P＜0.01；与矿化组比较：##P＜0.01
**P < 0.01 vs control group；##P < 0.01 vs mineralization group
图 2 ESI对MG-63细胞分化和矿化的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 2 Effect of ESI on differentiation and mineralization of MG-63 cells ( x±s, n = 3)
对照 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1)

LD
H
活
性
%

120
100
80
60
40
20
0


**
**

**

对照 15.625 31.25 62.5 125 250 500
ESI/(μg·mL−1)

细
胞
存
活
率
%

*

**

**

**
**

120
100
80
60
40
20
0


200
160
120
80
40
0


140
120
100
80
60
40
20
0


5
4
3
2
1
0


对照 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1)

对照 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1)

对照 矿化 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1)

A
LP
活
性
%

H
yp
水
平
%

A
值

**

**

**

**

**

**

##

##

##

100 μm 100 μm 100 μm 100 μm 100 μm
·2904· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月

加入抗坏血酸和 β-甘油磷酸钠的矿化培养基培
养细胞 18 d后，倒置相差显微镜观察，矿化组与 ESI
组（31.25、62.5、125 μg/mL）均形成较多不透明的
结节。ARS 染色后不透明结节呈红色圆形或不规则
形状，中心颜色较深。与矿化组比较，ESI组形成的
矿化结节更多，ARS 染色后红色更鲜亮，表明 ESI
组增加了钙化区域。加入 10% CPC洗脱 ARS染色
液后，酶标仪检测 A值结果显示，31.25、62.5 μg/mL
的 ESI 处理组 A 值明显高于矿化组（P＜0.01），表
明其形成更多的 ARS和钙的复合物，形成更多钙的
沉积，促进矿化基质的形成。结果见图 2。
如图 2所示，125 μg/mL浓度的ESI处理MG-63
细胞也形成矿化结节，但由于 ESI对MG-63细胞的
毒性作用，抑制了 ALP活性、胶原蛋白形成和钙沉
积（P＜0.01）。
3.3 MG-63细胞 OPG和 RANKL mRNA的表达
差异
RT-PCR结果见图 3，31.25、62.5、125 μg/mL
ESI上调MG-63细胞OPG mRNA的表达（P＜0.05、
0.01），并且均显著下调了 RANKL mRNA的表达
（P＜0.01）。表明 ESI促进 MG-63细胞分化和矿化
的机制之一是调控 OPG和 RANKL基因表达。
3.4 MG-63细胞 OPG与 RANKL蛋白比值变化
如图 4 所示，与对照组相比，31.25、62.5
μg/mL 的 ESI能够显著提高 OPG与 RANKL的比
值（P＜0.01），其中 62.5 μg/mL ESI对 OPG/RANKL
值的影响较大，进一步证明 ESI对MG-63细胞分化
的促进作用与 OPG和 RANKL基因的表达有关。



与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 3 ESI对MG-63细胞 OPG和 RANKL mRNA表达的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 3 Effect of ESI on expression of OPG and RANKL mRNA in MG-63 cells ( x±s, n = 3)



与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group
图 4 ESI对MG-63细胞OPG和RANKL蛋白表达的影响
( x±s, n = 3)
Fig. 4 Effect of ESI on expression of OPG and RANKL
protein in MG-63 cells ( x±s, n = 3)
3.5 MG-63细胞的 p38 MAPK信号通路调控作用
经过 p38 特异性抑制剂 SB203580 干预处理，
如图 5所示，MG-63细胞增殖、分化和矿化均无明
显变化，与对照组比较差异不显著（P＞0.05）。与
对照组相比，加入 ESI（62.5 μg/mL）明显增强了
MG-63细胞增殖、ALP活性、Hyp水平以及矿化沉
积程度（P＜0.01）；与 ESI组比较，ESI＋SB203580
组明显抑制了 ESI 对 MG-63 细胞的增殖分化的诱
导作用，降低了 ALP 活性和 Hyp 水平，并阻滞了
矿化结节的形成（P＜0.01）。
与 ESI单独处理组相比较，在 mRNA水平上，
SB203580 与 ESI 共同作用，下调了 OPG mRNA
的表达（P＜0.01），上调了 RANKL mRNA的表达
（P＜0.05）；在蛋白水平上，共同处理组抑制 OPG
蛋白的高表达，促进了 RANKL 的表达，从而显著
降低了OPG/RANKL值（P＜0.01），结果见图 6。
综上，细胞增殖、ALP 活性、I 型胶原蛋白水
平、矿化水平以及 OPG、RANKL基因表达多个方
面表明 p38 特异性抑制剂 SB203580 能够抑制 ESI
对成骨细胞 MG-63 分化的促进作用，说明 ESI 对
MG-63细胞的影响与 p38 MAPK通路有关。
OPG
RANKL
GAPDH
1.6
1.2
0.8
0.4
0
对照 31.25 62.5 125 对照 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1) ESI/(μg·mL−1)


m
RN
A
相
对
表
达
量

对照 31.25 62.5
ESI/(μg·mL−1)

24
20
16
12
8
4
0


O
PG
/R
A
N
PL


对照 31.25 62.5 125
ESI/(μg·mL−1)

对照 31.25 62.5
ESI/(μg·mL−1)

OPG
RANKL
GAPDH
*

**

**

**

**

**

**
**

OPG
RANKL

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月 ·2905·







对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与 ESI组比较：△△P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; △△P < 0.01 vs ESI group
图 5 ESI和 SB203580对MG-63细胞增殖、分化和矿化的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 5 Effect of ESI and SB203580 on proliferation, differentiation, and mineralization of MG-63 cells ( x±s, n = 3)




与对照组比较：**P＜0.01；与 ESI组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01
**P < 0.01 vs control group；△P < 0.05 △△P < 0.01 vs ESI group
图 6 ESI和 SB203580对MG-63细胞 OPG和 RANKL mRNA及蛋白表达的影响 ( x±s, n = 3)
Fig. 6 Effect of ESI and SB203580 on mRNA and protein expression of OPG and RANKL in MG-63 cells ( x±s, n = 3)
120
100
80
60
40
20
0


140
120
100
80
60
40
20
0


对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
细
胞
存
活
率
%

180
160
140
120
100
80
60
40
20
0

对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
A
LP
活
性
%

5
4
3
2
1
0


H
yp
水
平
%

A
值

对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580 对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
OPG
RANKL
GAPDH
OPG
RANKL
GAPDH
对照 ESI SB203580 ESI+SB203580

对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
对照 ESI SB ESI+ SB 对照 ESI SB ESI+ SB
203580 203580 203580 203580

对照 ESI SB203580 ESI+ SB203580
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0


m
RN
A
相
对
表
达
量

O
PG
/R
A
N
PL


30
25
20
15
10
5
0


**

**
**

**
**△△


*△△


**

**

**

△△


△
△△
OPG
RANKL

△△


△△


100 μm 100 μm 100 μm 100 μm
·2906· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月

4 讨论
世界卫生组织将骨健康系列问题疾病列为继心
脑血管疾病、癌症、糖尿病“三大杀手”外对人体
危害最广泛的问题。健康的骨骼通过持续的骨重塑
来维持，而这一动态平衡由介导骨吸收的破骨细胞
和介导骨形成的成骨细胞调节[10-11]。但是由于绝经
后雌激素缺乏、年龄增长或者疾病、药物等原因，
导致骨形成和骨吸收之间的动态平衡被打破。除了
适当的药物治疗之外，早期的骨骼强壮的维护和钙
质的积累才是预防骨骼病变的更有效措施。
成骨细胞通过自身增殖、分化，诱导和调节细
胞外基质矿化，并控制骨重建过程。在骨形成过程
中，成骨细胞经历了成骨细胞增殖、细胞外基质成
熟、细胞外基质矿化和成骨细胞凋亡 4个阶段。MTT
和 LDH 活性检测结果表明 ESI 在低于 125 μg/mL
时对体外成骨样细胞没有毒性，且在 31.25 μg/mL
和 62.50 μg/mL 时具有显著促进细胞增殖的保护作
用。成骨细胞增殖晚期，开始出现分化，ALP是成
骨细胞分化的早期指标[12]，ALP能够水解有机磷酸
酯，使局部 PO43−浓度升高，启动钙化[10]。实验发
现 ESI可显著提高成骨细胞 ALP活性。
在骨形成阶段，成熟的成骨细胞合成和分泌 I
型胶原蛋白和各种非胶原蛋白，如骨钙素（OCN）、
骨桥蛋白（OPN）和骨唾液酸蛋白（BSP）。实验结
果表明，ESI能够提高MG-63细胞的Hyp水平，即
提高 I型胶原蛋白的水平，胶原蛋白水平的提高，能
够使骨骼具有韧性和弹性，吸收外界能量；同时它
所形成的空间三维网状结构是矿化的前提[13]；ARS
染色实验结果也证明，ESI 能够促进矿化结节的形
成，即促进钙的积累；这一结果表明 ESI 可增加骨
强度，帮助提高骨峰值，降低发生骨折的可能性。
此外，成骨细胞还分泌OPG、RANKL等细胞因
子，将破骨细胞的骨吸收偶联起来，调节破骨细胞的
分化和活性，在骨吸收过程中也起关键性作用[14-17]。
ESI通过上调 OPG的表达，降低 RANKL的表达来
影响MG-63细胞的分化和矿化。
成骨细胞的生长和分化由受体酪氨酸激酶介
导，许多细胞外信号调节该激酶，其中大多数是激
活 Ras丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）级联反应[18]。
p38 MAPK是MAPK信号转导途径的通道之一，p38
MAPK 是由各种环境刺激和因子引起的细胞反应
所激活，它能调节成骨细胞中 OPG 和/或 RANKL
的表达[19]。本实验用特异性阻断剂 SB203580 阻断
p38MAPK 信号转导通路，发现对 ESI 介导的成骨
样细胞的增殖分化的促进作用以及对 OPG/RANKL
表达的上调作用均有明显抑制，表明 ESI促进成骨
样细胞增殖、分化，促进骨形成可通过 p38 MAPK
通路介导。由于阻断 p38 MAPK通路并不能完全抑
制 ESI 促进成骨样细胞的分化作用，因此，ESI 可
能依赖 ERK、c-Jun N端激酶 JNK等通路影响成骨
细胞，将有待于进一步研究。
综上所述，ESI 在细胞水平上能够促进人成骨
样细胞MG-63增殖分化以及骨基质的形成，表现出
抗骨质疏松作用，但是在细胞水平上，还可通过成
骨细胞和破骨细胞共培养模型，或三维培养模型进
一步评价。将 ESI作用于去势大鼠，发现其能够增
加去势大鼠骨钙浓度，显著增加骨密度[20]，但是，
抗骨质疏松的功效评价仍需要整体水平的动物模型
实验，包括原发性、继发性及基因重组骨质疏松动
模型等，进一步探究其抗骨质疏松的临床意义。
参考文献
[1] 中国药典 [S]. 一部. 2010.
[2] 李 燕. 天山雪莲全草及其细胞培养物化学成分的研
究 [D]. 北京: 中国协和医科大学, 2006.
[3] Lo Y C, Chang Y H, Wei B L, et al. Betulinic acid
stimulates the differentiation and mineralization of
osteoblastic MC3T3-E1 cells: involvement of
BMP/Runx2 and β-catenin signals [J]. Agric Food Chem,
2010, 58(11): 6643-6649.
[4] Jiang S D, Yang Y H, Chen J W, et al. Isolated osteoblasts
from spinal cord-injured rats respond less to mechanical
loading as compared with those from hindlimb-
immobilized rats [J]. Spinal Cord Med, 2013, 36(3):
220-224.
[5] Niu Y B, Li Y H, Kong X H, et al. The beneficial effect of
Radix dipsaci total saponins on bone metabolism in vitro
and in vivo and the possible mechanisms of action [J].
Osteoporos Int, 2012, 23(11): 2649-2660.
[6] Lewiecki E M. New targets for intervention in the
treatment of postmenopausal osteoporosis [J]. Nat Rev
Rheumatol, 2011, 7(11): 631-638.
[7] 樊 秦, 赵文君, 李应东. 华中五味子含药血清对成骨
细胞增殖分化的影响 [J]. 中国实验方剂学杂志, 2009,
15(2): 33-35.
[8] Miyamoto S, Miyamoto Y, Shibata Y, et al. In situ
quasi-static and dynamic nanoindentation tests on
calcified nodules formed by osteoblasts: Implication of
glucocorticoids responsible for osteoblast calcification
[J]. Acta Biomaterialia, 2015, 12(15): 216-226.
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 19期 2015年 10月 ·2907·

[9] Cho Y E, Alcantara E H, Kuinaran S, et al. Red yeast rice
stimulates osteoblast proliferation and increases alkaline
phosphatase activity in MC3T3-E1 cells [J]. Nutr Res,
2010, 30(7): 501-510.
[10] Harada S, Rodan G A. Control of osteoblast function and
regulation of bone mass [J]. Nature, 2003, 423(6937):
349-355.
[11] Li B, Ling Chau J F, Wang X, et al. Bisphosphonates,
specific inhibitors of osteoclast function and a class of
drugs for osteoporosis therapy [J]. Cell Biochem, 2011,
112(5): 1229-1242.
[12] Lee H S, Jung E Y, Bae S H, et al. Stimulation of
osteoblastic differentiation and mineralization in
MC3T3-E1 cells by yeast hydrolysate [J]. Phytother Res,
2011, 25(5): 716-723.
[13] Saito M, Marumo K, Kida Y, et al. Changes in the contents
of enzymatic immature, mature, and non-enzymatic
senescent cross-links of collagen after once-weekly
treatment with human parathyroid hormone (1-34) for 18
months contribute to improvement of bone strength in
ovariectomized monkeys [J]. Osteoporos Int, 2011, 22(8):
2373-2383.
[14] Li F, Yang Y, Zhu P, et al. Echinacoside promotes bone
regeneration by increasing OPG/RANKL ratio in
MC3T3-E1 cells [J]. Fitoterapia, 2012, 83(8): 1443-1450.
[15] 仲蕾蕾, 杨 冰, 黄晓斌, 等. OPG/RANKL/RANK 系
统在成骨细胞和破骨细胞相互调节中的作用 [J]. 中国
骨质疏松杂志, 2011, 17(11): 1010-1013.
[16] Kearns A E, Khosla S, Kostenuik P J. Receptor activator
of nuclear factor kappaB ligand and osteoprotegerin
regulation of bone remodeling in health and disease [J].
Endocr Rev, 2008, 29(2): 155-192.
[17] Silvestrini G, Ballanti P, Sebastiani M, et al. OPG and
RANKL mRNA and protein expressions in the primary
and secondary metaphyseal trabecular bone of
PTH-treated rats are independent of that of SOST [J]. J
Mol Hist, 2008, 39(2): 237-242.
[18] 王 慧, 李玉坤. 成骨细胞分化调控因子研究进展 [J].
国际骨科学杂志, 2011, 32(6): 377-379.
[19] Luo X H, Guo L J, Xie H, et al. Adiponectin stimulates
RANKL and inhibits OPG expression in human
osteoblasts through the MAPK signaling pathway [J]. J
Bone Min Res, 2006, 21(10): 1648-1656.
[20] 王怡薇, 刘雅萍, 张 献, 等. 雪莲细胞培养物对卵巢
切除大鼠骨密度的影响 [J]. 国际中医中药杂志, 2014,
36(9): 824-826.