全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 4 期 2015 年 2 月

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• 药剂与工艺 •
去唾液酸糖蛋白受体配体胆固醇-半乳糖苷的酶促合成优化研究
陈 静，程 怡*，郑品劲，聂 华，陈宇潮，仝一丹，罗利华，李 朝
广州中医药大学中药学院，广东 广州 510006
摘 要：目的 在有机相中利用酶促反应合成能被去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）特异性识别的配体胆固醇-半乳糖苷分子，
对其合成工艺进行优化。方法 采用质谱和核磁碳谱鉴别产物结构；单因素和正交设计法优化酶促合成条件。结果 酶促最
佳条件为底物胆固醇癸二酸乙烯酯（CH-VS）与乳糖醇（LA）物质的量之比 4∶1，脂肪酶 Novozym 435 25 mg，反应 32 h，
产率高达 92%。结论 该方法高效、反应条件可行、产物专一。
关键词：去唾液酸糖蛋白受体（ASGPR）配体；胆固醇-半乳糖苷；酶促合成；单因素试验；正交试验设计
中图分类号：R283.6 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)04 - 0502 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.04.008
Optimization of enzymatic synthesis of asialoglycoprotein receptor ligand
cholesterol-vinyl sebacate-lactitol
CHEN Jing, CHENG Yi, ZHENG Pin-jin, NIE Hua, CHEN Yu-chao, TONG Yi-dan, LUO Li-hua, LI Zhao
College of Chinese Materia Medica, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China
Abstract: Objective To synthesize asialoglycoprotein receptor (ASGPR) ligand cholesterol-vinyl sebacate-lactitol (CH-VS-LA) by
using enzymatic reaction in organic phase and to optimize its synthesis process. Methods MS and 13C-NMR were used to identify the
structure of product, enzymatic synthesis conditions were optimized via single-factor test and orthogonal experimental design. Results
The enzymatic optimum conditions were as following: the molar ratio of cholesterol-vinyl sebacate (CH-VS) and lactitol (LA) was
4∶1, the amount of lipase Novozym 435 was 25 mg, reactional time was 32 h, and productive rate was 92%. Conclusion The
method is highly effecient, the reaction conditions are reasonable, and the process produces no by-product.
Key words: asialoglycoprotein receptor ligand; cholesterol-vinyl sebacate-lactitol; enzymatic synthesis; single-factor test; orthogonal
test design

去 唾 液 酸 糖 蛋 白 受 体 （ asialoglycoprotein
receptor，ASGPR）是半乳糖/N-乙酰半乳糖胺受体[1]，
其表达在肝脏实质细胞 [2]。相关研究表明 [3-5]，
ASGPR 能与末端为半乳糖基或 N-乙酰半乳糖胺基
的糖蛋白结合，被肝实质细胞摄取，为制备新型的
肝靶向性药物提供新方法。根据 ASGPR 特性，以
胆固醇癸二酸乙烯酯（cholesterol-vinyl sebacate，
CH-VS）和乳糖醇（lactitol，LA）为底物酶促合成
ASGPR 配体胆固醇-半乳糖苷（CH-VS-LA）。反应
机制为癸二酸二乙烯酯（vinyl sebacate，VS）两侧
的酯键断裂，分别与胆固醇（cholesterol，CH）上
的羟基、LA 中开链多元醇中的伯羟基酯化结合。
CH 是细胞膜的重要成分[6]，使得含 CH 的配体易透
过细胞膜；LA 分子包含的半乳糖基团能与 ASGPR
特异性结合发挥靶向作用。Connolly 等[7]研究发现，
半乳糖苷的疏水基团可增加半乳糖苷与 ASGPR 的
亲和力，从而增加了配体与 ASGPR 的结合性。
Markus 等[8]也类似地阐述“疏水性的桥梁”重要的

收稿日期：2014-08-16
基金项目：教育部高等学校博士学科点专项科研基金（20134425110010）
作者简介：陈 静（1989—），女，广东人，在读硕士研究生，研究方向为药物载体及新型给药系统。
Tel: 13699738965 E-mail: gzschenjing@163.com
*通信作者 程 怡，女，教授，博士生导师，主要从事药物载体及新型给药系统。Tel: (020)39358041 E-mail: vip.chengyi@gzhtcm.edu.cn
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连接作用。故 CH-VS 结构中的 VS 作为连接 LA 和
CH 的“桥梁”，为今后肝靶向性脂质体修饰物的研
究提供新颖的思路。
配体分子合成一般采用化学法和生物酶法合
成，但化学法通常在高温及酸或碱条件下进行，生
成的产物没有区域选择性，副产物多；生物酶法具
有反应条件温和、高区域选择性及无毒、环保等优
势[9-10]。本实验着重探讨了配体分子 CH-VS-LA 酶
促合成的最优条件，最终达到了高效、反应条件可
行、产物专一的目的。
1 仪器和材料
TSQ Quantum Access MAX 三重四级杆液质联
用仪，赛默飞世尔科技有限公司；Bruker 400M 核
磁共振波谱仪，瑞士布鲁克公司；Dionex 高效液相
色谱仪，美国戴安公司；THZ-D 台式恒温振荡器，
太仓市实验设备厂；XW-80A 微型漩涡混合仪，上
海沪西分析仪器厂；MS，赛默飞世尔科技有限公司，
ESI 源 (+) 模式，喷雾电压 3 kV，毛细管温度 350
℃；13C-NMR，Avance III 400 MHz，溶剂为氘代吡
啶，分辨率 126 MHz，Switzerland。
CH-VS-LA，实验室自制，质量分数 92%，批号
20140529；CH-VS，实验室自制[11]，批号 20140315；
乳糖醇（拉克替醇散，乳糖醇质量分数＞98%，批
号 20131218），江苏正大天晴药业股份有限公司；
脂肪酶 Lipozyme TLIM（TLIM）、Novozym 435 固
定化脂肪酶（N435），诺维信生物技术有限公司；
Candida rugosa lipase CRL（CRL），Sigma 公司；4Å
型分子筛，批号 20121216，阿拉丁公司。甲醇，色
谱纯，批号 20140213；水为重蒸馏水，吡啶（批号
20140311）、丙酮、正己烷等试剂均为分析纯，均已
用分子筛脱水处理。
2 方法与结果
2.1 CH-VS-LA 酶促反应
精密称取 LA 13.5 mg、一定物质的量比的
CH-VS，加入混合溶剂吡啶-丙酮（2∶1）适量，置
于 10 mL 锥形瓶，超声溶解后，再加 4Å 型分子筛
100 mg，添加酶 N435 25 mg，气浴摇床（55 ℃，
220 r/min, 32 h），抽滤、溶剂洗涤，滤渣弃去，回
收溶剂，得粗产物。
2.2 粗产物纯化
加混合溶剂环己烷-甲醇（10∶1）适量，溶解
后加入硅胶粉 2 g，减压回收溶剂，得干燥硅胶粉，
过硅胶柱（d＝1.5 cm，h＝21 cm），甲醇洗脱，HPLC
监测，100%甲醇作流动相，监测到目标产物（保留
时间 6～7 min），含目标产物接样液减压回收溶剂，
得白色蜡状物（CHS-VS-LA），称定质量，并计算
其产率。
产率＝m 实际/m 理论
式中，m 实际表示实际产量，m 理论表示理论产量
2.3 单因素考察
2.3.1 反应溶剂 反应溶剂会影响底物的溶解性而
影响产率，底物 CH-VS 在吡啶中溶解度较差，但
底物 LA 通过试验得知在吡啶中溶解度较好。为了
两底物都有较好的溶解度，采用双混合溶剂方法，
包括吡啶-丙酮、吡啶-四氢呋喃、吡啶-二甲基甲酰
胺、吡啶-二甲基亚砜、吡啶-叔戊醇、吡啶-乙二醇
二甲醚（溶剂之间的比例均为 2∶1）、吡啶，进行
考察，其他因素溶剂比例、脂肪酶种类（N435）、
酶量（25 mg）、底物LA与CH-VS物质的量之比（1∶
4）、反应温度（55 ℃）、时间（32 h）不变，计算
产率，结果产率分别为 71.60%、60.30%、9.98%、
9.98%、24.94%、14.64%、15.83%。结果显示，在
有机介质的酶促合成中，溶剂的性质对底物的溶解
性有显著联系，影响到产率。在以上混合溶剂中，
吡啶-丙酮的混合溶剂产率最高。
2.3.2 混合溶剂比例 根据“2.3.1”的结果，选择
吡啶-丙酮混合溶剂，考察混合溶剂不同比例 3∶1、
2∶1、1∶1、1∶2，其他因素脂肪酶种类（N435）、
酶量（25 mg）、底物LA与CH-VS物质的量之比（1∶
4）、反应温度（55 ℃）、时间（32 h）不变，计算
产率，结果产率分别为 43.94%、71.60%、56.20%、
18.80%。吡啶-丙酮混合溶剂的比例不同，其极性大
小也不同。脂肪酶能达到最大的催化作用，需要合
适的极性溶剂。吡啶-丙酮物质的量之比为 2∶1 时，
N435 达最大催化效应，产率最高。
2.3.3 脂肪酶种类 参考相关文献报道[12-15]可知脂
肪酶常用作高效的生物催化剂，其中催化糖酯合成
的脂肪酶常见有 TLIM、N435 和 CRL，对此 3 种进
行考察，其他因素反应溶剂（吡啶-丙酮）及其比例
（2∶1）、酶量（25 mg）、底物 LA 与 CH-VS 物质的
量之比（1∶4）、反应温度（55 ℃）、时间（32 h）
不变，计算产率，结果产率分别为 12.51%、83.25%、
10.20%。结果显示，表明脂肪酶 N435 催化反应的
产率最高，证实了脂肪酶的专一性。
2.3.4 底物LA与CH-VS物质的量之比 确定混合
溶剂（吡啶-丙酮）及其比例（2∶1）、脂肪酶种类
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（N435）、酶量（25 mg）、反应温度（55 ℃）、时间
（32 h）不变，以不同的 LA 与 CH-VS 物质的量之
比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6）进行
反应，计算产率，结果产率分别为 56.22%、73.33%、
89.03%、91.22%、87.27%、83.09%。可以看出，当
底物物质的量之比在 1∶1～1∶4，底物 CH-VS 量
与产率呈正相关，直至反应极限，当底物物质的量
之比达 1∶5 和 1∶6 时，产率降低。证实在此反应
中，CH-VS 作为酰基供体，根据化学反应平衡移动
原理，酰基供体的数量增多，使反应更加容易向减
弱这种趋势的方向移动，即酯合成方向。
2.3.5 酶量 确定混合溶剂（吡啶-丙酮）及其比例
（2∶1）、脂肪酶种类（N435）、底物 LA 与 CH-VS
物质的量之比（1∶4）、反应温度（55 ℃）、时间（32
h）不变，反应中添加不同质量（5、15、25、35、
45 mg）的 N435 进行反应，计算的产率，结果产率
分别为 45.02%、80.17%、86.05%、83.03%、77.28%。
结果显示，N435 在 5～25 mg 时，反应产率与酶量
呈正比，25 mg 时达到最大催化效果；在 N435 量＞
25 mg 时，反应产率与酶量成反比。
2.3.6 反应温度的考察 确定混合溶剂（吡啶-丙
酮）及其比例（2∶1）、脂肪酶种类（N435）、底物
LA 与 CH-VS 物质的量之比（1∶4）、酶量（25 mg）、
反应时间（32 h）不变，恒温振荡器设置不同的温
度（40、45、50、55、60 ℃）进行反应，计算产率，
结果产率分别为 54.70%、62.97%、71.22%、79.53%、
39.89%。温度在 40～55 ℃，最佳反应温度是 55 ℃。
温度有利于酶提供底物分子反应所需要的能量，增
加分子间的碰撞机率，加快反应速度，提高转化率；
超出适当的温度范围，酶内部蛋白质空间结构发生
改变，使酶失活，反应的效率降低。而且混合溶剂
里含有丙酮，丙酮的沸点约为 57 ℃，60 ℃使溶剂
挥发，产率快速下降。故最佳温度选择 55 ℃。
2.3.7 反应时间的考察 控制混合溶剂（吡啶-丙
酮）及其比例（2∶1）、脂肪酶种类（N435）、底物
LA 与 CH-VS 物质的量之比（1∶4）、酶量（25 mg）、
温度条件（55 ℃）不变，设定不同的反应时间（8、
16、24、32、40 h），计算产率，结果产率分别为
41.97%、52.38%、85.32%、86.49%、70.65%。结果
显示，8～24 h 反应时间与产率成正比；24～32 h
的产率约 86%，基本不再增长，揭示反应达到平衡。
再反应到 40 h，HPLC 检测发现产率下降，出现水
解峰，原因可能是部分产物被水解。
2.4 正交试验设计
2.4.1 试验设计 通过单因素考察，分别考察脂肪
酶 N435 量（A，mg）、反应时间（B，h）、底物 LA
与 CH-VS 物质的量之比（C）3 因素 3 水平，采用
L9(34) 正交表进行试验。正交试验设计及结果表见
表 1，方差分析结果见表 2。
由表 2 可知，A、B、C 3 个因素的影响都有统
计学意义（P＜0.05、0.01），由表 1 分析得知，极
差（R）的大小显示各因素的影响程度，影响程度
大小依次为 A＞C＞B，即脂肪酶 N435 量＞底物物
质的量之比＞反应时间，最优组合为 A2B3C2，即脂
肪酶量为 25 mg，反应时间为 32 h，底物 LA 与
CH-VS 物质的量之比为 1∶4。

表 1 L9(34) 正交试验设计与结果
Table 1 Design and results of L9 (34) orthogonal test
试验号 A/mg B/h C D (空白) 产率/%
1 20 (1) 16 (1) 1∶3 (1) 1(1) 46.35
2 20 (1) 24 (2) 1∶4 (2) 2(2) 69.42
3 20 (1) 32 (3) 1∶5 (3) 3(3) 66.18
4 25 (2) 16 (1) 1∶4 (2) 3(3) 81.13
5 25 (2) 24 (2) 1∶5 (3) 1(1) 84.75
6 25 (2) 32 (3) 1∶3 (1) 2(2) 78.75
7 30 (3) 16 (1) 1∶5 (3) 2(2) 68.52
8 30 (3) 24 (2) 1∶3 (1) 3(3) 64.79
9 30 (3) 32 (3) 1∶4 (2) 1(1) 85.27
K1 60.65 65.33 63.30 72.12
K2 81.54 72.99 78.60 72.23
K3 72.86 76.73 73.15 70.70
R 20.89 11.40 15.31 1.53
表 2 方差分析
Table 2 Variance analysis
因素 偏差平方和 自由度 F 值 显著性
A 661.02 2 150.99 P＜0.01
B 202.57 2 46.27 P＜0.05
C 361.26 2 82.52 P＜0.05
D（误差） 4.38 2
F0.05(2, 2)＝19.00 F0.01(2, 2)＝99.00

2.4.2 优化工艺验证试验 以最优组合 A2B3C2 重
复试验 3 批次（批号 20140623、 20140715、
20140730），结果产率分别为 90.86%、91.18%、
91.22%，平均产率可达（91.08±0.22）%，说明该
优化工艺合理。
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2.5 定量测定方法学的建立
2.5.1 HPLC 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（250
mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-正己烷（94∶
6），等度洗脱；进样量 10 μL；柱温 35 ℃；体积流
量 1.0 mL/min。
2.5.2 对照品溶液的制备 精密称定 CH-VS-LA
0.1 g，置于 10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，
配得质量浓度为 10 mg/mL 对照品储备液。
2.5.3 空白对照溶液的制备 按照“2.1”项制备操
作不加 LA 与 CH-VA 反应液，反应 32 h，取 1 mL
反应液于 5 mL 量瓶中，用甲醇稀释至刻度，过 0.22
μm 微孔滤膜，取滤液即得。
2.5.4 供试品溶液的制备 按照“2.1”项制备酶促
反应液，反应 32 h，取 1 mL 反应液于 5 mL 量瓶，
用甲醇稀释到刻度，过 0.22 μm 微孔滤膜，取滤液
即得。
2.5.5 CH-VS-LA 标准曲线制备 精密量取对照品
CH-VS-LA 适量，置于容量瓶中，加入流动相定容
至 5 mL，依次稀释至 6.80、5.10、4.08、3.40、2.72、
1.70 mg/mL，精密量取 10 μL 注入液相色谱仪，按
“2.5.1”项色谱条件测定，记录峰面积，以质量浓度
（X）对峰面积积分值（Y）进行线性回归，得线性
回归方程为 Y＝8.117 2 X－2.715 1，r＝0.999 5；结
果表明，CH-VS-LA 在质量浓度 1.70～6.80 mg/mL
呈良好的线性关系。
2.5.6 专属性考察 取对照品溶液、空白对照溶液
和供试品溶液依次进样，记录色谱图，见图 1。结
果显示，LA 没有紫外吸收（结构中不含不饱和键），
底物 CHS-VS 的保留时间为 16～17 min，CHS-
VS-LA 的保留时间为 6～7 min，底物 LA 和 CH- VS
不影响 CH-VS-LA 的测定，分离度良好，专属性强。
2.5.7 精密度试验 取 3.4 mg/mL 的对照品溶液，




图 1 CHS-VS-LA 对照品 (A)、空白对照 (B) 和供试品 (C) 的 HPLC 色谱图
Fig. 1 HPLC of CHS-VS-LA reference substance (A), blank control (B), and sample (C)

重复进样 5 次，记录峰面积，CH-VS-LA 的峰面积
RSD 为 2.3%，实验结果表明本方法的精密度良好。
2.5.8 稳定性试验 取 3.4 mg/mL 供试品溶液，分
别于 0、1、2、4、8、12 h 进样，记录峰面积，得
RSD 为 2.7%，说明样品在 12 h 内能保持稳定。
2.5.9 加样回收率试验 取 3.4 mg/mL 的反应液 9
份，置于 10 mL 量瓶中，分为 3 组，每组各 3 份。
每组分别精密加入“2.5.2”项方法制备的对照品储
备液适量，使其质量浓度分别为供试品质量浓度的
80%、100%及 120%，用甲醇稀释至刻度，摇匀。
按照“2.5.1”色谱条件进样，记录峰面积，外标法
计算高、中、低质量浓度的回收率，结果平均回收
率为 100.4%，RSD 为 1.3%。
2.6 产物结构分析
2.6.1 MS 谱 MS 谱图显示 [M＋Na]+ 峰 919.5，
故产物相对分子质量为 896.5，与目标产物相对分子
质量 896 相吻合。
2.6.2 碳谱 13C-NMR (126 MHz, pyridine-d5) δ:
173.45 (C-28), 172.80 (C-37), 139.81 (C-6), 122.55
(C-9), 106.23 (C-44), 84.68 (C-40), 76.80 (C-48),
74.96 (C-2), 73.61 (C-46), 72.74 (C-42), 72.67 (C-45),
71.46 (C-39), 70.15 (C-41), 69.62 (C-47), 66.50
(C-38), 63.63 (C-43), 61.59 (C-49), 56.55 (C-14),
56.13 (C-15), 50.02 (C-7), 42.25 (C-4), 39.70 (C-13),
39.49 (C-12), 38.36 (C-22), 37.01 (C-3), 36.58 (C-5),
36.25 (C-20), 35.78 (C-18), 34.50 (C-29), 34.12
(C-36), 31.90 (C-10), 31.80 (C-8), 29.08 (C-31, 34),
29.03 (C-32, 33), 28.25 (C-1), 27.98 (C-16), 27.95
(C-23), 25.10 (C-30), 24.93 (C-35), 24.24 (C-17),
23.90 (C-21), 22.68 (C-25), 22.44 (C-24), 21.03
(C-11), 19.13 (C-27), 18.71 (C-19), 11.75 (C-26)。δ
173.45、172.80 是 VS 的 C-28/37；δ 139.81、122.55
是CH环内C＝C所对应的峰，δ 74.96是CH的C-2，
与 AIST 数据库 δ 71.81 相比，向低场移动了 3×
10−6，符合酯化反应规律；δ 66.50 属于 LA 末端的
C-38，与 AIST 数据库 δ 63.74 相比，向低场移动了
CH-VS-LA
CH-VS-LA
A B C
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
t/min
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约 3×10−6，符合酯化反应规律。综上所述，合成产
物为目标分子。
3 讨论
本实验选用 CH-VS 和 LA 作为底物，N435 催
化合成 CH-VS-LA。合成工艺证实了酶法合成条件
简单（脂肪酶直接催化 LA 与 CH-VS 的反应）、反
应条件温和，而且底物组分少（LA 与 CH-VS），产
率高、副产物少，简化了分离纯化的步骤。LA 选
用的是药品拉克替醇散（LA 98%），拉克替醇散不
仅提供了半乳糖配体被 ASGPR 特异识别，实现肝
靶向作用，同时具有治疗肝性脑病疗效，为今后以
含半乳糖的肝靶向药物作为前药提供设计方案。
CH-VS 为半乳糖和脂质体提供足够空间距离，提高
被 ASGPR 识别能力。乙烯基作为酰基供体与羟基
发生酯交换，副产物乙烯醇转化成乙醛而挥发，促
进反应向正方向进行。因此，酶法合成肝靶向性脂
质体配体 CH-VS-LA 设计思路是有效可行的。
同时作了单因素和正交设计法优化肝靶向性脂
质体配体 CH-VS-LA 合成工艺考察，先考察影响酶
促反应的各单因素，包括脂肪酶种类、反应溶剂、
混合溶剂比例、底物物质的量之比、酶量、反应温
度、反应时间。再根据单因素考察的结果，确定正
交设计法的因素与水平。正交设计法针对脂肪酶
N435 量、反应时间以及底物 LA 与 CH-VS 物质的
量之比 3 因素 3 水平，运用 L9(34) 正交表得出正交
试验的结果，分析出 CH-VS-LA 合成工艺优化是合
理可行的。同时进行了方法学考察，其线性、专属
性、精密度、加样回收率良好，适用于检测 CH-VS-
LA 的量。因此，酶催化 LA 与 CH-VS 合成肝靶向
性脂质体配体 CH-VS-LA，奠定了制备新型肝靶向
性药物的基础，为今后脂质体的修饰物的研究提供
科学依据。
参考文献
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