全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 45 卷 第 5 期 2014 年 3 月

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• 药材与资源 •
多胺介导真菌诱导子促进白桦三萜积累的初步研究
刘英甜，王晓东，周文洋，詹亚光，范桂枝*
东北林业大学生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150040
摘 要：目的 明确内源多胺是否介导真菌诱导子诱导白桦三萜的合成。方法 将 40 μg/mL 真菌诱导子、1 mmol/L 腐胺（Put）
和 2 mmol/L 多胺合成抑制剂 D-精氨酸（D-Arg）添加到培养 8 d 的白桦悬浮培养体系中，利用 HPLC 法和比色法分析多胺
量和三萜量。采用药理学和恢复实验分析多胺在真菌诱导子诱导白桦三萜合成中的作用。结果 真菌诱导子或 Put 处理后，
白桦悬浮细胞中的多胺量、三萜量和产量均呈增加趋势，其中处理 24 h 时，三萜量达最大值，分别增加了 68.54%和 30.34%。
真菌诱导子和 Put 共同处理虽提高了三萜量，但其产量却低于真菌诱导子单独处理。真菌诱导子和 D-Arg 共同处理后三萜量
低于真菌诱导子单独处理，处理 24 h 时降低程度最高，为 40.57%。恢复实验发现，随着恢复时间的延长，真菌诱导子、Put
以及真菌诱导子与 D-Arg 对白桦三萜合成的影响逐渐减弱，恢复到对照水平。结论 多胺介导了真菌诱导子促进白桦悬浮
细胞中三萜的合成。
关键词：白桦；多胺；真菌诱导子；三萜；腐胺；D-精氨酸
中图分类号：R282.21 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2014)05 - 0695 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.05.019
Polyamine-mediated triterpenoid synthesis in suspension cells of Betula
platyphylla induced by fungal elicitor
LIU Ying-tian, WANG Xiao-dong, ZHOU Wen-yang, ZHAN Ya-guang, FAN Gui-zhi
College of Life Sciences, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China
Abstract: Objective To clarify whether polyamine-mediated triterpenoid synthesis in birch (Betula platyphylla) suspension cells induced
by fungal elicitor. Methods Fungal elicitor (40 μg/mL), putrescine (Put, 1 mmol/L), and D-arginine (D-Arg, 2 mmol/L) were added to the
eight-day-old suspension cell culture, the content changes of triterpenoid and free polyamines were analyzed by chemical colorimetry and
HPLC. The effect of polyamine on triterpenoid synthesis in B. platyphylla suspension cells induced by fungal elicitor was analyzed by
pharmacology and restoration experiment. Results After the treatment of fungal elicitor or Put, the contents and yields of free polyamines
and triterpenoid were increased. Among of them, the triterpenoid content was the highest after 24 h treatment, the increasing rates were
68.54% and 30.34%, respectively. The triterpenoid content was increased by the cotreatment of fungal elicitor and Put, but the increasing
degree of yield was lower than that by the treatment of fungal elicitor alone. Compared with the fungal elicitor alone, the cotreatment of
fungal elicitor and D-Arg decreased the triterpenoid content by 40.57% in the highest degree of decreasing after 24 h treatment. In
restoration experiment, with the treatment time prolonging, the effect of fungal elicitor, Put, or cotreatment of fungal elicitor and D-Arg on
triterpenoid synthesis was decreasing to the control level finally. Conclusion Polyamine could mediate the triterpenoid synthesis in cells of
B. platyphylla induced by fungal elicitor.
Key words: Betula platyphylla Suk.; polyamine; fungal elicitor; triterpenoid; putrescine; D-arginine

以细胞全能性为基础建立起来的植物细胞培养
技术为植物有用物质的生产提供了一条新途径，由
于利用细胞培养法生产植物天然活性物质具有不依
赖和消耗自然植物资源的特点，被视为是从根本上

收稿日期：2013-11-13
基金项目：中央高效基本科研业务专项资金项目（DL13EA08-03）；国家自然科学基金资助项目（31100445，31070531）；黑龙江省博士后科
研启动金（415288）
作者简介：刘英甜，硕士研究生，现从事植物细胞工程领域的研究。E-mail: 864857011@qq.com
*通信作者 范桂枝 Tel: (0451)82191752 E-mail: gzf325@126.com
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解决植物天然活性物质生产可持续发展问题的一种
新型生物技术。如产紫杉醇的红豆杉细胞生产已发
展到中试和工业化规模[1]。但是植物细胞中次生代
谢产物的低产现象也是制约其产业化应用的核心问
题之一[2-3]。
在应用植物细胞培养生产药用植物次生代谢物
的研究中，利用真菌诱导子处理植物培养细胞以促
使细胞快速、大量合成有用次生物质已成为常用的
提高植物组织培养中的次生代谢产物量的有效手段
之一[4]。在植物细胞培养中，真菌诱导子能诱导生
物碱、酚类、萜类、皂苷、黄酮类化合物、香豆素、
迷迭香酸等多种次生代谢产物[1]，如真菌诱导子
使亚麻细胞中足叶草毒素量增加了 7 倍[5]；黑曲
霉真菌诱导子使红豆杉中的紫杉醇产量比对照提
高了 7 倍[6]。然而植物次生代谢调控是一个十分复
杂的信号转导系统，近年来真菌诱导子诱导次生代
谢产物合成的信号机制研究虽然有一定的进展，但
是目前离完全了解植物次生代谢信号转导机制还有
很大距离。
多胺是一种广泛存在于自然界中具有生物活性
的小分子化合物，常见的游离态多胺主要包括腐胺
（putrescine, Put）、精胺（spermine, Spm）、亚精胺
（spermidine, Spd）[7]。多胺对植物有着广泛的生理
作用，特别是在植物抵抗生物/非生物胁迫过程中刺
激植物发生防御反应。近期的研究发现多胺具有调
控植物次生代谢产物合成的作用，如多胺能促进甜
菜的毛状根中甜菜红碱的合成[8]；Margarita 等[9]研
究发现，在钙缺乏的条件下多胺能调控水飞蓟细胞
培养物中水飞蓟素的产生。
前期的研究表明，白桦酯醇和齐墩果酸等三萜
物质可以在白桦 Betula platyphylla Suk. 愈伤组织
中积累[10-12]，并且从多种白桦内生真菌中筛选到了
有效提高三萜积累的真菌诱导子，并优化了其诱导
条件[13]。同时，研究还发现，外源多胺促进了白
桦悬浮细胞中三萜的合成，其中腐胺的诱导效果最
好[14]。内源多胺是否介导真菌诱导白桦三萜的合成
还未见报道。因此，本研究将分析真菌诱导的内源
多胺对白桦三萜积累的调控作用，该研究对阐明真
菌诱导子诱发植物次生代谢产物合成的信号转导机
制具有重要意义。
1 材料与仪器
白桦 Betula platyphylla Suk. 母树取自东北林
业大学白桦强化种子园 5～7 年生嫁接优树（接穗
30 年生），由詹亚光教授鉴定，外植体取自其诱导
的组培苗。
HY—6A 双层振荡器，三萜量采用 UV—2800
紫外分光光度计比色测定，多胺量采用 Waters 公司
的高效液相色谱仪分析。D-精氨酸（D-Arg）、Put、
Spm 和 Spd、齐墩果酸均来自于 Sigma 试剂公司。
2 方法
2.1 白桦愈伤悬浮细胞的培养
将白桦愈伤组织接种于 B5 液体培养基中，附
加 0.1 mg/L 6-BA＋0.01 mg/L TDZ，蔗糖浓度为 20
g/L，pH 5.5～6.0。250 mL 摇瓶中盛有 90 mL 培养
液，每瓶接种鲜质量 4 g 的愈伤组织，每隔 15 d 继
代 1 次，培养温度为 25～27 ℃，光照强度为 2 000
lx，光照 16 h/d，摇床转速为 120 r/min。
2.2 真菌诱导子的制备与添加
将本实验室分离的白桦内生真菌 Phomopsis sp.
在 PDA 液体培养基中发酵培养 10 d，121 ℃高压
灭菌 20 min 后作为诱导子加入白桦悬浮培养液中，
诱导子浓度以糖浓度表示，以葡萄糖为标准，用蒽
酮比色法测定。
将 40 μg/mL 真菌诱导子添加培养 8 d 的白桦悬
浮培养体系中，处理后 48 h 后更换到新鲜培养液中
继续培养 48 h，取样测定白桦悬浮细胞的活力、干
质量、多胺量和白桦三萜产量。对照加入等体积无
菌水，每处理重复 3 次。
2.3 D-Arg 的添加
多胺抑制剂 D-Arg 的添加终浓度为 2 mmol/L。
添加的D-Arg溶液经0.45 μm微孔滤膜滤过除菌后，
添加到培养 8 d 的白桦悬浮培养体系中，添加 D-Arg
20 min 后再添加真菌诱导子，对照（CK）加入等体
积无菌水，每处理重复 3 次。
2.4 细胞活力的测定
取白桦悬浮细胞鲜样 0.20 g，加入 2.5 mL 现配
的 0.4%氯化三苯四氮唑（TTC），再加入 2.5 mL PBS
缓冲液（pH 7.0），常温下暗处理 14 h。去除上清溶
液，用 5 mL 蒸馏水清洗细胞，待细胞沉淀静止后，
吸去上清再次洗涤细胞，共重复 3 次。用 5 mL 95%
乙醇脱色处理，于 60 ℃水浴 30 min，每隔 5 min
轻晃倒置试管摇匀。待细胞沉淀后用紫外分光光度
计测定上清溶液的吸光度（A）值，即代表细胞活
力，A 值大则细胞活力强[15]。
2.5 三萜量的测定
三萜的提取采用超声波醇提法，利用紫外分光光
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度计法测定其量[16-17]。将白桦悬浮细胞烘干至恒质量
后，研磨成粉末状，每样品称量 0.05 g，加入 2 mL 95%
乙醇浸提过夜，重复提取 3 次，将提取液混合。于 70
℃水浴 1 h，超声（10 kHz）提取 40 min，静置沉淀
后滤过，取上清溶液 70 ℃水浴蒸干，加入 200 μL 5%
香草醛-冰醋酸混合液（现用现配）和 800 μL 高氯酸，
继续 70 ℃水浴反应 15 min，反应结束后迅速冷却，
醋酸乙酯定容到 5 mL，混合均匀。空白对照加入同
样试剂。以紫外分光光度计 551 nm 测定 A 值。
采用齐墩果酸对照品制作标准曲线，以 A 值为
纵坐标（Y），齐墩果酸质量浓度为横坐标（X），得
回归方程为 Y＝0.022 2 X＋0.000 9，在 0～0.030
mg/mL 内具有良好的线性关系，r 为 0.995 6。
2.6 多胺量的测定
多胺的量采用 HPLC 法测定[18]，取待测样品 2 g
（鲜质量），利用 4 mL 现配制预冷的 5%高氯酸，在冰
上研磨至黏稠状。置于冰上浸提 1 h，以 15 000×g，
30 min，4 ℃离心。吸取上清溶液 500 μL，添加 7 μL
苯甲酰氯和 1 mL 2 mol/L NaOH，涡旋振荡 20～30
s。放置于 37 ℃水浴保持 20 min，水浴后加入 2 mL
饱和 NaCl 溶液，加入 2 mL 无水乙醚进行萃取，以
1 500×g 离心 5 min。吸取 1 mL 上层醚相将其真空
干燥。用 1 mL 64%色谱甲醇溶解，膜（0.45 μm）
滤过，取 20 μL 进样。
色谱条件：色谱柱 HiQ sil C18 （250 mm×4.6
mm ，5 μm）；流动相甲醇-水（64∶36）；检测波长
230 nm，体积流量 0.8 mL/min，柱温 30 ℃，进样
体积 20 μL。
以 Put、Spd、Spm 各峰面积为纵坐标（Y），
各对照品浓度为横坐标（X）制作标准曲线，回归
方程为 Put：Y＝2 651 020 X＋7 155.5；Spd：Y＝
2 928 494 X＋6 773；Spm：Y＝2 696 128 X－11 351.5，
r 分别为 0.999 9、0.999 9、0.999 8，在 0.025～0.45
nmol/μL 线性关系良好。
3 结果与分析
3.1 真菌诱导子与 Put 对白桦悬浮细胞活力的影响
将 40 μg/L 真菌诱导子、1 mmol/L Put、真菌
诱导子与 Put、真菌诱导子与多胺合成抑制剂
D-Arg 分别添加到培养 8 d 的白桦悬浮培养体系
中，处理 48 h 后将细胞转移至新鲜培养液中恢复
处理 48 h，TTC 法分析白桦悬浮细胞活力。由图 1
可知， Put 处理使白桦悬浮细胞活力提高了
0.31%～12.71%，其中 Put 处理 24 h 达到最大值

图 1 处理 (A) 和恢复处理 (B) 下白桦悬浮细胞活力的变化
Fig. 1 Changes of cell viability in birch (B) suspension cells
under treatment (A) and restoration treatment
0.97；真菌诱导子处理后白桦悬浮细胞活力下降了
7.09%～22.34%，恢复处理后细胞活力有增加趋
势，但未达到对照水平；在真菌诱导子处理的白桦
细胞中添加 Put 后，细胞活力比真菌诱导子处理单
独处理呈上升趋势，但未恢复到对照水平；在真诱
导子处理的白桦细胞中添加 D-Arg 后，细胞活力
下降了 25.71%～42.21%，恢复处理后细胞活力有
增加趋势，但未达到对照水平。由上述结果可知，
真菌诱导子抑制了细胞的生长，恢复处理或添加
Put 均能使细胞活力增加。
3.2 真菌诱导子与Put 对白桦悬浮细胞干质量的影响
由图 2 可知，Put 处理使细胞的干质量提高了
2.15%～13.95%，在恢复处理后 Put 对细胞干质量积
累的促进效应逐渐减弱，到恢复 24 h 时已接近对照
水平；真菌诱导子处理后细胞干质量降低了
4.43%～25.67%，恢复处理后细胞干质量呈增加趋
势，但未达到对照水平；在真菌诱导子处理的培养
体系中添加 Put，在处理 24 h 后细胞干质量呈上升
趋势，但未恢复到对照水平；在真菌诱导子处理的
白桦细胞中添加 D-Arg，细胞干质量降低了
14.03%～24.69%，恢复处理后细胞干质量呈增加趋
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t / h
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
A
值

CK Put 真菌诱导子
真菌诱导子+ Put 真菌诱导子+ D-Arg
t / h
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
A
值

6 12 24 48
A
B
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图 2 处理 (A) 和恢复处理 (B) 白桦悬浮细胞干质量的变化
Fig. 2 Changes of dry weight in birch suspension cells
under treatment (A) and restoration treatment (B)
势，但未达到对照水平。由上述结果可知，真菌诱
导子抑制了细胞的生长，恢复处理或添加 Put 均能
使细胞干质量增加，该结果与细胞活力一致。
3.3 真菌诱导子与 Put 对白桦悬浮细胞中多胺量
的影响
由表 1 可知，Put 处理后白桦悬浮细胞中 Put
量在 6～24 h内迅速上升，比对照增加了 37～63 倍，
而 Spd 量增幅较小，最大值为 48 h 时的 4.8 倍。真
菌诱导子处理后，细胞中 Put 和 Spd 的量均有不同
程度地增加，Put 在真菌诱导后 12 h 达最高值，比
对照增加了 293%；Spd 在诱导后 12 h 达最大值，
比对照增加了 12.70%，但随处理时间延长多胺
量开始下降。Put 与真菌诱导子共同作用下，Put
的量相比单独 Put 处理低 25.7%（6 h）～4.49%
（12 h），但从 24 h 开始，细胞中 Put 量显著上升，
在 48 h 时比对照增加了 57.59%。细胞中 Spd 量
的变化趋势同 Put，表明在真菌诱导子诱导下，多
胺量在 24～48 h 有明显上升趋势。在真菌诱导的
白桦悬浮体系中添加 D-Arg 后，白桦细胞中 Put
和 Spd 量均比单独真菌诱导子处理降低。
表 1 白桦悬浮细胞多胺量的变化 ( 3=± n , sx )
Table 1 Changes of polyamines content in birch suspension cells ( 3=± n , sx )
处理 恢复处理 处理时
间 / h 处理方式 Put / (nmol·g−1) Spd / (nmol·g−1) Put / (nmol·g−1) Spd / (nmol·g−1)
CK 0.74±0.05 11.89±1.21 0.36±0.00 4.79±0.00
Put 28.02±1.95 9.04±1.05 27.75±0.76 5.44±0.64
真菌诱导子 1.11±0.08 13.40±0.00 0.21±0.01 4.06±0.33
真菌诱导子＋Put 20.82±1.90 6.88±0.31 30.97±1.98 7.66±0.92
6
真菌诱导子＋D-Arg 0.16±0.01 5.12±0.67 0.45±0.04 6.23±0.31
CK 0.87±0.08 13.69±0.50 1.17±0.01 3.57±0.04
Put 44.95±1.76 8.13±0.60 20.96±1.82 5.24±0.48
真菌诱导子 3.42±0.14 14.31±1.79 0.72±0.05 2.86±0.45
真菌诱导子＋Put 42.93±1.17 11.81±0.20 13.09±1.82 4.89±0.64
12
真菌诱导子＋D-Arg 1.07±0.04 5.39±0.40 2.70±0.08 7.24±0.52
CK 1.23±0.08 12.31±0.24 2.25±0.06 19.14±1.27
Put 77.65±1.94 10.31±0.99 6.33±0.73 8.16±0.64
真菌诱导子 2.45±0.06 6.60±0.33 1.39±0.03 8.68±0.63
真菌诱导子＋Put 69.98±1.32 6.43±0.40 18.68±1.11 14.40±0.78
24
真菌诱导子＋D-Arg 0.99±0.02 6.04±0.31 0.93±0.03 9.95±0.20
CK 1.46±0.03 10.08±0.35 2.86±0.06 6.89±0.89
Put 44.05±1.01 48.30±0.18 6.73±0.65 18.69±0.92
真菌诱导子 1.01±0.02 5.68±0.23 1.56±0.02 11.92±0.87
真菌诱导子＋Put 69.42±1.60 9.30±0.05 16.08±1.00 8.84±0.22
48
真菌诱导子＋D-Arg 1.15±0.03 4.55±0.03 0.46±0.02 8.66±0.32

8
6
4
2
0
细
胞
干
质
量
/
g

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10
8
6
4
2
0
细
胞
干
质
量
/
g

6 12 24 48
t / h
CK Put 真菌诱导子

真菌诱导子+ Put 真菌诱导子+ D-Arg
A
B
t / h
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Put 处理的细胞恢复培养后，Put 和 Spd 的量有
所下降，但仍然高于对照水平。真菌诱导子处理的
细胞在恢复后细胞内多胺量逐渐降低到对照水平。
真菌诱导子与 D-Arg 处理的细胞经恢复培养后，多
胺量呈先增加后降低趋势。
3.4 真菌诱导子与 Put 对白桦悬浮细胞中三萜产
量的影响
由图 3 可知，Put 处理后三萜量和产量呈增加
趋势，在 24 h 时增幅最大，三萜量和产量分别比对
照提高了 30.34%和 48.52%，在恢复处理后 Put 对白
桦三萜积累的促进效应逐渐减弱，到 48 h 时已接近
对照水平；真菌诱导子处理后三萜量和产量也呈增
加趋势，在 24 h 增幅最大，三萜量和产量分别比对
照提高了 68.54%和 41.31%，在恢复处理 12 h 后这
种促进效应明显降低，到 48 h 时已接近对照水平；
真菌诱导子与 Put 同时处理下，三萜产量的增幅与单
独真菌诱导处理相近，未进一步增加，而三萜产量
却低于单独真菌诱导或 Put 处理。在恢复处理后这种
促进效应降低，随着恢复时间的延长逐渐接近对照
水平；在真菌诱导与 D-Arg 同时处理下，三萜量和
产量的积累量明显降低，三萜量降低了 11.36%～
40.57%，在恢复处理后这种抑制效应被逐渐缓解。
从上述结果可知，真菌诱导子与 Put 处理均促进了三
萜的合成，而在真菌诱导子的白桦悬浮体系中添加
多胺合成抑制剂抑制 D-Arg 后，这种促进效应被部
分抑制了。

图 3 白桦悬浮细胞中三萜量和产量的变化
Fig. 3 Changes of triterpenoid content and yield in birch suspension cells
4 讨论
多胺量的增加和次生代谢产物合成积累是植
物在病原微生物侵染等逆境胁迫下常见的 2 种主
动防御反应。Qin 等[19]的研究发现，真菌诱导子
可以引起植物细胞中多胺量的增加。而将多胺添
加到培养的植物细胞中可以使黄酮、萜类等次生
代谢产物量增加[20-23]。同样，本研究也发现真菌
诱导子提高了白桦悬浮细胞中多胺量和三萜产
量。由此可知，真菌诱导子促进了多胺量和次生
代谢产物的增加。那么，多胺是否介导真菌诱导
次生代谢物的合成，尤其是是否介导真菌诱导白
桦三萜的积累还未见报道。
在前期的研究中，本课题组发现外源多胺促进
了白桦三萜的合成，且 Put 促进效果最佳。将真菌
60
50
40
30
20
10
0
40
30
20
10
0
三
萜
量
/
(m
g·
L−
1 )

三
萜
量
/
(m
g·
L−
1 )

260
220
180
140
100
60
20
三
萜
产
量
/
(m
g·
L−
1 )

240
200
160
120
80
40
0
三
萜
产
量
/
(m
g·
L−
1 )

处理
6 12 24 48 6 12 24 48
6 12 24 48 6 12 24 48
t / h t / h
恢复处理
恢复处理 处理

CK Put 真菌诱导子
真菌诱导子+Put 真菌诱导子+ D-Arg
t / h t / h
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诱导子添加到白桦悬浮体系中发现，真菌诱导子促
进了多胺量的增加，其中 Put 量的增加量大于 Spd
量，而另外一种多胺即 Spm，在本实验中未检测到，
可能是量较低的原因。因此，本研究中外源多胺的
添加种类为 Put。
本研究通过药理学实验发现，在真菌诱导子与
多胺合成抑制剂 D-Arg 同时处理下，白桦悬浮细胞
中的多胺量和三萜产量比真菌诱导子或 Put 单独处
理下显著降低，但仍高于对照。进一步通过恢复实
验发现，真菌诱导子和外源 Put 对白桦三萜的促进
效应，随着恢复培养时间的延长而降低，最终恢复
到对照水平；而真菌诱导子与多胺合成抑制剂
D-Arg 同时处理下，白桦悬浮细胞中降低的多胺量
和三萜产量成呈上升趋势，随着恢复时间的延长逐
渐达到对照水平。由此初步推测，多胺介导了真菌
诱导白桦三萜的合成过程。
综上所述，真菌诱导的内源多胺介导了真菌诱
导子诱导白桦三萜合成的过程，但是具体通过哪些
信号之间的转导，通过哪些下游途径调控白桦三萜
的合成仍需要进一步的研究和探讨。
参考文献
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杉醇 [J]. 药物生物技术, 2004, 11(6): 401-405.
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