全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 10 期 2015 年 5 月

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• 药材与资源 •
黄芩查耳酮异构酶基因的克隆和生物信息学分析
郭双双，程 林，杨利民*，刘翠晶，韩 梅
吉林农业大学中药材学院，吉林 长春 130118
摘 要：目的 从黄芩愈伤组织中克隆查耳酮异构酶（CHI）基因，并对其进行生物信息学分析。方法 从黄芩愈伤组织中
提取 RNA，反转录为 cDNA，设计特异性引物，克隆得到黄芩查耳酮异构酶（sbCHI）基因。通过生物信息学对该基因蛋白
的特征进行分析，使用 MEGA5.1 构建 sbCHI 与相关物种查耳酮异构酶基因的系统进化树。结果 获得 sbCHI 基因（GeneBank
登录号 KP064512）全长 648 bp，含有 1 个完整的开放阅读框，编码 215 个氨基酸。为不稳定亲水性蛋白，sbCHI 编码蛋白
相对分子质量为 22 980，等电点（pI）为 5.09，不含信号肽，无跨膜区，具有 1 个查耳酮超级家族的保守结构域。二级结构
中 α-螺旋（alpha helix）占 37.21%、β-延伸（β-extended）占 23.25%、无规则卷曲（random coil）占 39.54%。同源性分析显
示，sbCHI 基因与黄芩（ADQ13184.1）核苷酸序列相似性为 99.69%、氨基酸序列相似性为 99.07%，仅在第 31、160 位不同。
结论 成功从黄芩愈伤组织中克隆得到 sbCHI，为进一步鉴定 sbCHI 基因的功能及黄芩苷的合成生物学研究提供基础。
关键词：黄芩愈伤组织；查耳酮异构酶；生物信息学分析；黄芩苷；克隆
中图分类号：R282.022 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)10 - 1506 - 06
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.10.019
Cloning and bioinformatic analysis of chalcone isomerase in Scutellaria baicalensis
GUO Shuang-shuang, CHENG Lin, YANG Li-min, LIU Cui-jing, HAN Mei
College of Traditional Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
Abstract: Objective To clone chalcone isomerase (sbCHI) gene from the callus of Scutellaria baicalensis and to analyze its bioinformatics.
Methods RNA was obtained from scutellariae callus, cDNA was reversely transcribed, specific primers were designed, and then CHI was
cloned. The protein characteristics was analyzed using bioinformatics and the phylogenetic tree of CHI was constructed using MEGA5.1.
Results The 648 bp sbCHI (accession number: KP064512) sequence was obtained, which has a complete open reading frame (ORF),
encoding an unstable protein with 215 amino acids. The sbCHI encoding protein has isoelectric point (pI) of 5.09 and a calculated molecular
weight about 22 980, without transmembrane regions and signal peptide has a conserved domain of chalcone-flavanone isomerase family. In
the secondary structure, the percentage of alpha helix, β-extended , and random coil were 37.21%, 23.25%, and 39.54%, respectively. The
homologous analysis indicates the nucleotide sequence 99.69% similarity and the amino acid sequence 99.07% similarity with S. baicalensis
(ADQ13184.1), only in 31 and 160 were different. Conclusion The sbCHI in scutellariae callus is successfully cloned, which provides the
foundation for further characterization sbCHI functionality and the synthetic biology research of baicalin.
Key words: callus of Scutellaria baicalensis; chalcone isomerase; bioinformatic analysis; baicalin; clone

黄芩为唇形科植物黄芩 Scutellaria baicalensis
Georgi. 的干燥根，作为传统中药材，具有治疗炎
症、呼吸道感染、失眠、腹泻、痢疾、高血压等作
用[1]。《中国药典》2010 年版规定以黄芩苷作为评
价黄芩药材质量标准[2]。研究发现黄芩苷具有抗菌、
抗肿瘤、抗病毒、抗感染、抗 HIV、抗氧化及清除
氧自由基和治疗心血管疾病等作用[3]。目前，黄芩
苷的生物合成途径与其关键酶基因表达之间的关系
仍处于研究阶段。
查耳酮异构酶（chalcone isomerase，CHI，
EC5.5.1.6）是第一个被认识的黄酮类化合物合成相
关酶，也是黄酮代谢途径中的关键酶之一。相关研

收稿日期：2014-12-28
基金项目：国家自然科学基金资助项目（31071292）；国家科技支撑计划项目（2011BAI0301-02）；吉林省科技成果转化项目（20125068）
作者简介：郭双双（1991—），男，硕士研究生，研究方向为中药学和分子生物学。E-mail: 1530811226@qq.com
*通信作者 杨利民（1963—），男，教授，博士，研究方向为中药资源生态与药材质量调控研究。E-mail: ylmh777@126.com
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究证明，黄芩毛状根中CHI基因的表达量与黄酮（黄
芩苷、黄芩素、汉黄芩素）生物量呈正相关[4]。1987
年研究者利用抗体技术首次从法国豌豆中分离出
CHI 基因[5]。随后从矮牵牛 Petunia hybrida Vilm.、
菜豆 Phaseolus vulgaris Linn.、玉米 Zea mays Linn.
等[6-8]大多数维管植物中克隆分离得到。CHI 催化分
子内反应，使双环的柚皮苷查耳酮异构化形成有生
物学活性的三环 2S-二羟基黄烷酮。根据反应底物
的不同将 CHI 基因分为 2 种类型[9]，一类 CHI 基因
仅能催化 6′-羟基查耳酮转化为 5-羟基黄烷酮，存在
于非豆科植物；另一类 CHI 基因存在于豆科植物中
能催化 6′-羟基查耳酮和 6′-脱氧查耳酮转化为相应
的 5-羟基黄烷酮和 5-脱氧黄烷酮。研究发现有些细
菌和真菌中也发现 CHI 基因的存在[10]，将其划分为
第 3 类。
本实验对黄芩苷生物合成途径中的 CHI 基因
（sbCHI）进行克隆与生物信息学分析，旨在从基因
水平上研究黄芩苷生物合成途径的调控机制，实现
黄芩苷合成基因的高效表达，增加药效成分量。为
深入研究CHI家族蛋白的酶学特性和黄酮类生物合
成的分子机制提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
黄芩 Scutellaria baicalensis Georgi. 愈伤组织，
由吉林农业大学中药材学院植物研究室提供。经吉
林农业大学韩梅教授鉴定。于超净工作台中将愈伤
组织放于自封袋中于−80 ℃保存备用。
1.2 主要试剂和仪器
EASYspin Plus Plant RNA Kit、2×Taq PCR
MasterMix 购自北京艾德莱生物科技有限公司，高
纯质粒小量制备试剂盒、DNA 连接试剂盒、多功能
DNA 纯化回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有
限公司，M-Mulv 第一链 cDNA 购自上海生工生物
工程有限公司，LB 培养基、DH5α 感受态细胞购自
大连宝生物工程有限公司。MDF-382E 超低温冰箱
（日本 SANYO），HC-2518R 高速冷冻离心机，PCR
扩增仪（ Mastercycler nexus），凝胶成像系统
[GIS-2010，天能科技（上海）有限公司]，制冰机
（SIM-F140，SANYO），电泳仪（DYY-8C 型，北京
六一电泳厂）。
1.3 方法
1.3.1 总 RNA 提取和 cDNA 合成 取小块黄芩愈
伤组织于液氮中速冻，研钵研成细粉状，按
EASYspin Plus Plant RNA Kit 使用说明，提取黄芩
愈伤组织总 RNA。利用 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测
RNA 完整性。利用 M-Mulv 第一链 cDNA 试剂盒以
Oliga-dT 为引物，合成黄芩愈伤组织 cDNA 链。
反应体系（12 μL）为总 RNA 模板 10 μL，RNase
Free H2O 1 μL，5 μg/μL Oliga 1 μL。反应条件为
65 ℃水浴 5 min 后，立即放于冰上冷却 30 s，然后
离心 3～5 s。5 倍反应缓冲液 4 μL，20 U/μL Rnase
Inhibitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，20 U/μL
M-Mulv RT 1 μL。反应条件为 42 ℃水浴 90 min，
70 ℃变性 10 min，放于冰上 5 min。逆转录 DNA
于−20 ℃保存。
1.3.2 sbCHI 基因的扩增及测序 根据 GenBank 上
已报道的黄芩 CHI 基因 cDNA（HQ153041.1）序列，
使用软件 Primer Primer5.0 设计引物，上游引物为
sbCHI-F：5’-ATGGGTTTTCAGGTTTGGC-3’，下游
引物为 sbCHI-R：5’-TCACTTCCCAGCAGGTTTT-
TCAC-3’。以黄芩的 cDNA 为模板，按照以下体系
对 sbCHI 基因进行扩增：cDNA 1.0 μL，2×Taq 酶
9 μL，10 μmol/L 上下游引物各 0.8 μL，ddH2O 8.4
μL，终体积为 20.0 μL。反应程序为 94 ℃预变性 3
min；然后进行 35 个循环：94 ℃变性 30 s，52 ℃退
火 30 s，72 ℃延伸 1 min；循环结束后 72 ℃延伸 10
min，4 ℃保温。0.8%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产
物，对扩增所得的目的片段进行切胶回收。
将纯化回收的目的片段与 pGEM-T easy载体连
接，再转化到 DH5a 感受态细胞中，涂布在氨苄青
霉素（Amp）、5-溴 -4-氯 -3-吲哚基 -β-D-半乳糖
（X-gal）和异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）
的 LB 平板上进行培养，随机挑取 12 个白色单克隆
经菌落 PCR 扩增和电泳检测后选择阳性克隆送上
海生工生物工程有限公司测序。
1.3.3 sbCHI 基因生物信息学分析 将所测定的
sbCHI基因序列在 NCBI上通过 Blast 搜索蛋白质和
核苷酸数据库，并由 DNAMAN 软件翻译成氨基酸
序列，使用 ORF Finder 查找开放阅读框（ORF）。生
物信息学分析主要采用一些网上在线软件进行分析，
如采用 Interpro（http://www.ebi. ac.uk/Tools/InterPro-
Scan/）进行结构域比对，ExPASy 在线服务器的
Compute PI/Mw（http://web.expasy.org/compute_pi/）
预测相对分子质量与理论等电点，TargetP1.1 server
（http://www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）进行信号肽
分析，SWISS-MODEL（http://swissmodel. expasy.
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org/）进行二级结构分析和结构域的三维同源建模。
用 DNAMAN 软件对序列进行多重比对，用
ClustalW软件与其他植物的CHI氨基酸序列进行比
较，用 MEGA 5.1 软件构建 Neighbor-joining 系统进
化树，bootstrap 重复次数为 1 000 次。
2 结果与分析
2.1 sbCHI 基因的克隆
对黄芩愈伤组织的总 RNA 进行浓度和纯度检
测，得到的 RNA 质量浓度为 115 ng/μL、A260/A280
的值为 1.817，表明所提取的总 RNA 完整性和纯度
较好，可用于下一步实验。根据 Genbank 中已公布
的黄芩 CHI 基因的 CDS 设计引物，以黄芩愈伤组
织 RNA 反转录得到的 cDNA 为模板，利用 PCR 技
术扩增得到一条长为 648 bp 的序列（图 1-A），为
区别于 Genbank 中的 1 条黄芩 CHI 基因，将所扩增
基因命名为 sbCHI，并将核酸序列提交到 NCBI 中
的 GenBank 数据库，登陆序列号为 KP064512。
将 PCR 产物进行纯化回收，回收结果见图 1-B，
连接到 pGEM-T easy 载体上。将于 4 ℃条件下连接
过夜的 CHI/pGEM-T easy 载体转化到 DH5α感受态
细胞中，涂布到 LB 平板培养基上培养，对随机挑
取的 12 个单克隆菌落进行菌落 PCR（图 1-D）。挑
取 3 株有阳性克隆的菌落进行测序，同时提取这 3
株菌落的重组质粒（图 1-C）。

A-sbCHI 基因的扩增 B-sbCHI 基因纯化回收的检查结果 C-重组质粒 pGEM-T easy-sbCHI 的电泳检测 D-重组质粒 pGEM-T easy-sbCHI 的
阳性克隆检测结果；1～3、7～18-sbCHI 基因条带 4～6-pGEM-T easy-sbCHI 条带 M-Marker
A-ORF amplification of sbCHIgene B-detection of recover purified sbCHIgene C-gel detection of pGEM-T easy-sbCHI D-detection of positive
clones of pGEM-T easy-sbCHI 1—3, 7—18-sbCHI 4—6-pGEM-T easy-sbCHI M-Marker
图 1 sbCHI 基因的克隆
Fig. 1 Cloning of sbCHI
2.2 理化性质分析
利用 ExPASy Proteomics Server 的在线软件
Protparam 预测 sbCHI 基因编码蛋白的理化性质。CHI
编码的蛋白由 215 个氨基酸组成（图 2），分子式为
C1037H1634N258O321S4，总原子数为 3 254。相对分子质
量为 22 980，理论等电点 5.09，带负电基（Asp＋Glu）
为 26，带正电基（Arg＋Lys）为 21。不稳定指数为
47.93，表明该蛋白不稳定。脂溶指数（aliphatic index）
为 85.30。总平均亲水性（GRAVY）为−0.034，通常
根据 GRAVY 值范围在−2～2，正值表明此蛋白为疏
水性蛋白，负值表明此蛋白为亲水性蛋白，故 sbCHI
基因编码蛋白为亲水性蛋白。
2.3 sbCHI 基因编码蛋白二级结构分析、结构域预
测及三维建模
采用SWISS-MODEL进行 sbCHI的编码蛋白二
级结构分析和结构域预测。sbCHI 编码蛋白的二级结
构中，α-螺旋（alpha helix）占 37.21%、β-延伸
（β-extended）占 23.25%、无规卷曲（random coil）占
39.54%。蛋白质的空间结构决定了其功能作用，α-螺
旋主要对蛋白质骨架起稳定作用，而无规则卷曲结构
决定了蛋白质尤其是酶的功能部位常常位于这种构
象区域，通过对蛋白质二级与三级结构预测和分析，
有助于理解蛋白质功能与结构的关系[11]。
InterProScan 的结构域预测结果（图 3）表明，
sbCHI 基因编码蛋白在 5～215 位，包含一个查耳酮
超级家族结构域。如图 4 所示，三维同源模型以
4doi.1.A 蛋白为模板，序列同源性为 50%，用于建
立该模型的氨基酸残基范围为 6～214 位，从图 2
中可以看出，sbCHI 基因预测的编码蛋白二级结构
与三级结构预测结果相符合。
2.4 sbCHI 基因编码蛋白信号肽、亚细胞定位、跨
膜区预测分析
通过 Signal P4.1（http://www.cbs.dtu.dk/services/
SignalP/）对蛋白信号肽预测，如图 5，S 值表示每

1 2 M 3 M 4 5 6 M 7 18 M
A B C D
2 000 bp
500 bp
300 bp
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图 2 sbCHI 基因的 cDNA 和编码氨基酸
Fig. 2 cDNA of sbCHI and its deduced amino acid sequence of S. icalensis


图 3 InterProScan 在线软件预测 sbCHI 基因编码蛋白的保守结构域
Fig. 3 Conserved domain prediction of sbCHI encoding protein using InterproScan

图 4 sbCHI 编码蛋白三维结构的预测
Fig. 4 Deduced 3D structure of sbCHI coding protein

图 5 蛋白信号肽预测图
Fig. 5 Prediction of protein signal peptide
个氨基酸对应 1 个 S 值，图表中有一个曲线显示
S 值的变化趋势，信号肽区域的 S 值较高。C 值
是剪切位点值。每个氨基酸会有一个 C 值，在剪
切位点处 C 值是最高的。Y 值是 Y-max 综合考虑
S 值和 C 值的一个参数，其比单独考虑 C 值要更
精确。因为在一条系列中 C 值可能有不止一个较
高的位点，但是剪切位点只有一个，此时的剪切
位点就由 Y-max 值来推测的，为 S 值是陡峭的位
置和具有高 C 值的位点。当 C 值最大，S 值陡峭，
Y 值最高峰时，就可以预测为信号肽的切位点。
分析可知该蛋白没有信号肽。利用 TMHMM
Server v. 2.0（http://www.cbs.-dtu.dk/services/ TMHMM/）
预测可知 sbCHI 编码蛋白跨膜螺旋数为 0，结果
见图 6，可知此蛋白无跨膜区。TargetP 1.1 Server
在线工具分析结果显示，此蛋白定位于叶绿体中
的值为 0.634、定位于线粒体中的值为 0.030、定
位于其他位置中的值为 0.275，因此 sbCHI 基因
编码蛋白最可能定位于叶绿体中。且分泌通道信
号肽（SP）得分为 0.337，而只有当 SP 值接近 1
时预测可能有信号肽，这与利用 Signal P4.1 进行
信号肽预测结果一致。
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
得
分

0 10 20 30 40 50 60 70
位置/bp
C 值
S 值
Y 值
1
1
31
91
61
181
91
271
121
361
151
451
181
541
211
631
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图 6 蛋白跨膜区预测图
Fig. 6 Prediction of protein transmembrane domain
2.5 sbCHI 编码蛋白的同源性及系统进化树分析
利用 DNAMAN 软件，将 sbCHI 编码蛋白氨基
酸序列与 GenBank 中已公布的菊花、藿香、三花龙
胆、紫苏、黄芩进行序列比对（图 7），相似性分别
为 64.24%、69.29%、64.86%、75.69%、99.07%。
其中紫苏 CHI 基因和藿香 CHI 基因与 sbCHI 同属
于唇形科较其他植物的氨基酸序列相似性高，sbCHI
基因与黄芩（ADQ13184.1）核苷酸相似性为 99.69%、
氨基酸相似性为 99.07%，仅在 31 位的亮氨酸和苯丙
75黄芩
75sbCHI
85藿香
71紫苏
75菊花
77三花龙胆
Consensus


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160黄芩
160sbCHI
170藿香
156紫苏
160菊花
161三花龙胆
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215黄芩
215sbCHI
241藿香
214紫苏
234菊花
221三花龙胆
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图 7 黄芩和其他植物的 CHI 编码氨基酸的序列分析
Fig. 7 Multiple alignment of putative amino acids sequence of sbCHI with those of cloned CHI in other plants
氨酸不同、160 位的甘氨酸和半胱氨酸不同。
为了分析 sbCHI 基因编码蛋白的进化情况，从
GenBank 数据库中共选取了 17 个物种的 19 条 CHI
序列，经过软件 Clustal W 比对并利用 MEGR5.0 中的
neighbor-joining 方法[12]。构建了植物、细菌不同生物
CHI 基因的进化树如图 8 所示，这些序列分别聚类为
单子叶植物、双子叶植物、双子叶植物唇形科、细菌
门，其中单子叶植物和双子叶植物同属于第一类、双
子叶植物唇形科属于第二类、细菌门属于第三类。其
中 sbCHI 基因与唇形科的藿香、紫苏聚类为一支，与
黄芩（ADQ13184.1）亲缘最近，和同源性分析结果
相同，同属于第一类。这与实验预期相符，在一定程
度上说明克隆得到的 sbCHI 基因为黄芩 CHI 基因。
3 讨论
CHI 在黄芩苷形成的代谢途径中，主要催化双
环的柚皮苷查耳酮异构化形成有生物学活性的三环
2S-二羟基黄烷酮，是关键酶之一。从 1987 年首次

图 8 CHI 编码蛋白系统进化树
Fig. 8 Phylogenetic tree of sbCHI and their related sequences
sbCHI
黄芩
藿香
白苏
野茶树
拟南芥
矮牵牛（1）
矮牵牛（2）
菊花
三花龙胆
洋葱
玉米
水稻
小麦
豌豆
菜豆
百脉根（1）
百脉根（2）
水栖黄杆菌
希瓦氏菌



第一类






第二类

第三类
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
概
率
/%

0 50 100 150 200
氨基酸数

黄芩
sbCHI
藿香
紫苏
菊花
三叶龙胆
共同片段

黄芩
sbCHI
藿香
紫苏
菊花
三叶龙胆
共同片段


黄芩
sbCHI
藿香
紫苏
菊花
三叶龙胆
共同片段
75
75
85
71
75
77


160
160
170
156
160
161



215
215
241
214
234
221
跨膜区 内侧 外侧
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46 卷 第 10 期 2015 年 5 月

• 1511 •
得到第一个 CHI 基因，随后陆续从矮牵牛、藿香、
紫苏、三花龙胆、黄芩等大多数植物中克隆获得 CHI
基因。除了在植物中发现 CHI 基因，在一些细菌、
真菌中也克隆出 CHI 基因。
植物黄酮类化合物在植物中的积累，受 CHI
基因表达量的影响。通过荧光定量 PCR 对银杏叶
片中 CHI 基因进行分析，结果显示查耳酮异构酶
的活性和查耳酮异构酶基因的表达量与叶片中的
黄酮类化合物的积累相关[13]；利用酵母提取物和
PEG8000 处理甘草毛状根，提高 CHI 基因的表达
量，结果甘草毛状根中的类黄酮化合物的量明显
增加[14]；通过对黄芩毛状根中 CHI 基因进行过表
达处理和基因沉默处理，发现黄芩毛状根中黄酮
类物质相应的增加和减少。这些研究在一定程度
上说明了 CHI 基因的表达量与植物中黄酮类化合
物呈正相关。
本实验首次以黄芩愈伤组织为材料，克隆了
sbCHI 基因的全长 cDNA，长度为 648 bp，包含 1 个
ORF，共编码 215 个氨基酸，并对其进行生物信息学
分析，预测 CHI 相对分子质量大小和等电点分别为
22 980 和 5.09，为不稳定的亲水性蛋白；二级结构中
以 α-螺旋、β-延伸以及无规卷曲为主，保守结构域属
于查耳酮超级家族。通过同源性分析及系统进化树分
析，发现 sbCHI 基因与藿香、紫苏唇形科植物的亲缘
较近，氨基酸序列相似性最高仅有 75.69%，说明物种
间的差异比较大。类黄酮生物合成通过苯丙氨酸代谢
途径，是目前最为清楚的植物次生代谢产物合成途
径。黄芩作为一种重要的药用植物，黄芩苷是黄芩中
量最高的类黄酮化合物。目前，关于黄芩类黄酮代谢
途径的上游基因均已克隆获得，下游基因研究较少，
至于黄芩调节基因研究还未有报道。关于黄芩 CHI
基因在转录水平的变化已有研究报道，为了更深入
了解黄芩 CHI 基因，应用生物信息学方法对 sbCHI
基因编码的蛋白进行序列比对、分析，从而对其结
构和功能进行推断和预测，为该基因的功能研究提
供科学依据。
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