全 文 ：·3214· 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 46卷 第 21期 2015年 11月

左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症大鼠海马血脑屏障紧密连接蛋白、IV
型胶原蛋白和 α-平滑肌肌动蛋白表达的影响
杨 蕙 2，杜 青 1，赵洪庆 1，谭小雯 1，孟 盼 1，王宇红 1*
1. 湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培育基地，湖南 长沙 410007
2. 湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007
摘 要：目的 研究左归降糖解郁方对糖尿病并发抑郁症（DD）大鼠海马血脑屏障紧密连接蛋白（ZO-1）、IV 型胶原蛋白
（CoIV）、α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达的影响。方法 采用 ig高脂乳剂、尾 iv链脲佐菌素（STZ，38 mg/kg）、28 d慢
性应激联合的方法建立 DD大鼠模型并随机分为 5组：模型组，阳性药（盐酸二甲双胍 0.18 g/kg＋百忧解 1.8 mg/kg）组，
左归降糖解郁方高、中、低剂量（32.82、16.41、8.20 g/kg）组，并以正常大鼠为对照组，每组 10只。给药 4周后，电镜下
观察血脑屏障的形态变化，免疫组化法检测海马血脑屏障 CoIV、ZO-1、α-SMA的表达情况。结果 与对照组比较，模型组
大鼠 ZO-1、α-SMA的表达下降，CoIV的表达升高，差异显著（P＜0.05）；与模型组比较，阳性药组和左归降糖解郁方高剂
量组大鼠 ZO-1、α-SMA的表达升高，CoIV的表达下降，差异显著（P＜0.05、0.01）。结论 左归降糖解郁方可以保护 DD
大鼠血脑屏障的损伤，其保护机制可能与升高血脑屏障 ZO-1和 α-SMA的表达，降低 CoIV的表达有关。
关键词：左归降糖解郁方；糖尿病并发抑郁症；紧密连接蛋白；IV型胶原蛋白；α-平滑肌肌动蛋白
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2015)21 - 3214 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.21.016
Effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula on protein expression of CoIV, ZO-1, and
α-SMA in hippocampal blood-brain barrier of diabetes mellitus rats with depression
YANG Hui2, DU Qing1, ZHAO Hong-qing1, TAN Xiao-wen1, MENG Pan1, WANG Yu-hong1
1. Training Bases, Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial
and Ministry, Changsha 410007, China
2. First Hospital of Hunan University of Traditional Chinese Medicine, Changsha 410007, China
Abstract: Objective To investigate the effects of Zuogui Jiangtang Jieyu Formula (ZJJF) on protein expression of CoIV, ZO-1, and
α-SMA in hippocampal blood-brain barrier (BBB) in diabetes mellitus (DM) rats with depression. Methods DM rat model with
depression was established by the combination of high-fat diet, injection of Streptozotocin (STZ, 38 mg/kg), and chronic stress. The
model rats were randomly divided into five groups, DM with depression group, metformin (0.18 g/kg) + fluoxetine (1.8 mg/kg)
group, high-, mid-, and low-dose (32.82, 16.41, and 8.20 g/kg) ZJJF groups (n = 10). After 4 weeks of administration, the
morphological changes of BBB were observed under the electron microscope, the expression of CoIV, ZO-1, and α-SMA in rat
hippocampul BBB was detected by immunocytochemistry. Results Compared with the control group, the expression of ZO-1 and
α-SMA in the model group was decreased (P < 0.05), and the expression of CoIV was increased (P < 0.05). Compared with the
model group, the expression of ZO-1 and α-SMA in metformin + fluoxetine group and high-dose ZJJF group was increased (P <
0.05, 0.01), and the expression of CoIV was decreased (P < 0.05). Conclusion ZJJF could repair the damage of BBB in DM rats
with depression, and the mechanism may be related to the expression regulation of CoIV, ZO-1, and α-SMA.
Key words: Zuogui Jiangtang Jieyu Formula; diabetes mellitus with depression; CoIV; ZO-1; α-SMA

糖尿病是由胰岛素分泌缺陷或抵抗引起机体
糖、脂肪和蛋白质代谢异常，以慢性高血糖为主要
特征；社会压力的增大诱发糖尿病患者产生抑郁症
状，并逐渐形成糖尿病并发抑郁症（diabetes mellitus

收稿日期：2015-02-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81373578，81403379）；湖南省自然科学基金项目（13JJ5030）；湖南省科技厅科技计划项目（2012SK3141）
作者简介：杨 蕙（1987—），女，研究实习员，硕士，研究方向为中药学。Tel: (0731)85369061 E-mail: 348541369@qq.com
*通信作者 王宇红，博士生导师，研究方向为药效组方筛选。Tel: (0731)85369061 E-mail: wyh107@126.com
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with depression，DD）[1]。目前，针对 DD的机制研
究多集中在下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴，对于
血脑屏障损伤的分子机制研究甚少。Serlin等[2]综述
了血管病变、血脑屏障受损在 2型糖尿病并发认知
障碍中的作用，认为血脑屏障损伤是 2型糖尿病并
发抑郁症发生的重要因素。基底膜蛋白（CoIV）、
紧密连接蛋白（ZO-1）、周细胞蛋白（α-SMA）分
别是血脑屏障微血管基底膜、血管内皮、周细胞的
标志蛋白，对维持血脑屏障结构功能完整性具有重
要作用[3-4]。DD的发生是否与血脑屏障CoIV、ZO-1、
α-SMA的表达异常有关，目前还未见报道。本课题
组前期研究发现中药复方左归降糖解郁方对 DD具
有较好的治疗作用[5]，本实验采用左归降糖解郁方
对 DD大鼠进行干预，观察其对海马血脑屏障的作
用及对 CoIV、ZO-1、α-SMA表达的影响，对深入
探索 DD血脑屏障的损伤及中药保护作用具有重要
意义。
1 材料
1.1 药品与试剂
左归降糖解郁方（黄芪 18 g、贯叶连翘 3 g、姜
黄 9 g、熟地黄 15 g、山茱萸 12 g、枸杞 12 g、菟丝
子 9 g、杜仲 9 g、丹参 12 g、丹皮 6 g、牛膝 9 g）
原药材均购自湖南中医药大学第一附属医院，并由
该院制剂科按比例水煎浓缩后制成口服液 100 mL
（相当于生药量 1.14 g/mL），一测多评法进行质量控
制，其主要药效成分质量浓度分别为黄芪甲苷≥
0.03 g/L、贯叶金丝桃素≥0.018 g/L、姜黄素≥0.4
g/L、丹酚酸 B≥1.2 g/L、丹皮酚≥0.2 g/L。链脲佐
菌素（STZ），美国 Sigma 公司；兔抗大鼠 CoIV、
ZO-1、α-SMA多克隆抗体，武汉博士德有限公司；
高脂乳剂组成：10%胆固醇、0.2%丙硫氧嘧啶、20%
猪油、2%胆酸钠、20%聚山梨酯、20%聚山梨酯-80、
20%丙二醇，加蒸馏水至 100 mL；盐酸二甲双胍片
（规格 0.25 g，批号 1402115，湖南湘雅制药有限公
司）；百忧解（盐酸氟西汀胶囊，20 mg，批号 2087A，
法国 Patheon）。
1.2 实验动物
SPF级雄性 SD大鼠 60只，体质量 180～220 g，
由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证
号 SCXK（湘）2013-0004。
1.3 仪器
One Touch II血糖仪及血糖试纸（美国强生公
司）；动物行为学习记忆系统（法国Viewpoint公司）；
Olympus 生物显微镜（日本 OLYMPUS 公司）；
DVP-W7显微镜图像处理系统（南京长城信息系统
公司）；RM223 切片机（德国莱卡公司）；H600 型
透射电镜（日本日立公司）。
2 方法
2.1 DD大鼠模型的制备[5]
SD大鼠以高脂乳剂 10 mL/kg连续 ig 14 d，每
天 1次，末次 ig后，大鼠禁食不禁水 24 h，1次性
尾 iv STZ（溶于新鲜配制的 0.1 mol/L、pH 值 4.5
枸橼酸缓冲液中，4 ℃保存）38 mg/kg，对照组尾
iv 枸橼酸缓冲液，给药体积为 2 mL/kg。造模 3 d
后，大鼠禁食不禁水 6 h，测定空腹血糖，空腹血
糖≥16.00 mmol/L的大鼠为糖尿病模型成功大鼠。
给予糖尿病模型大鼠慢性应激，具体包括 4 ℃冰水
浴 5 min、45 ℃热刺激 5 min、倾笼 45° 24 h、噪音
8 h、昼夜颠倒 24 h、潮湿垫料（每笼 200 mL，24 h）、
夹尾 1 min，每天采用 1 种刺激，同种刺激不连续
出现，共刺激 28 d。
2.2 动物分组与给药方法
50只 DD模型大鼠随机分为 5组：模型组，阳
性药（盐酸二甲双胍 0.18 g/kg＋百忧解 1.8 mg/kg）
组，左归降糖解郁方高、中、低剂量（32.82、16.41、
8.20 g/kg）组，每组 10只，各组大鼠应激造模的同
时 ig给药 28 d。另取 10只 SD大鼠作为对照组。
对照组和模型组给予等体积的生理盐水。
2.3 血脑屏障电镜检测
取上述各组大鼠脑组织样本，用 2.5%戊二醛
浸泡固定后；再用 1%锇酸（OsO4）固定；丙酮逐
级脱水；环氧树脂包埋；切超薄片，染色，透射电
镜下观察，拍照。
2.4 免疫组化检测
大鼠用 10%的水合氯醛麻醉后，快速开胸，心
脏插管灌入生理盐水，待澄清液流出后，对其进行
4%的多聚甲醛灌注，待大鼠四肢僵硬后，断头取全
脑，保存在 4%的多聚甲醛液中，石蜡包埋，制成 5
μm 的石蜡切片。免疫组织化学进行染色：切片脱
蜡至水，冲洗，加一抗 4 ℃过夜，再加入二抗，脱
水封片。在光学显微镜下观察每张玻片上 3个不重
复视野中 CoIV、ZO-1、α-SMA 的阳性细胞数（阳
性细胞为棕褐色），然后进行统计分析。
2.5 统计学处理
实验数据采用 ±x s表示，运用 SPSS 16.0统计
软件进行统计分析，组间采用单因素方差分析
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（One-way-ANOVA），t检验，双侧检验。
3 结果
3.1 血脑屏障电镜观察
与对照组比较，模型组大鼠血脑屏障内皮细胞
发生肿胀，管腔狭窄，星形胶质细胞水肿明显，血
脑屏障出现明显的损伤现象，阳性药组与左归降糖
解郁方高剂量组水肿明显减轻，管腔狭窄得到缓解。
中、低剂量组血脑屏障病理损伤改善不明显。结果
见图 1。
3.2 各组大鼠海马血脑屏障 ZO-1、CoIV、α-SMA
表达比较
与对照组比较，模型组大鼠 ZO-1、α-SMA 免
疫阳性细胞数减少，CoIV 阳性细胞数增多，提示
ZO-1、α-SMA 表达下降，CoIV表达升高，差异显
著（P＜0.05）。与模型组比较，阳性药组和左归降
糖解郁方高剂量组 ZO-1、α-SMA免疫阳性细胞数增
加，CoIV阳性细胞数减少，提示 ZO-1、α-SMA表
达上升，CoIV表达下降，差异显著（P＜0.05、0.01）。
结果见表 1和图 2。
4 讨论
我国约有 51%的糖尿病患者存在不同程度的抑
郁症，其中轻度抑郁占 38%，中度 8%，重度 5%，
自杀的危险性高达 10%，远高于普通人群的
0.01%～0.03%[6]，其治疗成本高，死亡率大。因此，


对照 模型 阳性药

左归降糖解郁方 32.82 g·kg−1 左归降糖解郁方 16.41 g·kg−1 左归降糖解郁方 8.20 g·kg−1
图 1 各组大鼠血脑屏障电镜观察结果
Fig. 1 Electron microscope results of BBB of rats in each group
表 1 各组大鼠海马 ZO-1、CoIV、α-SMA免疫阳性细胞数 ( x±s, n = 10)
Table 1 Numbers of ZO-1, CoIV, and α-SMA immunoreactive cells in hippocampus of rats in each group ( x±s, n = 10)
组别 剂量/(g·kg−1) ZO-1阳性细胞数 CoIV阳性细胞数 α-SMA阳性细胞数
对照 — 18.50±0.77 44.50±0.71 28.05±0.94
模型 — 8.51±1.13* 71.00±1.31* 6.74±1.33*
阳性药 — 16.75±0.27# 40.75±1.77## 23.33±1.51#
左归降糖解郁方 32.82 14.67±1.53# 40.50±0.53## 22.67±1.13#
16.41 12.49±0.71 54.47±0.23 12.63±0.63
8.20 11.00±0..48 69.30±1.92 8.30±1.34
与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01
*P＜0.05 vs control group; #P＜0.05 ##P＜0.01 vs model group
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对照 模型 阳性药 32.82 16.41 8.20
左归降糖解郁方/(g·kg−1)
图 2 各组大鼠海马血脑屏障 ZO-1、CoIV、α-SMA免疫组化结果
Fig. 2 Immunohistochemical results of ZO-1, α-SMA, and CoIV in hippocampal BBB of rats in each group
对 DD的治疗已迫在眉睫。但是目前临床治疗多采
用化学药，将糖尿病与抑郁症分开治疗，其作用单
一，且副作用大。而传统中药可对 DD进行多环节、
多靶点调节且毒副作用小，疗效持久，应用前景广
阔。本课题组前期研究发现中药复方左归降糖解郁
方对 DD具有较好的治疗作用，其机制与保护海马
损伤有关[7]。由于海马血脑屏障可依其屏障功能阻
止血液中有害物质进入脑内并损伤海马，所以海马
的结构与功能正常与血脑屏障功能的完整性密切相
关。因此，本实验继续以左归降糖解郁方为研究对
象，观察其对血脑屏障的保护作用及对 CoIV、
ZO-1、α-SMA表达的影响。
血脑屏障是中枢神经系统特有的重要结构，由
内到外有 4层结构：脑毛细血管内皮细胞之间紧密连
接、毛细血管基膜、星形胶质细胞终足和周细胞[8]。
在电镜下观察到模型组大鼠血脑屏障内皮细胞发生
肿胀，星形胶质细胞水肿。给予左归降糖解郁方干
预后，模型大鼠海马血脑屏障的损伤得到明显改善。
ZO-1 是一类在上皮和血管内皮细胞紧密连接
胞质表面的高分子量磷蛋白[9]，其中一个功能是组
织紧密连接的组件，并将组件连接到皮层肌动蛋白
细胞的骨架中去[10]，其表达与血脑屏障的通透性有
着紧密联系。本研究发现，与对照组比较，DD 大
鼠 ZO-1表达减少，结果推测 ZO-1的减少使微血管
紧密连接不能连接到皮层肌动蛋白细胞的骨架中
去，从而使血脑屏障紧密连接开放，导致血脑屏障
发生损伤。与模型组大鼠相比，左归降糖解郁方高
剂量组大鼠 ZO-1表达增加。
基底膜是血脑屏障的重要组成部分，对血脑屏
障的屏障作用维持起着重要作用[11]。CoIV 是血脑
ZO-1
α-SMA
CoIV
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屏障基底膜的核心胶原成分，与层粘连蛋白有很高
的亲和力，广泛分布于基底膜的透明层，二者结合
形成基底膜的骨架，是基底膜主要的组成蛋白[12]。
有研究表明，糖尿病时由于血糖增高刺激 IV 型胶
原蛋白及层粘连蛋白合成，并使转录这些分子的
mRNA 水平升高，促使毛细血管基底膜增厚[13]，
因而测定 IV型胶原水平可以反映基底膜的代谢情
况。本研究发现，与对照组比较 DD大鼠 CoIV表
达增多。推测在 DD病理条件下，CoIV表达增多，
使基底膜骨架发生变化，进而导致基底膜增厚，血
脑屏障结构功能发生改变。而与模型组大鼠相比，
左归降糖解郁方高剂量组大鼠 CoIV表达减少。
α-SMA是周细胞表型转化的标志[14]。周细胞表
型转化是指周细胞经过各种有害机制作用受到损伤
时，细胞形态、结构发生改变，在糖尿病病理条件
下，氧化应激使线粒体发生损伤，致使血脑屏障周
细胞损伤[15]。本研究发现，与对照组大鼠相比，DD
大鼠 α-SMA表达减少，推测 α-SMA表达的减少致
使周细胞从正常的收缩型向合成型转化，导致周细
胞丢失。与模型组大鼠相比，左归降糖解郁方高剂
量组大鼠 α-SMA表达增加。
左归降糖解郁方是以张景岳左归饮、左归丸为
基础方化裁而得，由熟地黄、枸杞、山茱萸、牛膝、
菟丝子、杜仲、黄芪、姜黄、贯叶连翘组成，整方
共奏滋阴益气、化瘀解郁的功效。本实验研究发现，
其能明显改善 DD大鼠血脑屏障病理损伤，推测其
可能是通过调控海马血脑屏障 ZO-1、CoIV、α-SMA
的表达，分别改善内皮细胞、基底膜细胞、周细胞
的形态结构功能，进行协同保护血脑屏障结构稳定。
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