全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 9期 2016年 5月 ·1508·
板蓝根多糖的系统分离纯化与组成分析
国 欣 1，胡小龙 1，王月荣 1*，杨子峰 2，王玉涛 2，李征途 2，胡 坪 1*
1. 上海市功能性材料化学重点实验室，华东理工大学化学与分子工程学院，上海 200237
2. 广州医科大学附属第一医院 呼吸疾病国家重点实验室，广东 广州 510230
摘 要：目的 建立板蓝根多糖的系统分离纯化方法，并对分离得到的均一多糖进行组成测定。方法 以抗病毒活性较好的
80%醇沉板蓝根粗多糖为研究对象，对其进行 DEAE-Sepharose Fast Flow柱色谱、Sephacryl-200葡聚糖凝胶柱色谱以及高效
凝胶色谱系统分离纯化。分别采用 1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）和邻苯二甲醛（OPA）衍生化 HPLC 法对分离得到的
板蓝根均一多糖进行单糖组成和氨基酸组成测定。结果 利用系统分离纯化策略，从 80%醇沉板蓝根粗多糖中分离得到 2
种均一板蓝根多糖（IRPS1A和 IRPS1B）和 2种均一板蓝根糖蛋白（IRPS2A和 IRPS3A）。其中，IRPS1A与 IRPS1B的单
糖组成均为甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖；IRPS2A的单糖组成为半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖；IRPS3A
的单糖组成为甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖。糖蛋白 IRPS2A与 IRPS3A均含有天门冬氨酸、
谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、苏氨酸、精氨酸、丙氨酸、胱氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸，
共 14种氨基酸残基。同时，IRPS2A还含有酪氨酸残基。结论 该系统分离纯化的策略可应用于板蓝根均一多糖（糖蛋白）
的获取，为板蓝根多糖的结构分析及药理活性研究奠定基础。
关键词：板蓝根多糖；板蓝根糖蛋白；系统分离纯化；单糖组成；氨基酸组成
中图分类号：R284.2 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)09 - 1508 - 07
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.09.010
System isolation and purification of Isatidis Radix polysaccharides and
determination of their compositions
GUO Xin1, HU Xiao-long1, WANG Yue-rong1, YANG Zi-feng2, WANG Yu-tao2, LI Zheng-tu2, HU Ping1
1. Shanghai Key Laboratory of Functional Materials Chemistry, School of Chemistry and Molecular Engineering, East China
University of Science and Technology, Shanghai 200237, China
2. State Key Laboratory of Respiratory Diseases, the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou
510230, China
Abstract: Objective To isolate and purify the polysaccharides (glycoproteins) from Isatidis Radix (Banlangen) systematically and to
study the composition of them. Methods Crude polysaccharides precipitated by 80% ethanol from the water extract of Isatidis Radix,
which has the anti-viral activity, were fractionated by DEAE-Sepharose Fast Flow, Sephacryl-200, and high gel chromatography
system sequentially. The composition of monosaccharides and amino acids of polysaccharides (glycoproteins) was then determined by
HPLC with pre-column derivatization using 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone (PMP) and o-phthalaldehyde (OPA), respectively.
Results Two of homogeneous polysaccharides named IRPS1A and IRPS1B and two of homogeneous glycoproteins named IRPS2A
and IRPS3A were obtained from Isatidis Radix by systematical separation and purification. The monosaccharide composition of
IRPS1A and IRPS1B was of arabinose, mannose, galactose, and glucose. IRPS2A contained galacturonic acid, glucose, galactose, and
arabinose. While IRPS3A contained mannose, rhamnose, galacturonic acid, glucose, galactose, and arabinose. The amino acid
compositions of IRPS2A and IRPS3A were 14 kinds of amino acid residues including Asp, Glu, Ser, His, Gly, Thr, Arg, Ala, Cys, Val,
Phe, Iso, Leu, and Lys. Besides all, IRPS2A also contained Tyr. Conclusion This strategy can be used for the isolation and
purification of homogeneous polysaccharides/glycoproteins from Isatidis Radix which provides a possible support for the elucidation
of the structure and the pharmacologic action of Isatidis Radix polysaccharides (glycoproteins).
Key words: Isatidis Radix polysaccharides; Isatidis Radix glycoproteins; system isolation and purification; monosaccharide
composition; amino acid composition

收稿日期：2015-12-16
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81273481，U1201227，81403167）；广州市属高校科研项目（1201430183）
作者简介：国 欣（1990—），女，在读硕士，研究方向为天然产物的分离与分析。Tel: (021)64252844 E-mail: fionastarguo@hotmail.com
*通信作者 胡 坪（1970—），女，教授，博士，从事天然产物分离与分析方向的研究。Tel: (021)64252844 E-mail: huping@ecust.edu.cn
王月荣（1978—），女，讲师，博士，从事中药分析方向。Tel: (021)64252844 E-mail: wangyuerong@ecust.edu.cn

中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 9期 2016年 5月 ·1509·
板蓝根 Isatidis Radix是中国传统中草药，始载
于《神农本草经》，味苦，性寒，具有清热解毒、凉
血利咽之功效，临床上常用于病毒性及细菌性感染
疾病等[1-2]。多糖是板蓝根入药部位（水提部位）的
主要化学成分，Du等[3]对 95%醇沉板蓝根粗多糖进
行分离纯化得到相对分子质量（MW）为 57 000的
均一多糖 RIWP，并首次报道了多糖 RIWP 对小鼠
肺泡巨噬细胞的抗氧化和抗炎活性；杨子峰等[4-5]
对板蓝根水提物 S-03 进行研究发现其可以体外抑
制甲、乙型流感病毒的感染；对 MW在 3 500～7 000
的粗多糖 G2研究发现，在病毒感染早期 G2可能通
过影响病毒颗粒来干扰流感病毒的附着，从而防止
流感病毒的感染；日本学者 Yamada 认为板蓝根抗
病毒成分之一为糖肽与蛋白质或多肽的复合物，即
糖蛋白或糖肽，且分离出一种抗病毒的糖蛋白[6]。
板蓝根粗多糖是一种较为复杂的混合物，由多种不
同组成、不同 MW的均一多糖以及糖蛋白等构成，
因此，对板蓝根粗多糖进行系统分离纯化，对于筛
选活性多糖（糖蛋白）成分，阐明板蓝根多糖（糖
蛋白）的抗病毒机制至关重要。
本实验在前期粗分离和活性追踪的基础上[7]，
以抗病毒活性较好的 80%醇沉板蓝根粗多糖为研究
对象，采用系统分离纯化法，得到 2种板蓝根均一
多糖 IRPS1A 和 IRPS1B 及 2 种板蓝根均一糖蛋白
IRPS2A和 IRPS3A，并测定其单糖组成和氨基酸组
成，为板蓝根的抗病毒物质及机制研究奠定基础。
1 材料
1.1 仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪，美国 Agilent公
司；配备 Alltech 3300 ELSD检测器，上海埃纹斯科
贸有限公司；RE-52C 旋转蒸发仪，巩义市英峪予
华仪器有限公司；FDl 冷冻干燥机，北京博医康仪
器有限公司；CH-8606微量分析天平，瑞士Mettler
Toledo公司；BSZ-100自动部分收集器，上海青浦
沪西仪器厂；EPED-E2-10TF 超纯水器，南京易普
易达科技发展有限公司；UV-2550 紫外可见分光光
度计，日本 Shimadzu公司。
1.2 药材与试剂
板蓝根由广州白云山和记黄埔中药有限公司提
供，采自黑龙江大庆及安徽阜阳板蓝根 GAP基地，
由中国科学院华南植物院叶华国研究员鉴定为十字
花科菘蓝属植物菘蓝 Isatis indigotica Fort. 的根；硫
酸、盐酸、苯酚、氯化钠、磷酸二氢钠、磷酸氢二
钠，分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司；DEAE-
Sepharose Fast Flow、Sephacryl-200，GE Healthcare；
乙腈，色谱纯，Honeywell；无水乙醇，分析纯，上
海泰坦科技股份有限公司；葡萄糖、甘露糖、木糖、
阿拉伯糖、鼠李糖、半乳糖、半乳糖醛酸，上海源
聚生物科技有限公司，质量分数≥99%；三氯甲烷，
分析纯，上海化学试剂有限公司；透析袋，截留
MW 3 500，联合碳化；标准葡聚糖的MW 1 000（批
号 31416）、5 000（批号 31417）、12 000（批号 31418）、
25 000（批号 31419）、50 000（批号 31420）、150 000
（批号 31422），瑞士 Fluka公司；邻苯二甲醛（OPA）、
9-芴甲基氯甲酸酯（FMOC），质量分数≥99%，Sigma
公司；17种氨基酸混合标准溶液，美国 Pierce公司，
批号 61105，其中 L-天门冬氨酸、L-谷氨酸、L-丝氨
酸、L-组氨酸、甘氨酸、L-苏氨酸、L-精氨酸、L-丙
氨酸、L-酪氨酸、L-脯氨酸、L-缬氨酸、L-蛋氨酸、
L-苯丙氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-赖氨酸浓
度为 2.5 μmol/mL；L-胱氨酸浓度为 1.25 μmol/mL；
1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），阿拉丁试剂，质
量分数≥99.0%；磷酸奥司他韦，上海罗氏制药有限
公司；二甲基亚砜（DMSO），美国 Sigma 公司；
MEM基础培养基（Minimum Essential Medium），美
国Gibco公司，批号 20140217；胎牛血清，美国Gibco
公司，批号 10099；1 mg/mL甲苯磺酰苯丙氨酸氯
甲酮处理过的胰酶（TPCK胰酶），广州捷倍斯生物
科技有限公司，批号 20140220；噻唑蓝［MTT，3-(4,5-
二甲基噻唑-2)-2］，Genebase公司。
1.3 细胞株与病毒株
狗肾细胞（MDCK）引自中国科学院典型培养
物保藏委员会细胞库。甲型 H1N1流感病毒 PR8株
（A/PR/8/34，H1N1）、甲型 H3N2 流感病毒 Aichi
株（A/Aichi/2/68，H3N2）均购自美国经典培养物
收藏中心（ATCC）；新甲型 H1N1 流感病毒株
（A/Guangzhou/GIRD07/09，H1N1，Genebank No.
HM014332.1）为临床分离株。上述毒株流感病毒通
过接种于 9日龄的鸡胚尿囊腔中扩增，35 ℃孵育 2
d，收获尿囊液。用MDCK细胞滴定病毒，以细胞
病变抑制法（CPE）[8]判定这些毒株的半数感染量
（TCID50/100 μL），作为病毒原始滴度。
2 方法与结果
2.1 粗多糖制备
准确称取板蓝根药材粉末 300 g，加入 10倍量
去离子水，回流提取 2 h，冷却，滤过，重复上述提

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取过程 2次，合并提取液，减压浓缩至料液比约 1∶
2，加入无水乙醇，使乙醇的体积分数达 50%，4 ℃
下冷藏 24 h，4 500 r/min离心 10 min，收集沉淀，
冷冻干燥。重复上述醇沉过程，使上清液中乙醇的
体积分数依次达 60%、70%、80%、90%，最终得
到不同体积分数乙醇的醇沉粗多糖。分级醇沉板蓝
根粗多糖的性状及产率见表 1。

表 1 分级醇沉板蓝根粗多糖性状及产率
Table 1 Characteristic and productivity of crude polysaccharides
precipitated by ethanol at different concentration
醇沉样 颜色 溶解性 产率/%
50%乙醇 灰白色粉末 难溶于水 18.0
60%乙醇 浅褐色粉末 溶于水，少许浑浊 0.4
70%乙醇 褐色粉末 易溶于水 3.4
80%乙醇 土黄色粉末 易溶于水 2.6
90%乙醇 淡黄色粉末 易溶于水 1.8

2.2 80%乙醇醇沉板蓝根粗多糖抗病毒活性
2.2.1 药物毒性实验（MTT 法） 按每孔约 2.5×
104 MDCK细胞接种到 96孔板，24 h后待细胞长成
单层后，弃去培养液，加入不同稀释度的药物 100
μL/孔，空白对照和正常细胞对照孔加入 100 μL/孔
MEM，37 ℃、5% CO2继续培养 36～48 h，每孔加
MTT液（5 mg/mL）20 μL，置 37 ℃、5% CO2温
箱中继续孵育 4 h。吸弃培养上清液，每孔加 100 μL
DMSO，低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。选
择 490 nm 波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔吸
光度（A）值，计算抑制率，并用 Reed-Muench 法
计算药物的半数有毒浓度（TC50），抑制率＝(正常
组平均 A值－给药组平均 A值)/(正常组平均 A值－
空白组平均 A值)。结果显示MTT法体外检测板蓝
根多糖的 TC50＞40 mg/mL。
2.2.2 板蓝根多糖体外抗流感病毒活性实验 在治
疗作用模式下，以细胞病变抑制法（cytopathic effect
reduction method）研究板蓝根多糖对流感病毒的抑
制作用。长满单层的 96 孔细胞培养板内的 MDCK
细胞吸附病毒 2 h，同时设定阳性药物（磷酸奥司他
韦）和细胞对照，然后加入含不同质量浓度（40、
20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2 mg/mL）
药物的培养液，置 34 ℃、5% CO2环境下培养 48 h。
细胞出现病变程度按以下 6级标准记录：“−”
为细胞生长正常，无病变出现；“±”为细胞病变少
于整个单层细胞的 10%；“＋”为细胞病变约占整
个单层细胞的 25%；“＋＋”为细胞病变约占整个
单层细胞的 50%；“＋＋＋”为细胞病变约占整个
单层细胞的 75%：“＋＋＋＋”为细胞病变约占整
个单层细胞的 75%以上。用 Reed-Muench法计算半
数抑制浓度（IC50），并以选择指数（SI）表示（SI＝
TC50/IC50），SI＞2表示低毒高效；SI＝1～2表示高
毒低效；SI＜1 表示无效。结果显示板蓝根多糖对
多种亚型的甲型流感病毒有体外抑制作用，见表 2。

表 2 板蓝根 80%醇沉粗多糖体外对多种甲型流感病毒药
效作用
Table 2 Pharmacodynamics of crude polysaccharides precipitated
by 80% ethanol on different influenza a virus in vitro
样品 考察指标 H1N1 (PR8) H1N1 (2009pdm) H3N2 (Aichi)
板蓝根 TC50/(mg·mL−1) ＞40 ＞40 ＞40
多糖 IC50/(mg·mL−1) 20.48 8.47 4.35
SI ＞1.95 ＞4.72 ＞9.19
磷酸奥司 TC50/(mg·mL−1) ＞0.312 ＞0.312 ＞0.312
他韦 IC50/(μg∙mL−1) 0.238 0.194 13.800
SI ＞1 000 ＞1 000 ＞100

2.3 DEAE-Sepharose Fast Flow柱色谱分离
取 80%乙醇醇沉板蓝根粗多糖样品 1.0 g，用纯
水溶解后上 DEAE-Sepharose Fast Flow色谱柱，依
次以纯水及 0.1、0.5 mol/L NaCl溶液进行洗脱，自动
部分收集器收集馏份，7.5 mL/管。分别用苯酚-硫酸
法[9]与紫外分光光度法（λ＝280 nm）对每管洗脱液
中的糖质量浓度和氨基酸质量浓度进行跟踪检测。
苯酚-硫酸法测定的标准曲线为 A＝15.2 C－0.030 9，
相关系数为 r＝0.997，其中 A为吸光度值，C为葡
萄糖质量浓度（mg/mL）。以洗脱管数为横坐标，糖
质量浓度与 280 nm处的 A为纵坐标绘制洗脱曲线，
如图 1所示。将图 1中的水及 0.1、0.5 mol/L NaCl
洗脱部分分别合并，减压浓缩至一定体积后，转移
至透析袋中透析 48 h，样品减压浓缩，冷冻干燥，
得 3个粗多糖亚组分，反复冻溶除去游离蛋白，分
别命名为 IRPS1、IRPS2、IRPS3，得率（得率＝冻干
粗多糖质量/上样质量）分别为 5.4%、2.7%、2.0%。
2.4 葡聚糖凝胶柱色谱与 HPLC纯化
取 IRPS1 50 mg，水溶解后，上 Sephacryl-200
聚丙烯胺葡聚糖凝胶柱。以水作为洗脱剂，自动部
分收集器收集洗脱馏份，每管 3 mL，采用苯酚-硫
酸法和凝胶色谱-蒸发光散射检测器（GPC-ELSD，
分析条件参见“2.5.1”）进行监测，以糖质量浓度为
纵坐标，洗脱管数为横坐标，绘制洗脱曲线见图 2。
由图 2可以看出，亚组分 IRPS1经过 Sephacryl-

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实线为多糖质量浓度曲线，虚线为 280 nm紫外吸收曲线，上方为多糖质量浓度曲线的局部放大图
Solid line is sugar concentration curve. Dotted line is curve of UV absorption at 280 nm. Curves above
picture is a partially enlarged view of sugar concentration curve

图 1 80%乙醇醇沉粗多糖的 DEAE-Sepharose Fast Flow洗脱曲线
Fig. 1 Elution curve of crude polysaccharides precipitated by 80% ethanol on DEAE-Sepharose Fast Flow




图 2 IRPS1的 Sephacryl-200洗脱曲线
Fig. 2 Elution curve of IRPS1A on Sephacryl-200

200 柱色谱分离纯化后，不同 MW的多糖之间仍无
法达到完全分离。分别合并 18～25管及 22～26管
溶液进行凝胶色谱测定，发现色谱峰不完全对称。为
了得到质量分数更高的均一多糖，对 2组合并液再
用高效凝胶色谱法进行进一步纯化。以超纯水作为
流动相，体积流量 0.6 mL/min，色谱柱为TSK-G3000
PWXL 柱，收集不同时间段的流出物，减压浓缩，
冷冻干燥，得板蓝根均一多糖 IRPS1A和 IRPS1B，
产率（产率＝冻干均一多糖质量/上样质量）分别为
23.5%和 20.7%。其凝胶色谱图分别见图 3-A、B。
称取 IRPS2或 IRPS3 50 mg，用 0.15 mol/L NaCl
溶液溶解后，上 Sephacryl-200聚丙烯胺葡聚糖凝胶
柱。以 0.15 mol/L NaCl溶液作为洗脱剂，自动部分
收集器收集洗脱馏份，每管约 3 mL，透析 48 h除
盐后，采用 GPC-ELSD进行检测，合并 MW相同馏
份，减压浓缩，冷冻干燥，即得板蓝根均一糖蛋白
IRPS2A和 IRPS3A，产率（产率＝冻干均一糖蛋白
质量/上样质量）分别为 5.7%和 19.8%。其凝胶色谱
图分别见图 3-C、D。
2.5 板蓝根多糖（糖蛋白）的MW测定[10]
用凝胶过滤色谱法结合 ELSD检测器测定多糖
组分的 MW及其分布。
2.5.1 色谱分析条件 色谱柱为TSK-G3000PW柱；
流动相为 4 mmol/L 甲酸铵水溶液；体积流量 0.6



图 3 IRPS1A (A)、IRPS1B (B)、IRPS2A (C) 与 IRPS3A (D) 的 GPC-ELSD色谱图
Fig. 3 GPC-ELSD chromatogrms of IRPS1A (A), IRPS1B (B), IRPS2A (C), and IRPS3A (D)
2.5


2.0


1.5


1.0


0.5


0.0
糖
质
量
浓
度
/(m
g·
m
L−
1 )
4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0
A
值

0.04

0.02

0.00 糖
质
量
浓
度
/
(m
g·
m
L−
1 )
0.1 mol/L NaCl
0.5 mol/L NaCl
0.1 mol/L NaCl
IRPS2
0.5 mol/L NaCl
IRPS3
H2O
IRPS1
70 105 140
管数
0 20 40 60 80 100 120 140 160
管数
0.6

0.4

0.2

0.0
糖
质
量
浓
度
/(m
g·
m
L−
1 )
0 10 20 30 40
管数
0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20
t/min
A B C D

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mL/min；进样量 10 μL；ELSD检测温度 50 ℃；气
体体积流量 1.6 L/min。
2.5.2 对照品溶液的配制 分别精密称取 MW为
1 000、5 000、12 000、25 000、50 000、150 000的葡
聚糖，配制成质量浓度为 10 mg/mL的对照品水溶液。
2.5.3 MW的测定 以标准葡聚糖的保留时间（t）为
横坐标，MW对数值 lgMW为纵坐标，绘制得到标准
曲线的回归方程为 lgMW＝10.038－0.496 4 t，相关系
数 r＝0.996。将图 3 中 IRPS1A、IRPS1B、IRPS2A
与 IRPS3A的 t代入回归方程中，计算得到 4种均一
多糖的MW分别为 18 000、31 000、36 000和 82 000。
2.6 板蓝根糖蛋白的氨基酸组成测定
2.6.1 色谱分析条件与方法 色谱柱为 Zorbax
Eclipse-AAA柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动
相 A为 40 mmol/L Na2HPO4，用 NaOH溶液调 pH
至 7.8，流动相 B为乙腈-甲醇-水（45∶45∶10），
梯度洗脱：0.0～1.9 min，2.0% B；1.9～25.0 min，
2.0%～23.7% B；25.0～25.3 min，23.7%～34.9% B；
25.3～45.6 min，34.9%～57.0% B；45.6～46.1 min，
57.0%～100% B；46.1～49.8 min，100% B；49.8～
51.7 min，100%～2.0% B；51.7～53.0 min，2.0% B；
体积流量 1.0 mL/min；柱温 40 ℃；检测波长 338、
262 nm。OPA溶液的配制方法：10 mg OPA溶于 1
mL溶液（0.16 mL甲醇＋0.14 mL硼酸缓冲液＋0.69
mL纯水＋0.01 mL 3-巯基丙酸）。硼酸缓冲液的配
制方法：首先配制 0.1 mol/L硼酸溶液，用 0.4 mol/L
的NaOH调节 pH至 10.0。FMOC溶液的配制：10 mg
FMOC溶于 1 mL乙腈。氨基酸的柱前在线衍生化
在高效液相色谱仪自动进样器的定量环中进行。自
动衍生程序：抽取硼酸盐缓冲液 2.5 μL；抽取样品
1.0 μL；混合 5次；等待 0.2 min；抽取 OPA溶液
1.0 μL；混合 10次；抽取 FMOC溶液 1.0 μL，抽取
纯水 32 μL，等待 0.3 min，进样。
2.6.2 供试品溶液的制备和氨基酸组成测定 参考
文献方法[11-13]对板蓝根糖蛋白 IRPS2A 与 IRPS3A
进行酸水解和氨基酸组成测定。水解时间为 17 h，
水解温度为 104 ℃，盐酸浓度为 10 mol/L。取 1 mL
水解液，氮吹至干，加入 100 μL纯水复溶，按“2.6.1”
项方法进行柱前衍生化 HPLC分析。
16 种一级氨基酸标样和 IRPS2A、IRPS3A 的
OPA衍生化产物色谱图见图 4，样品中未检测出二
级氨基酸脯氨酸。通过单点校正计算得 IRPS2A 的
氨基酸组成（各氨基酸的物质的量之比）为天门冬氨
酸-谷氨酸-丝氨酸-组氨酸-甘氨酸-苏氨酸-精氨酸-
丙氨酸-酪氨酸-胱氨酸-缬氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-
亮氨酸-赖氨酸（5.1∶7.2∶5.6∶1.4∶7.7∶3.1∶
3.5∶4.8∶1.0∶1.8∶4.6∶1.1∶3.2∶2.0∶1.6）。
IRPS3A 的氨基酸组成为天门冬氨酸-谷氨酸-丝氨
酸-组氨酸-甘氨酸-苏氨酸-精氨酸-丙氨酸-胱氨酸-
缬氨酸-苯丙氨酸-异亮氨酸-亮氨酸-赖氨酸（5.2∶





1-L-天门冬氨酸 2-L-谷氨酸 3-L-丝氨酸 4-L-组氨酸 5-甘氨酸 6-L-苏氨酸 7-L-精氨酸 8-L-丙氨酸 9-L-酪氨酸 10-L-胱氨酸
11-L-缬氨酸 12-L-蛋氨酸 13-L-苯丙氨酸 14-L-异亮氨酸 15-L-亮氨酸 16-L-赖氨酸
1-L-aspartic acid 2-L-glutamic acid 3-L-serine 4-L-histidine 5-glycine 6-L-threonine 7-L-arginine 8-L-alanine 9-L-tyrosine
10-L-gysteine 11-L-valine 12-L-methionine 13-L-phenylalanine 14-L-isoleucine 15-L-leucine 16-L-lysine
图 4 16种一级氨基酸标样 (A) 和 IRPS2A (B)、IRPS3A (C) 的 OPA衍生化产物色谱图
Fig. 4 OPA derivatives chromatograms of 16 kinds of amino acids reference solution (A), IRPS2A (B), and IRPS3A (C)
2
1
3
4
5
6
7
9 8
11
16
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12 13
10
10
A
13
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B
10
11
1
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3
4
5
6
7 8
9
13
14 15 16 11
C
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5
6 8
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6.8∶3.3∶1.6∶8.6∶3.7∶19.6∶4.0∶1.5∶3.0∶
1.0∶1.3∶2.7∶2.3）。
2.7 板蓝根多糖的单糖组成测定[14-15]
2.7.1 色谱分析条件 色谱柱为 Inertsil®ODS-3 柱
（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为 0.1 mol/L磷
酸盐缓冲液（pH 6.68）-乙腈（83∶17），等度洗脱；
柱温 30 ℃；检测波长 250 nm；体积流量 1.0
mL/min；进样体积 20 μL。
2.7.2 对照品溶液的制备 利用 PMP 柱前衍生化
法对板蓝根多糖的单糖组成进行测定。取 1 mL单
糖混合对照品溶液（葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉
伯糖、半乳糖、半乳糖醛酸、鼠李糖），加入 1 mL 0.6
moL/L NaOH溶液，置于 10 mL的具塞试管中混合
均匀；加入 1 mL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液，混匀后，
置于 70 ℃烘箱中加热反应 60 min，取出，室温放
置 10 min；再加入 l mL 0.3 mol/L盐酸溶液中和。
加 3 mL三氯甲烷，振摇，静置，弃去三氯甲烷相，
萃取 3次。水相用 0.45 μm微孔膜滤过后进行HPLC
分析。配制不同质量浓度的混标溶液，以质量浓度
（C，mg/mL）为横坐标，峰面积（A）为纵坐标，绘
制标准曲线，结果各单糖的标准曲线分别为甘露糖
A＝29 353 C－9.57，r＝0.999 4；鼠李糖 A＝25 107
C＋11.02，r＝0.999 2；半乳糖醛酸 A＝30 842 C－
346.57，r＝0.996 3；葡萄糖 A＝24 914 C－98.65，
r＝0.999 1；半乳糖 A＝31 183 C－58.89，r＝0.999 3；
木糖 A＝31 075 C－62.47，r＝0.999 5；阿拉伯糖
A＝35 545 C－84.34，r＝0.999 6。
2.7.3 供试品溶液的制备和单糖组成测定 分别称
取适量的 IRPS1A、IRPS1B、IRPS2A与 IRPS3A于
5 mL安瓿中，加入 1 mL水溶解，再加入 2 mL 2
mol/L的硫酸溶液，封管，110 ℃烘箱中水解 8 h，
冷却至室温，加入 8 mol/L NaOH溶液，调节 pH值
约为 7。取 1 mL水解液于 10 mL试管中，按“2.7.2”
项方法进行衍生化和测定。单糖混合对照品溶液与
水解产物 IRPS1A、IRPS1B、IRPS2A、IRPS3A 的
PMP 衍生色谱图见图 5。经计算，IRPS1A 单糖组
成主要为甘露糖-葡萄糖-半乳糖-阿拉伯糖（2.9∶
4.8∶1.0∶23.4）；IRPS1B 单糖组成为甘露糖-葡萄
糖 -半乳糖 -阿拉伯糖（1.0∶3.8∶3.0∶24.5）；
IRPS2A 单糖组成为半乳糖醛酸-葡萄糖-半乳糖-阿
拉伯糖（12.6∶27.1∶1.9∶1.0）；IRPS3A单糖组成
为甘露糖-鼠李糖-半乳糖醛酸-葡萄糖-半乳糖-阿拉
伯糖（2.2∶1.0∶1.6∶13.5∶2.3∶4.7）。







1-甘露糖 2-鼠李糖 3-半乳糖醛酸 4-葡萄糖 5-半乳糖
6-木糖 7-阿拉伯糖
1-mannose 2-rhamnose 3-galacturonic acid 4-glucose
5-galactose 6-xylose 7-arabinose
图 5 单糖混合对照品 (A) 与 IRPS1A (B)、IRPS1B (C)、
IRPS2A (D)、IRPS3A (E) 水解产物的 PMP衍生色谱图
Fig. 5 PMP derivative HPLC of mixed reference substances
of monosaccharide (A), IRPS1A (B), IRPS1B (C), IRPS2A
(D), and IRPS3A (E)
3 讨论
板蓝根的抗病毒作用在临床上已被证实[16-17]，
多糖作为板蓝根入药部位的主要化学物质，其抗病
毒的活性及作用机制亦受到广泛关注。然而，板蓝
根多糖是组成复杂的混合物，其分离纯化一直是抗
病毒活性及机制研究的瓶颈问题。本实验采用系统
分离的研究思路，首先将板蓝根药材水提物进行分
级醇沉，选择具有较强抗病毒活性的 80%乙醇醇沉
粗多糖作为分离对象，以降低后续分离纯化的难度。
再通过快速离子交换柱色谱，将不带电荷或者带有
极少数电荷的多糖成分与带有大量电荷的糖蛋白成
分进行初步分离，得到 3 个亚组分 IRPA1、IRPS2
与 IRPS3。最后，利用快速凝胶色谱柱对各亚组分
进行进一步的分离纯化。对于 MW接近、但均一性
不够的混合部位，则采用分辨率更高的高效凝胶色
谱法进一步纯化，最终得到 4种均一多糖（糖蛋白）
IRPS1A、IRPS1B、IRPS2A、IRPS3A。该系统分离
纯化的研究策略也可运用于其他复杂中药多糖的高
效制备。
1
2 3 4 5 6 7
1 4
7
7
5
1 4 5
3
4
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7 5
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B
C
E
D
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t/min

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在板蓝根多糖的分离纯化过程中，分离过程的
监控十分重要。本实验选用苯酚-硫酸法、紫外分光
光度法和高效凝胶色谱法等多种方法进行过程跟
踪，可以同时兼顾糖量较高的多糖组分和氨基酸量
较高的糖蛋白组分，还可以依据 MW的差异进行馏
份的切割和合并，从而有效避免单一监测方法的缺
陷，提高系统分离的效率和目标产物的均一性。
本实验是在前期研究的基础上[10]，选择最优条
件对板蓝根多糖进行水解，而后利用柱前衍生化的
方法对多糖中的氨基酸残基进行分析。结果表明，
IRPS2A含有以甘氨酸为主的 15种氨基酸，IRPS3A
中包含以精氨酸为主的 14种氨基酸，且质量分数较
高，故 IRPS2A和 IRPS3A为板蓝根均一糖蛋白。2
种糖蛋白中均未检测出二级氨基酸，所含有的一级
氨基酸种类丰富且大致相同。研究过程中还对
IRPS1A、IRPS1B 的氨基酸残基进行了测定，结果
表明 IRPS1A、IRPS1B的氨基酸残基总量极低，可
能由少量杂质引入，因此 IRPS1A、IRPS1B为板蓝
根均一多糖。
板蓝根多糖的组成分析已有少量文献报道，马
莉等[18]从 60%乙醇醇沉板蓝根粗多糖中分离得到 4
种均由单一木糖组成、MW 不同的均一多糖。张体
祥等[19]分离得到 1种 MW为 2.24×105，由鼠李糖、
果糖、葡萄糖、半乳糖组成的板蓝根均一多糖。陈
浩然等[20]从 70%乙醇醇沉板蓝根粗多糖分离得到
一种 MW为 11 700的均一板蓝根多糖 A，其单糖组
成为阿拉伯糖和半乳糖。本实验主要研究 80%乙醇
醇沉板蓝根粗多糖，分离得到的 4种均一多糖（糖
蛋白）MW为 1.8×104～8.2×104，IRPS1A与 IRPS1B
主要由阿拉伯糖残基构成，同时还含有少量的甘露
糖、葡萄糖和半乳糖，糖组成与文献报道[20]相近。
板蓝根糖蛋白 IRPS2A、IRPS3A中，单糖组成以葡
萄糖为主，还含有少量半乳糖醛酸、半乳糖和阿拉
伯糖等。
参考文献
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