全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月

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猪苓多糖通过 HuR调节 Cyclin D1表达抑制 A549细胞增殖
沈 耿 1, 2，徐 谦 2，曾 星 1*
1. 广州中医药大学第二临床医学院，广东 广州 510000
2. 广中医药大学基础医学院，广东 广州 510000
摘 要：目的 研究猪苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）抑制肺癌A549细胞增殖的作用及其机制。方法 设对照组和 PPS
低、中、高剂量组，用 MTT实验、流式细胞术检测 PPS对细胞增殖的影响，用实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）法检测 PPS对
A549细胞 Cyclin D1 mRNA表达水平及其稳定性的影响，用Western blotting检测 PPS对A549细胞 Cyclin D1蛋白、人抗原 R
（human antigen R，HuR）蛋白表达及对HuR蛋白胞浆及胞核内分布的影响。结果 与对照组比较，中、高剂量的 PPS作用后，
A549细胞增殖明显受到抑制（P＜0.05），Cyclin D1 mRNA稳定性降低（P＜0.05），Cyclin D1 mRNA及蛋白表达减少（P＜0.05），
HuR总蛋白没有明显变化，但胞浆HuR蛋白表达下降（P＜0.05），胞核HuR蛋白表达升高（P＜0.05）。结论 PPS可抑制A549
细胞增殖，其作用机制可能与改变HuR在细胞内定位，从而降低 Cyclin D1 mRNA稳定性及 Cyclin D1蛋白表达有关。
关键词：猪苓多糖；人抗原 R；肺癌；细胞周期蛋白 D1；细胞增殖
中图分类号：R285.5 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2016)06 - 0944 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.06.015
Inhibition of polyporus polysaccharide on proliferation of A549 cells by adjusting
Cyclin D1 expression by HuR
SHEN Geng1, 2, XU Qian2, ZENG Xing1
1. Second Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, China
2. College of Basic Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510000, China
Abstract: Objective To study the effects of polyporus polysaccharide (PPS) on the proliferation of human lung cancer A549 cells
and the corresponding molecular mechanism. Methods The A549 cells in control group were normally treated and the cells in
experimental groups were incubated with different doses of PPS. The MTT method and flow cytometry were used to analyze the
influence of drugs on cell proliferation. The qRT-PCR was used to detect mRNA levels of A549 cells and Cyclin D1 mRNA stability.
The levels of human antigen R (HuR) protein in plasma and nuclei and cyclin D1 protein were detected by Western blotting. Results
Compared with the control, the cell growth was obviously inhibited (P < 0.05), the Cyclin D1 mRNA stability and Cyclin D1 mRNA
were decreased in the mid- and high-dose PPS groups (P < 0.05), the total protein of HuR was slightly changed, but the cytoplasm
protein of HuR was down-regulated (P < 0.05) and the nucleus protein of HuR was up-regulated (P < 0.05). Conclusion PPS can
suppress the proliferation of A549 cells, which is possibly affected by down-regulating the cytoplasm protein of HuR, lowering the
stability of Cyclin D1 mRNA, and thus decreasing the expression of Cyclin D1 protein.
Key words: polyporus polysaccharide; human antigen R; lung cancer; Cyclin D1; cell proliferation

肺癌为临床常见肿瘤，也是引起肿瘤患者死亡
的常见原因。肺癌患者在确诊时很多已属晚期，能
手术的病例较少，往往以放疗及化疗为主，预后较
差，约 80%病人在诊断后 1年内死亡[1]，中晚期肺癌
的治疗目前主张多方法综合治疗。中西医结合及中
医药治疗肺癌，已显示其在减少毒副反应、改善症
状、稳定病灶、提高生存质量、延长生存期和提高
生存率等方面优势[2]。目前，中医对肺癌病因病机的

收稿日期：2015-11-20
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81573769）；广东省自然科学基金资助项目（2014A030313415）；广东省中医药管理局立项课题资助
（20151193）；广州中医药大学基础医学院院长基金资助
作者简介：沈 耿，男，在读博士，讲师，研究方向为中医药抗肿瘤。E-mail: shengeng2006@163.com
*通信作者 曾 星，女，博士生导师，研究员，研究方向为中医药抗肿瘤的分子机制。E-mail: zengxing-china@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 47卷 第 6期 2016年 3月

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认识有“正气虚损学说”“邪毒侵肺论”“痰湿内聚
论”3种学说。临床采用扶正培本和清热解毒，软坚
化痰，活血化瘀酌情伍用治法，取得了较好的疗效[2]。
在众多治疗肺癌的复方中，猪苓为常用药物[3-4]。
猪苓多糖（polyporus polysaccharide，PPS）为猪苓
的主要成分，现代药理研究表明，PPS具有增强免
疫、抗肿瘤等多种功能[5]，体内外实验均表明，PPS
对肺癌细胞有抑制作用[6]，但其作用机制尚不清楚。
本实验拟观察 PPS对肺癌 A549细胞增殖的作用，
并初步探讨其相关的分子生物学机制。
1 材料
1.1 细胞株
肺癌 A549细胞株购自中山大学生物细胞库。
1.2 药品和试剂
PPS 购自南京泽朗生物科技有限公司，质量分数
为 95%，批号为 ZL2015050651。胎牛血清、RPMI 1640
培养基、0.25%胰酶-EDTA 消化液均购自美国 Gibco
公司；实时荧光定量 PCR（qRT-PCR）试剂盒、逆转
录试剂盒、蛋白酶抑制剂、RIPA 缓冲液均购自德国
Roche公司，噻唑蓝（MTT）购自美国 Sigma公司，
兔抗人Cyclin D1抗体、兔抗人人抗原R（HuR）抗体、
兔抗人 β-actin抗体、兔抗人 α-tubulin抗体、Lanin B1
抗体、HRP 标记抗兔抗体均购自美国 CST 公司；
Western blotting所用试剂购自美国Bio-Rad公司。
1.3 仪器
酶标仪，美国 Perkin Elmer公司；FC500流式
细胞仪，美国 Beckman Coulter 公司；电泳及转印
系统、凝胶成像系统，美国 Bio-Rad公司；7500实
时荧光定量基因扩增系统，美国 ABI公司。
2 方法
2.1 细胞培养及分组
A549 细胞常规培养在含 10%胎牛血清、100
U/mL青霉素和 100 U/mL链霉素的 RPMI 1640培
养液中，置 37 ℃、5% CO2培养箱中培养。实验分
4 组，对照组（正常培养的细胞，未做任何处理）
和 PPS低、中、高剂量（50、100、200 μg/mL）组。
2.2 MTT法检测细胞增殖
取对数生长期 A549 细胞，用培养基制成单细
胞悬液，调整细胞浓度为 3×104/mL，接种于 96孔，
每孔 100 μL，培养 24 h后，各实验组加入相应量的
药物和培养基至每孔液体总量为 20 μL，实验设 6
个复孔，继续培养 24、48、72 h后，各孔分别加入
MTT（5 mg/mL）20 μL，继续培养 4 h，弃培养上
清，每孔加入二甲基亚砜（DMSO）150 μL，震荡
待结晶溶解后酶标仪上检测 490 nm 波长下的吸光
度（A）值。
2.3 流式细胞术检测细胞周期
各组细胞常规培养 48 h后，收集细胞到离心管
中离心，应用预冷的 PBS洗涤收集的细胞 3次，离
心沉淀细胞，弃上清。以 70%预冷的乙醇重悬细胞，
吹打均匀，4 ℃储存过夜；离心乙醇固定过的细胞，
弃上清，PBS 洗涤细胞 3 次以去除残留的乙醇。应
用细胞周期检测试剂重悬细胞，常温避光染色 30
min，应用流式细胞仪测定细胞周期。计算增殖指数。
增殖指数＝(G2/M＋S)/(G0/G1＋S＋G2/M)
2.4 Western blotting法分析 Cyclin D1蛋白表达
A549 细胞接种于 6 孔板，常规培养后于对数
生长期分别加入不同质量浓度（50、100、200
μg/mL）的 PPS培养 48 h；收集细胞后用 RIPA提
取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，100 ℃变性
8 min，SDS-PAGE蛋白电泳，后将蛋白转至 PVDF
膜，室温封闭 1 h 后用一抗 4 ℃孵育过夜，TBST
缓冲液洗涤 3次，二抗室温孵育 1 h，洗涤后以 ECL
化学发光法于凝胶成像系统进行检测。
2.5 qRT-PCR法检测 Cyclin D1 mRNA水平
细胞分组及培养方法同“2.4”项；用 Trizol抽
提细胞总 RNA，按 Roch 试剂盒操作说明逆转录
cDNA。Cyclin D1上游引物：5’-GGGCAGCAGAA-
GCGAGAG-3’，下游引物：5’-GTTCCTCGCAG-
ACCTCCAG-3’。以 β-actin为内参，其上游引物：
5’-GTGGGGTGGCTTTTAGGATGG-3’，下游引物：
5’-TCACAATGTGGCCGAGGACTTT-3’。qRT-PCR
扩增条件为：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s，60 ℃、
60 s，循环 40次；扩增完毕后进行熔解曲线分析。
2.6 Cyclin D1 mRNA稳定性的检测
细胞分组及培养方法同“2.4”项；将放线菌素
D以 DMSO溶解后，加入培养基内，使放线菌素 D
的终质量浓度为 5 ng/mL，给予放线菌素 D处理后
的 0、2、4、6 h时间点分别收集细胞，提取 RNA，
以 qRT-PCR法检测 Cyclin D1的 mRNA的水平，设
定各组细胞 0 h mRNA的量为 100%，计算各组细
胞 2、4、6 h各时间点相对该组 0 h的 mRNA量的
比值，绘制各组 Cyclin D1 mRNA的降解拟合曲线，
比较各组细胞 Cyclin D1 mRNA的稳定性[5]。
2.7 胞浆、胞核中 HuR蛋白表达的检测
各实验组细胞经不同质量浓度（50、100、200
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μg/mL）PPS处理 24 h后，弃去培养基，以预冷的
PBS缓冲液清洗细胞 2次。以细胞刮收集细胞至离
心管，离心，弃上清，按胞核-胞浆蛋白提取试剂盒
说明分别提取胞浆蛋白和胞核蛋白。用 Western
blotting法检测总的、胞浆和胞核 HuR蛋白的表达，
具体操作方法同“2.4”项。
2.8 统计学方法
用 SPSS 17.0软件进行统计分析，计量资料用
±x s表示，组间比较采用单因素方差分析；对于各
组细胞 Cyclin D1 mRNA稳定性比较，采用重复测
量资料的方差分析。
3 结果
3.1 PPS对 A549细胞增殖的抑制作用
A549细胞在不同质量浓度 PPS分别作用 24、
48、72 h后，用MTT检测 A549细胞的增殖，与对
照组相比，50 μg/mL PPS组与对照组测得的 A值在
各个时间点上均没有显著差异（P＞0.05），100、200
μg/mL PPS组在 24、48、72 h各时间点均能明显抑
制 A549细胞的增殖（P＜0.05）。结果见图 1。


与对照组比较：*P＜0.05，下同
*P < 0.05 vs control group, same as below
图 1 PPS对 A549细胞增殖的影响 ( ±x s , n = 6)
Fig. 1 Effect of PPS on proliferation of A549 cells ( ±x s , n = 6)
3.2 PPS对 A549细胞增殖指数的影响
细胞在不同质量浓度 PPS分别作用 48 h后，流
式细胞仪检测显示，中、高剂量 PPS组 A549细胞
的增殖指数降低（P＜0.05）。结果见图 2。
3.3 PPS对A549细胞Cyclin D1 mRNA表达的影响
qRT-PCR 检测显示，与对照组比较，不同质
量浓度 PPS作用于 A549细胞 48 h后，PPS低剂
量组与对照组 Cyclin D1 mRNA表达无显著差异，
PPS中、高剂量组 Cyclin D1 mRNA表达明显减少
（P＜0.05）。结果见图 3。



图 2 PPS对 A549细胞增殖指数的影响 ( ±x s , n = 3)
Fig. 2 Effect of PPS on proliferation index of A549 cells
( ±x s , n = 3)



图 3 PPS 对 A549 细胞 Cyclin D1 mRNA 表达的影响
( ±x s , n = 3)
Fig. 3 Effect of PPS on expression of Cyclin D1 mRNA in
A549 cells ( ±x s , n = 3)
3.4 PPS对 A549细胞 Cyclin D1蛋白表达的影响
Western blotting检测显示，与对照组比较，不
同质量浓度 PPS 作用于 A549 细胞 48 h 后，PPS
低剂量组与对照组 Cyclin D1蛋白表达没有显著差
异，PPS中、高剂量组 Cyclin D1蛋白表达明显减
少（P＜0.05）。结果见图 4。



图4 PPS对A549细胞Cyclin D1蛋白表达的影响 ( ±x s , n = 3)
Fig. 4 Effect of PPS on expression of Cyclin D1 protein in
A549 cells ( ±x s , n = 3)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
A 4
90


对照
PPS 50 μg·mL−1
PPS 100 μg·mL−1
PPS 200 μg·mL−1
对照 24 h 48 h 72 h
*
*
*
*
*
*

增
殖
指
数
/%

60
40
20
0


对照 50 100 200
PPS/(μg·mL−1)

*
*
C
yc
lin
D
1
m
RN
A
相
对
量

1.5


1.0


0.5


0.0
对照 50 100 200 PPS/(μg·mL−1)

* *
β-actin

Cyclin D1
34 000

42 000

Cy
cl
in
D
1
蛋
白
相
对
量

对照 50 100 200
PPS/(μg·mL−1)

1.5

1.0

0.5

0.0


*
*
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3.5 PPS对A549细胞Cyclin D1 mRNA稳定性的影响
分别于放线菌素 D处理 0、2、4、6 h检测 Cyclin
D1 mRNA的量，绘制衰减曲线（图 5），与对照组
比较，PPS低剂量组与对照组 Cyclin D1 mRNA稳
定性没有明显差别，PPS 中、高剂量组 Cyclin D1
mRNA稳定性明显下降（P＜0.05）。
3.6 PPS促进 HuR由胞核向胞浆转移
不同质量浓度 PPS作用于A549细胞 48 h后，
各组细胞总 HuR蛋白比较，差异不显著（P＞0.05）；
与对照组比较，50 μg/mL PPS组胞浆HuR蛋白无明
显变化，100、200 μg/mL PPS组胞浆HuR蛋白表达
明显减少（P＜0.05）；与对照组比较，50 μg/mL PPS
组胞核HuR蛋白无明显变化，100、200 μg/mL PPS
组胞核HuR蛋白表达明显增加（P＜0.05），见图 6。



图 5 PPS 对 A549 细胞 Cyclin D1 mRNA 稳定性的影响
( ±x s , n = 3)
Fig. 5 Effect of PPS on stability of Cyclin D1 mRNA in
A549 cells ( ±x s , n = 3)



图 6 PPS对 A549细胞 HuR蛋白亚细胞定位的影响 ( ±x s , n = 3)
Fig. 6 Effect of PPS on subcellular distribution of HuR protein in A549 cells ( ±x s , n = 3)
4 讨论
细胞增殖是由于细胞生长和细胞分裂而导致
细胞数目的增加，真核细胞的细胞周期分为间期和
分裂期，间期又分为 G1期、S 期、G2期。本实验
通过MTT研究显示，PPS可抑制A549细胞的增殖；
流式细胞周期分析也显示 PPS可抑制 A549细胞的
增殖指数，中、高剂量 PPS 组细胞 G1期比例明显
升高（P＜0.05），而 G2期和 S期细胞比例明显降低
（P＜0.05），增殖指数明显下降（P＜0.05），提示
PPS可抑制 A549细胞 G1期向 S期转换。
在真核细胞细胞周期的调控中，Cyclin D1是调
控G1期向 S期转化的重要蛋白，能和细胞周期依赖
激酶形成蛋白复合体，最终使细胞通过G1/S控制点，
进入DNA合成的 S期。研究表明，Cyclin D1基因
是一种原癌基因，在多种肿瘤中发现了 Cyclin D1基
因表达升高，包括肺癌、乳腺癌、膀胱癌、甲状旁
腺癌等。本研究显示，中、高剂量的 PPS可降低A549
细胞 Cyclin D1 mRNA的量，也可降低 Cyclin D1蛋
白的表达。因此推测 PPS 抑制 A549 细胞增殖的作
用可能与其降低 Cyclin D1蛋白的表达有关。
mRNA 是蛋白质生物合成的模板，在真核生物
基因表达的转录后水平调控中，mRNA 稳定性起重
要作用，其机制主要通过影响 mRNA 的降解速率影
响蛋白质的翻译效率。放线菌素 D 是一种最常用的
基因转录抑制剂[6]，能嵌合于 DNA双链内与鸟嘌呤
基团结合，抑制 DNA依赖的 RNA聚合酶活力，干
扰细胞的转录，从而抑制 mRNA合成。放线菌素 D
抑制了DNA的转录为mRNA的过程，则mRNA的
水平只与mRNA的降解速度有关，此时mRNA降解
的速度可反映其稳定性。本实验研究表明，中、高剂
量PPS组细胞的Cyclin D1 mRNA的稳定性较对照组
细胞明显降低，与之相应的 Cyclin D1 mRNA的水平
及Cyclin D1蛋白表达量下降，推测PPS导致的Cyclin
D1 mRNA的稳定性下降减少了用于翻译的mRNA的
1.5


1.0


1.0


0.0
Cy
cli
n
D
1
m
RN
A
相
对
量

0 2 4 6
t/h
对照
PPS 50 μg·mL−1
PPS 100 μg·mL−1
PPS 200 μg·mL−1
*
*
*
*
*
*
H
uR
蛋
白
相
对
量

1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0

1.5

1.0

0.5

0.0

1.5

1.0

0.5
0.0
HuR

β-actin

HuR

α-Tubulin

Lamin B1

HuR

α-Tubulin

Lamin B1

36 000


42 000

36 000

52 000

68 000
对照 50 100 200
PPS/(μg·mL−1)

总 HuR蛋白
H
uR
蛋
白
相
对
量


H
uR
蛋
白
相
对
量


36 000

52 000

68 000

胞浆 HuR蛋白 胞核 HuR蛋白
对照 50 100 200
PPS/(μg·mL−1)

对照 50 100 200
PPS/(μg·mL−1)

* * * *
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模板量，最终使Cyclin D1蛋白表达水平降低。
真核生物的 RNA 转录在细胞核内完成，而翻
译合成蛋白质在胞质中完成，故合成的 mRNA需要
转运至胞质合成蛋白质，在此过程中，mRNA常受
到核酸酶的破坏而降解。在此过程中，ARE（AU-rich
element）结构很重要。ARE是位于 mRNA 3’端非
翻译区（3’-untranslated regions，3’-UTR）的一类十
分重要的顺式调控元件，常见的有 UUAUUUAUU
和 AUUUA重复序列 2种形式[7]。HuR是一个重要
的 RNA结合蛋白，与 mRNA有高度亲和性，直接
或间接结合 ARE 结构而调控 mRNA 的降解[8-10]。
HuR 可在细胞核和细胞浆之间穿梭，静息状态下
HuR多定位于核内，在细胞外信号作用下，胞浆中
HuR蛋白量增高，并通过 RNA识别基序（RRM）
与多种 mRNA 3’-UTR的 ARE结合，使 mRNA在
由胞核转运至胞浆的过程中免受核酸酶降解，从而
增加 mRNA 稳定性 [11-13]。Cyclin D1 mRNA 的
3’-UTR 含有较多的 ARE 结构，目前已发现胞浆
HuR可参与 Cyclin D1 mRNA稳定性的调控[13-15]。
本实验研究表明，PPS 作用于 A549 细胞时，
胞核内的 HuR水平升高、胞浆内 HuR水平降低，
细胞内总的 HuR 蛋白没有明显变化，故 PPS 可以
改变 HuR 在细胞内的定位。而胞浆 HuR 水平对
Cyclin D1 mRNA稳定性起重要作用，本实验中，
PPS作用后 A549细胞胞浆 HuR水平下降，Cyclin
D1 mRNA 的稳定性也下降，提示二者之间的相关
性，即在 PPS作用后，Cyclin D1 mRNA的稳定性
下降可能是由于胞浆 HuR 水平的下降引起。而
Cyclin D1 mRNA的稳定性下降最终导致 Cyclin D1
蛋白的表达量下降及细胞增殖的抑制。
综上所述，本研究结果证实 PPS可以抑制A549
细胞的增殖，此作用可能是因为 PPS 减少 HuR 在
A549细胞胞浆内表达，降低 Cyclin D1 mRNA的稳
定性和 Cyclin D1蛋白表达而引起。然而，mRNA的
稳定性受到多种因素的调节，要想肯定 PPS 通过改
变HuR在细胞内定位而降低 Cyclin D1 mRNA的稳
定性之间的相关性，还需要通过免疫共沉淀等方法
确定其二者之间的关系，本课题组将继续深入研究。
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