全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 10 期 2013 年 5 月

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• 药材与资源 •
不同种质来源孩儿参的 rDNA ITS 区序列分析及鉴别
易 骏 1，廖芳平 2，郑伟文 3*
1. 福建教育学院 理科部，福建 福州 350001
2. 福建中西医结合研究院，福建 福州 350122
3. 福建省农业科学院生物技术研究所，福建 福州 350003
摘 要：目的 通过分析不同种质来源孩儿参 ITS 序列，为孩儿参种内鉴别提供 DNA 分子标记。方法 利用特异性引物进
行 PCR 扩增、克隆和测序，对孩儿参的 rDNA ITS 区间碱基序列进行测定，比较其差异。结果 参试的 9 个不同种质来源
孩儿参的整个 ITS 长度变异为 623～624 bp；其中 ITS1 为 224 bp，G＋C 量为 52.91%～54.26%；5.8 SrDNA 为 155 bp，G＋
C 量为 54.49%～55.13%；ITS2 为 244～245 bp，G＋C 量为 55.55%～56.41%。整个 ITS 区共有 17 个变异位点（2.72%），ITS1、
ITS2 和 5.8S 的变异位点分别为 7、7 和 3 个，不同种质来源孩儿参均有若干个特异性的单核苷酸变异位点；各样品的序列
同源性均在 99.9%以上；序列间的遗传距离为 0.003～0.013。显示了不同产地、不同种质孩儿参的变异是不超过 1 个种的范
围内的变异。结论 可利用 ITS 区序列差异，鉴别不同种质来源的孩儿参。
关键词：分子鉴定；孩儿参；ITS 序列；序列分析；种质鉴别
中图分类号：R282.12 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)10 - 1318 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.10.022
Identification of Pseudostellaria heterophylla from different idioplasms
by analysis of rDNA ITS sequences
YI Jun1, LIAO Fang-ping2, ZHENG Wei-wen3
1. Department of Science, Fujian Institute of Education, Fuzhou 350001, China
2. Fujian Academy of Integrative Medicine, Fuzhou 350122, China
3. Biotechnology Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003, China
Abstract: Objective To provide the DNA molecular marker for the identification of Pseudostellaria heterophylla from the different
idioplasms by analysis of rDNA ITS sequences. Methods PCR amplification, cloning, and sequencing were carried out using
specified primer, and the rDNA ITS base sequences were compared. Results The ITS mutation extension was 623—624 pb among
nine idioplasms of P. heterophylla. Thereinto, the ITS-1 was 224 pb and its G + C content was 52.91%—54.26%, the 5.8S rDNA was
155 bp and its G + C content was 54.49%—55.13%, the ITS-2 was 244—245 bp and its G + C content was 55.55%—56.41%. There
were 17 mutation sites (2.72%) in the whole ITS sequences. There were 7, 7, and 3 mutation sites in ITS1, ITS2, and 5.8S, respectively.
The different idioplasms had a number of specific single nucleotide mutation sites. Their homologies with each other were upwards
99.9% and their sequence genetic distances were 0.003—0.013. These results showed that the mutation in species from different
producing areas and idioplasms was within no more than one species. Conclusion The mutation of ITS sequences could be used to
authenticate P. heterophylla from different idioplasms.
Key words: molecular identification; Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et Hoffm.; ITS region; sequence analysis;
authentication of different idioplasms

孩儿参 Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax
ex Pax et Hoffm. 为石竹科（Caryophyllaceae）异叶
假繁缕属 Pseudostellaria Pax 植物，其干燥块根为
太子参，是中医常用中药之一，具有益气健脾、生

收稿日期：2013-01-07
基金项目：福建高校服务海西建设重点项目（NO.5）
作者简介：易 骏（1966—），女，副教授，主要从事药用植物生物技术等研究。
*通信作者 郑伟文，男，研究员。E-mail: 864741148@qq.com
网络出版时间：2013-03-28 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/12.1108.R.20130328.1119.008.html
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 10 期 2013 年 5 月

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津润肺之功效，用于脾虚体倦、食欲不振、病后虚
弱、气阴不足、自汗口渴、肺燥干咳[1]。我国孩儿
参栽培历史悠久，目前已形成福建、贵州、江苏等
主要产区，2005 年福建柘荣太子参规范化生产基地
获得国家食品药品监督管理局 GAP 认证，其种质
为柘参 2 号，具有性状稳定、产量高、品质优等特
点。近年来，随着太子参价格不断攀升，孩儿参种
植面积不断扩大，其种质混乱已影响太子参的品质，
因此有必要开展不同种质来源的孩儿参鉴别研究。
目前，由于药用植物核糖体 DNA 中的内转录间隔区
ITS 因存在种内多态性，已被用于种内居群间的差异
性研究，该技术为中药质量标准规范化奠定了坚实
的基础[2]。国内有太子参脱毒苗、混伪品和不同产区
太子参 rDNA 的 ITS 区序列分析研究的报道[3-5]，但
尚未开展不同种质来源孩儿参 rDNA的 ITS 区序列
分析及鉴别研究，本实验对不同种质来源孩儿参
rDNA 的 ITS 区序列进行 PCR 扩增、克隆和测序，
获得 rDNA ITS区序列，通过分析 ITS区序列差异，
运用软件分析序列，构建不同种质来源孩儿参种
内系统发育树，建立不同种质来源孩儿参种内鉴
别方法，为太子参规范化生产提供稳定的孩儿参
种质，以确保太子参药材质量的安全、有效、稳
定、可控。
1 材料与仪器
1.1 材料
供试品为石竹科异叶假繁缕属植物孩儿参
Pseudostellaria heterophylla (Miq.) Pax ex Pax et
Hoffm. 的新鲜叶片，采集后立刻进行液氮速冻，带
回实验室后移至−80 ℃冰箱保存待用。9 个不同种
质来源孩儿参的采集地点见表 1，均由福建中医药
大学杨成梓副教授鉴定。
1.2 仪器
PCR 仪（PTC—100TM 型，MJ Research INC），
冷冻离心机（5415R 型，Eppendorf），凝胶分子成像
分析系统（GEL DOC2000，Bio-Rad 公司），图像打
印系统（MITSUBISHI P91E，），电泳（PAC300-R 型，
Schneider，法国），电泳槽（SUB-CELL GT），电压
仪（MA665EL 200，Bio-Rad 公司），磁力加热搅拌
器（78-1，常州国华电器有限公司），SK-1 快速混匀
器（常州国华电器有限公司），电子精密天平
（PB303—E），pH 计（PHS—25A 型），微量移液器
（10、50、200、1 000 μL，Glson 公司），摇床（HQ45B，
中国科学院武汉科学仪器厂），制冰机（SIM—F124，
表 1 不同种质孩儿参采集地点及注册的 Genbank 登陆号
Table 1 Collection places and registered Genbank No.
of P. heterophylla from different idioplasms
编号 采集地点 种质 Genbank 登陆号
1 柘荣县双城镇 柘参 2 号 EF197887
2 柘荣县双城镇 自留种 EF197886
3 柘荣县英山乡 柘参 2 号 EF197879
4 柘荣县英山乡 大叶种 EF197880
5 福安县上白镇 圆叶种 EF197881
6 柘荣县富溪镇 自留种 EF197882
7 霞浦县 柘参 1 号 EF197883
8 霞浦县 柘参 2 号 EF197884
9 山东临沂市 自留种 EF197885

Sanyo），−80 ℃冰箱（MDF—192，Sanyo）。
2 方法
2.1 总 DNA 提取
称取孩儿参叶片 0.2 g，采用改进的 CTAB 法提
取总DNA，酚氯仿抽提法纯化DNA。所提的总DNA
沉淀为白色，经电泳检测，不同种质来源的孩儿参
总 DNA 均是单一的条带，没有杂带。
2.2 ITS 序列 PCR 扩增
2.2.1 扩增引物 使用的 18S～26S rRNA 特异性
引物 W1/W2 是根据药用植物柴胡 18S～26S rRNA
的序列设计的[6]，其引物序列为 W1：5’-TCCGTA-
GGTGAACCTGCGG-3’；W2：5’-TCCTCCGCTTAT-
TGATATGTTAAACTC-3’。使用的 18S～26S rRNA
特异性引物 P1/P2 是已发表的扩增孩儿参的 ITS 区
的引物[7]，其序列为引物 18SP1：5’-CGTAACAAG
GTTTCCGATGGTGAA-3’；引物 26SP2：5’-TTA-
TTGATATGCTTAAACTCAGCGGC-3’。
2.2.2 PCR 扩增反应 在一新的 Eppendorf 管中加
入 DNA 模板 50 ng；dNTP 0.128 mmol；10×buffer
3 μL；引物 0.32 μmoL；Taq 酶 0.4 U；Mg2+ 1.8 mmol
（未添加外源 Mg2+）；反应体系总体积为 25 μL，其
中 Mg2+含在 10×缓冲液中。
2.2.3 扩增程序 94 ℃预变性 4 min，94 ℃变性 1
min，48 ℃复性 20 s，72 ℃延伸 1.5 min，2 个循
环；94 ℃变性 20 s，48 ℃复性 20 s，72 ℃延伸
1.5 min，36 个循环；最后 72 ℃延伸 10 min，得扩
增产物。扩增产物经电泳检测，引物 W1/W2 所扩
增的条带特异性好，PCR 产物的凝胶电泳只出现一
条大小约为 700 bp 的产物；而用引物 SP1/SP2 所扩
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增的条带的特异性不理想。
2.3 ITS 序列克隆
将 PCR 扩增的目的条带用凝胶回收试剂盒回收
后，与载体pMD 18-T连接，连接反应按大连宝生pMD
18-T 载体试剂盒提供的方法进行。连接反应后，转进
大肠杆菌中，再用含氨苄的培养基进行过夜培养，提
取大肠杆菌转化菌的质粒 DNA 进行克隆鉴定。
2.4 ITS 区克隆片段的测序
将 PCR 扩增，酶切鉴定均为阳性的克隆菌菌液
送至北京三博远志生物技术有限责任公司测定核苷
酸序列。
2.5 ITS 序列比对
去除载体序列：将序列提交至 NCBI 网站运行
VECTOR SCREEN，然后再手动去除载体序列。序
列的对位排列与分析：采用软件 DNAMAN 5.2 对 9
条序列进行对位排序，采用 Kimura 参数计算遗传
距离，采用 Mega 3.1 软件包构建系统发育树。
3 结果与讨论
3.1 PCR 扩增
PCR 扩增体系优化后，在 25 μL 反应体系中，
包括 1 μL 模板，1.8 mmol Mg2+，0.128 mmol dNTP，
0.32 μmol 引物，0.4 U TaqDNA 聚合酶。
通过质粒的电泳检测，结果出现了超螺旋、线
性、开环 3 种形式的 DNA 分子。以重组的质粒 DNA
为模板，进行 PCR 鉴定，经电泳检测，均能扩增出
目的片段（图 1），初步显示，目的片段已插入克隆
载体 pMD 18-T 中并转入大肠杆菌 DH5α。
在质粒插入位点附近，有一个 EcoRI 的酶切位
点和 PstI 的酶切位点，因此将重组质粒用 EcoRI 和
PstI 进行双酶切，可以产生两个片段。经电泳鉴定
（图 2），产生了一条较大的片段和一条较小的片段，

M-Marker 1～9-9 个不同种质孩儿参，下图同
M-Marker 1—9-9 Pseudostellaria heterophyllas
from different idioplasms, same as follow
图 1 重组质粒的 PCR 鉴定
Fig. 1 PCR identification of recombinant plasmids

图 2 阳性克隆所提取质粒的双酶切电泳图
Fig. 2 Double enzyme digestion electrophoresis of plasmid
extracted from positive clone DNA
后者大小在 700 bp 左右，与插入的外源片段大小相
符，证明外源片段完整和载体连接，插入到质粒
DNA 中。
ITS 区序列分析结果表明，共测得 9 个不同种
质来源孩儿参部分 18S，全部 rDNA ITS 序列（包
括 5.8S）和部分 26S 序列，共约 700 bp。9 个 ITS
序列己经注册到 GenBank，登录号见表 1。
孩儿参 rDNA 的 ITS-1、5.8S 和 ITS-2 的界限参
照 Genbank 中石竹科植物雀舌繁缕 Stellaria alsine
的资料来确定。测得 9 个不同种质来源孩儿参
ITS-1，5.8S rDNA 和 ITS-2 全序列，18S rDNA 基
因 3’端和 26S rDNA 基因 5’端部分碱基序列，共约
700 bp。各样品均显示不同的变异位点，其中 ITS-1
为 224 bp，变异位点有 7 个；5.8S rDNA 为 155 bp，
变异位点有 3 个；ITS-2 为 244～245 bp，变异位点
有 7 个。整个 ITS 区的变异位点丰富，可以较好地
区分不同种质来源的孩儿参。所以，采用 ITS 序列
鉴别不同种质孩儿参的方法是可行的。
3.2 不同种质孩儿参 ITS 序列比对
不同种质来源孩儿参 ITS-1、5.8S 和 ITS-2 序列
变异位点丰富。9 个不同种质来源孩儿参均有若干
个特异性的单核苷酸变异位点。柘荣县双城镇柘参
2 号、福安县上白镇圆叶种各有 1 个特异性的单核
苷酸变异位点；柘荣县英山乡大叶种、柘荣县富溪
镇自留种、霞浦县柘参 2 号、山东临沂自留种均有
2 个特异性的单核苷酸变异位点；柘荣县双城镇自
留种、霞浦县柘参 1 号的特异性位点均有 3 个。因
此通过比较 ITS 区序列可以准确地鉴别不同种质来
源孩儿参。由此可见，不同种质来源孩儿参的 ITS
区序列，即其 ITS 及 5.8S rDNA 的序列分析，可为
孩儿参不同种质的鉴别及该属的分类方面提供了新
的手段，所得的 ITS 区序列为孩儿参的分子标记的
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9
700 bp
500 bp
1 000 bp
1 2 3 4 5 6 7 8 9 M

700 bp
500 bp
2 000 bp
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确定提供了依据，说明核糖体 DNA ITS 区序列用于
孩儿参的分子鉴定是可行的。
3.3 碱基组成分析
G＋C 量能反映属种内亲缘关系的遗传型特
征，每个物种的 DNA 都有其特定的 G＋C 量，不
同物种的 G＋C 量不同，亲缘关系愈远，其 G＋C
量的差别就愈大。不同种质来源孩儿参 ITS 中碱基
组成见表 2。
由表 2 可见，ITS2 的 G＋C 量在 55.55%～
56.41%变化，而 5.8S G＋C 量在 54.49%～55.13%
变化，ITS1 的 G＋C 量在 52.91%～54.26%变化。
5.8S G＋C 量较 ITS1 的高，比 ITS2 的低。
3.4 遗传距离分析
由表 3 可见，不同种质来源孩儿参的遗传距离
变异范围为 0.003～0.013，这表明孩儿参种内 rDNA
表 2 不同种质来源孩儿参 ITS 中各序列的 G＋C 量
Table 2 Contents of G + C in ITS sequences of P.
heterophylla from different idioplasms
G＋C 量 / % 编号
ITS1 5.8S ITS2
1 53.81 55.13 55.55
2 53.81 55.13 56.17
3 53.81 55.13 55.98
4 53.81 55.13 55.56
5 53.81 54.49 55.98
6 52.91 55.13 55.98
7 53.36 55.13 56.41
8 53.36 55.13 55.56
9 54.26 55.77 55.98

ITS 区存在遗传变异，但遗传变异率较低，属
于同一个种植物，其中霞浦产柘参 1 号种和来自山
东临沂的孩儿参遗传距离最大，柘荣县双城镇柘参
2 号、柘荣县英山乡柘参 2 号、福安县上白镇圆叶
种和柘 荣县富溪镇自留种的遗传距离最小。
尽管 rDNA ITS 区己被国际上公认是生物各类
群属下种内水平比较研究的一个很好的分子指标，
并且已在动物[8]、被子植物[9]、真菌[10]等得到广泛
的应用，但是，作为种的界定标准，目前尚未有一
致的标准。Renske 等[10]认为通过 ITS 区域比对，序
列相似性大于 99%，鉴别为相同种；序列相似性大
于 95%且小于 99%，鉴别为相同属；序列相似性小
于 95%，鉴别为相同科。用 DNAMAN 对 9 个不同
品系孩儿参的 ITS 序列进行多重比对后，得到一序
列同源树（图 3）。柘荣县双城镇柘参 2 号、柘荣县
英山乡柘参 2 号、福安县上白镇圆叶种和霞浦县柘
参 2 号的同源性最高，达到了 100%。如此相似的
ITS 序列反映了它们之间具有十分密切的亲缘关
系。其余各个品种的同源性为 99%，表明这几个种
在系统演化过程中分化节律比较一致，历史分歧时
间也相差不大，亲缘关系较近。
由于 ITS 1 和 ITS 2 两个片段的长度有限，各自
提供的信息量有限，因此多数研究者都是将这两个
片段综合起来分析，为此，用 Mega3.1 软件，基于
9 个不同种质来源孩儿参的 ITS 区序列构建其分子
系统发育树。构建系统发育树的常用方法有邻接法
（NJ）、最大简约法（MP）、不加权对群分析法
（UPGMA）、ME（minimum evolution）法。以上
4 种方法各有一定的运用条件和范围，但是同时用
表 3 不同种质来源孩儿参 ITS 各序列遗传距离
Table 3 Genetic distance matrix in ITS sequences of P. heterophylla from different idioplasms
编号 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1 0
2 0.007 0
3 0.003 0.007 0
4 0.007 0.011 0.007 0
5 0.003 0.007 0.003 0.007 0
6 0.003 0.007 0.003 0.007 0.000 0
7 0.009 0.013 0.007 0.013 0.009 0.009 0
8 0.004 0.009 0.004 0.009 0.004 0.004 0.010 0
9 0.007 0.011 0.007 0.000 0.007 0.007 0.013 0.009 0
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图 3 不同种质来源孩儿参 ITS 序列的同源树
Fig. 3 Homology tree for ITS sequence of P. heterophylla
from different idioplasms
几种方法构建的系统树结果的一致性将提高研究结
果的可靠性。
来自山东临沂的孩儿参都是处于系统发育树的
末端，说明其在历史上出现的最晚，属于其中最进
化的种系，这也说明福建是太子参的道地产地。
4 结语
rDNA ITS 在核中是多拷贝的重复序列，大多数
被子植物的 ITS 序列由于同步进化的力量，众多拷
贝已高度相似或一致化，目前该片段已广泛用于探
讨植物种内变异和种间、近缘属间分子系统关系的
研究，然而在不同的植物类群以及在不同分类等级
上，ITS 序列的价值是不一样的，因为不同类群的
起源时间及进化（分化）速率不一样，其 ITS 序列
所含有的信息量也不同[11]，如对 Fouquieria Kunth
（Fouquieriaceae）11 种的研究中，信息位点比例为
6%。系统发生树上来自同一地区的样品并不一定处
于同一分组或首先聚类，可能是由于样品分布区广
的原因；而来自不同地区的样品也可能处于一组，
这可能是因为孩儿参分布区的环境小造成的。由于
本研究的不同种质孩儿参覆盖了孩儿参道地产区福
建的 8 个样品，在福建取样具有一定的代表性，因
此 ITS 序列在孩儿参种内分化活跃，变异位点量丰
富，对于探讨孩儿参种内亲缘关系具有一定的意义。
利用核 rDNA ITS 序列对不同种质来源孩儿参
的系统发育关系进行分析。认为孩儿参的整个 ITS
长度变异范围为 623～624 bp；其中 ITS1 为 224 bp，
G＋C 量为 52.91%～54.26%；5.8S rDNA 为 155 bp，
G＋C 量为 54.49%～55.13%；ITS2 为 244～245 bp，
G＋C 量为 55.55%～56.41%。整个 ITS 区共有 17
个变异位点，ITS1、ITS2 和 5.8S 的变异位点分别
为 7、7 和 3 个；序列间的遗传距离为 0.003～0.013。
9 个不同种质来源孩儿参的 ITS 区变异稳定，
变异位点共 17 个（2.72%），5.8S rDNA 其长度均
155 bp，有 3 个变异位点；各样品的序列同源性均
在 99.9%以上；系统发育分析表明 9 个样品的最大
遗传距离为 0.013。上述结果说明不同种质来源孩儿
参的变异是不超过一个种的范围内的变异。
参考文献
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1
5
3
8
6
2
9
4
7
100% 95%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%
99%