全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

• 2008 •
蝎毒提取物对 Lewis 细胞及 DU-145 细胞转移的抑制作用
王兆朋，贾 青，王朝霞，张月英，王晓慧，张维东*
山东省医学科学院基础医学研究所，山东 济南 250062
摘 要：目的 观察蝎毒提取物对 Lewis 肺癌细胞肺转移和前列腺癌细胞株 DU-145 骨转移的抑制作用。方法 C57BL/6 小
鼠尾 iv Lewis 肺癌细胞（实验分模型组和给药组），裸鼠尾 iv CM-DiI 标记 DU-145 细胞（实验分模型组、对照组和给药组），
给药组均每天 ig 给予蝎毒提取物 300 mg/kg 1 次，C57BL/6 小鼠给药 12 d，裸鼠给药 24 d，模型组和对照组给予等量生理盐
水，肉眼及镜检观察肺转移灶 Lewis 肺癌细胞肺转移情况，活体成像系统观察 DU-145 细胞骨转移的情况。在体外实验，免
疫组化法检测 Lewis 细胞基质金属蛋白酶-9（MMP-9）的表达，免疫组化法和 Western blotting 检测 DU-145 细胞 MMP-9、
NF-κB、基质金属蛋白酶抑制因子 1（TIMP-1）、IκB-α蛋白表达。结果 接种 Lewis 肺癌细胞后，蝎毒提取物组平均癌细胞
肺转移灶数为 3.2±1.2，而模型组为 13.5±5.3，差异显著（P＜0.01）。活体成像检测显示，接种 DU-145 细胞 30 d 后，对照
组未见荧光团，模型组 8 只裸鼠中有 6 只肩胛骨、骨盆、肋骨及胫骨显示有大量荧光团存在，蝎毒提取物组仅有 3 只裸鼠出
现明显荧光团。免疫组化法和 Western blotting 检测显示，与对照组相比，蝎毒提取物给药后 DU-145 细胞 MMP-9、NF-κB
蛋白表达下调（P＜0.01），TIMP-1 表达上调（P＜0.01），免疫组化检测亦显示 IκB-α蛋白表达上调（P＜0.05）。结论 蝎毒
提取物抑制 Lewis 肺癌细胞肺转移和 DU-145 细胞骨转移，其作用是通过 NF-κB 和 TIMP-1 途径抑制 MMP-9 表达实现的。
关键词：蝎毒提取物；DU-145 细胞；Lewis 细胞；癌细胞转移；基质金属蛋白酶-9；NF-κB；基质金属蛋白酶抑制因子 1
中图分类号：R285.5；R979.19 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)10 - 2008 - 05
Inhibition of extract from scorpion venom on experimental metastasis of Lewis
and DU-145 tumor cells
WANG Zhao-peng, JIA Qing, WANG Zhao-xia, ZHANG Yue-ying, WANG Xiao-hui, ZHANG Wei-dong
Institute of Basic Medcine, Shandong Academy of Medical Science, Ji’nan 250062, China

Key words: extract from scorpion venom; DU-145 cell; Lewis cell; metastasis; matrix metalloproteinase-9 (MMP-9); nuclear factor-κB
(NF-κB); tissue-inhibitor of metalloproteinase-1 (TIMP-1)

癌细胞转移是恶性肿瘤的重要特征，也是肿
瘤患者预后的关键因素。近年来，肿瘤转移机制
研究虽取得了长足的进步，但临床上仍缺乏有效
的抗肿瘤转移药物。全蝎甘、辛、平，有小毒，具
有熄风镇痉、攻毒散结、通络止痛等功效，临床
上常用来治疗风湿顽痹、瘰疬结核等症。全蝎的
主要药用部位是蝎毒，近年来发现其具有良好的
抗肿瘤作用。前期研究表明，蝎毒提取物可抑制
肿瘤细胞增殖，下调血管内皮生长因子（VEGF）
的表达水平[1-3]。本实验通过观察蝎毒提取物对前
列腺癌细胞株 DU-145 荷瘤裸鼠骨转移、Lewis 肺
癌荷瘤小鼠肺转移的影响，进一步确定其抗肿瘤
转移的作用。
1 材料
1.1 药品与试剂
蝎毒提取自野生东亚钳蝎 Buthus martensii
Karsch，由笔者鉴定。兔抗人 MMP-9、TIMP-1、
NF-κB、IκB-α一抗体（北京中杉公司）；RPMI 1640
培养基（Gibco 公司）；新生小牛血清（杭州四季青
公司）；C-7000 CM-DiI 荧光染料（美国 Molecular
Probes 公司）；SABC 试剂盒（北京中山生物技术
公司）。
1.2 细胞
人前列腺癌细胞 DU-145 由北京大学泌尿外科
研究所提供，Lewis 肺癌细胞购自中国医学科学院
药物研究所。2 种细胞株均用含 10%小牛血清的

收稿日期：2012-02-23
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30873408）；山东省自然科学基金资助项目（Y2007C094）；山东省济南市科技项目（201004011）
作者简介：王兆朋，男，助理研究员，研究方向为中西医结合抗肿瘤转移。Tel: (0531)82919939 E-mail: charle92003@163.com
*通讯作者 张维东 Tel: (0531)82919939 E-mail: zhangweidongkui@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 10 期 2012 年 10 月

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RPMI 1640 培养基在 37 ℃、饱和湿度、5%CO2培
养箱中常规传代培养。
1.3 动物
C57BL/6 小鼠，体质量 18～20 g，饲养于清洁
级环境，用于尾 iv Lewis 细胞；Balb/c 裸鼠，6～8
周龄，体质量 18～20 g，饲养于 SPF 环境中，用于
尾 iv DU-145 细胞。2 种动物均购自北京维通利华
实验动物技术有限公司，许可证号 SCXK（京）
20070001。
1.4 仪器
DM4000B 光学显微镜、Qwin V3 图像分析软件、
Leica DM400B软件分析系统，德国Leica公司。Image
station 2000 mm 活体成像系统，美国柯达公司。
2102C 型紫外分光光度计，美国 Unico 公司。
2 方法
2.1 蝎毒提取物的制备
蝎毒冻干粉以蒸馏水溶解成质量浓度为 25
mg/mL 溶液（pH 7.4），2 000 r/min 离心 30 min，0.45、
0.22 μm 微孔滤膜滤过，超滤物冻干。取蝎毒冻干
粉 400 mg 加磷酸缓冲液（PBS）上样，经葡聚糖凝
胶，收集蝎毒 III～IV 蛋白峰，再进行阳离子交换
色谱分离，紫外分光光度仪（吸收波长 280 nm）检
测，收集蝎毒提取物蛋白峰。蝎毒提取物在 HPLC
色谱中显示 4 个峰，主峰占总峰面积的 41.4%。蝎
毒提取物为含有 50～60 个氨基酸的多肽混合物，质
量分数为 89.1%，相对分子质量 6 000～7 000，pH
值稳定。蝎毒提取物以 RPMI 1640 完全培养基溶解
稀释，给药时以蒸馏水稀释。
2.2 对 Lewis 肿瘤荷瘤小鼠肺转移的影响
Lewis 细胞种植于 C57BL/6 小鼠右腋皮下进行
扩增传代，传 3 代后，无菌剥离肿瘤组织，研磨制
成细胞悬液，调细胞浓度为 1×106/mL，每只小鼠
尾 iv Lewis 细胞悬液 0.1 mL 造模。将造模小鼠随机
分成蝎毒提取物组和模型组 2 组，每组 10 只，蝎毒
提取物组于接种肿瘤细胞第 6 天开始 ig 给予蝎毒
提取物 300 mg/kg，每天给药 1 次，连续给药 12 d，
模型组 ig 等量蒸馏水。接种肿瘤细胞第 30 天颈椎
脱臼处死各组小鼠，取肺脏，肉眼及解剖镜观察肺
转移灶数与大小，称小鼠体质量和肺质量，并计算
肺指数，而后中性甲醛固定。
2.3 对 DU-145 荷瘤裸鼠骨转移的影响
2.3.1 荧光标记 DU-145 细胞 取生长良好的
DU-145 细胞，常规消化，离心，收集细胞并计数，
弃上清。取 CM-DiI 荧光染料 50 μg，加入 50 μL
DMSO 溶解，以 Dulbecco PBS 稀释（终质量浓度
为 4 μg/mL）后，迅速加入离心管孵育标记细胞：
先于 37 ℃孵育 5 min，再于 4 ℃孵育 15 min，PBS
冲洗细胞 1 次，离心，用生理盐水悬浮细胞，使细
胞浓度为 2×107/mL。CM-DiI 荧光染料在发射波长
465 nm，激发波长 570 nm 下观察。
2.3.2 模型制备、分组与给药 每只裸鼠尾 iv 标记
好的 DU-145 细胞悬液 0.1 mL。将接种 DU-145 细
胞后的裸鼠随机分为 2 组：蝎毒提取物组（8 只）、
模型组（8 只），蝎毒提取物组裸鼠在 iv DU-145 细
胞后第 6天开始，每天 ig给予蝎毒提取物 300 mg/kg
1 次，连续给药 24 d，模型组 ig 等量蒸馏水；另取
3 只正常小鼠作为对照组。
2.3.3 裸鼠活体观察 于接种 DU-145 细胞第 30
天，乙醚麻醉裸鼠，迅速进行活体荧光分析，发射
波长 465 nm，激发波长 570 nm，曝光时间为 15 min。
2.4 对 Lewis 和 DU-145 细胞相关蛋白表达的影响
2.4.1 分组与给药 取处于对数生长期的 Lewis 和
DU-145 细胞，在 12 孔板中进行细胞爬片，于爬片
24 h 后将细胞分为蝎毒提取物组和对照组，前者给予
蝎毒提取物 40 μg/mL，后者给予等体积的培养液。
2.4.2 免疫组织化学检测 细胞于 12 孔板爬片培
养，染色过程严格按照 SABC 试剂盒说明书操作。
高倍镜下随机选取 5 个高倍视野，读取阳性表达
MMP-9 的 Lewis 细胞以及表达 MMP-9、TIMP-1、
NF-κB、IκB-α的 DU-145 细胞的百分比，并进行灰
度值分析（灰度值越低，表达水平越高）。
2.4.3 Western blotting 检测 细胞裂解液裂解
DU-145 细胞，BCA 法测定总蛋白的量。配制
SDS-PAGE 凝胶，电泳条件为 100 V、2 h，常规电
转仪电转，5%脱脂奶粉封闭 3 h，将硝酸纤维素膜
与 1∶1 000 稀释的一抗在室温下反应 2 h，再与 1∶
1 000 稀释的辣根过氧化酶标记的兔抗人 IgG（二
抗）室温下反应 1 h，加入 DAB 显色 10～15 min，
自来水冲洗终止酶反应。Leica Qwin V3 图像分析软
件对各显色条带进行灰度值分析。
2.5 统计学分析
计量数据以 ±x s 表示，采用 SPSS10.0 软件包
进行 t 检验和方差分析。
3 结果
3.1 对 Lewis 肺癌荷瘤小鼠肺转移的影响
蝎毒提取物组肺癌小鼠肺转移灶数为 3.2±
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1.2，明显少于模型组的 13.5±5.3（P＜0.01）；与模
型组相比，蝎毒提取物组小鼠的体质量和肺质量均
明显降低，差异显著（P＜0.05）。结果见表 1。
表 1 蝎毒提取物对 Lewis 肺癌荷瘤小鼠肺转移的影响
( 10=± n , sx )
Table 1 Effect of extract from scorpion venom on pulmonary
metastasis of Lewis cells in mice ( 10=± n , sx )
组 别 剂量 /
(mg·kg−1)
肺转移灶数 体质量 / g 肺指数
模型 － 13.5±5.3 26.9±4.2 1.36±0.14
蝎毒提取物 300 3.2±1.2** 20.7±3.1* 1.47±0.09*
与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs model group
3.2 对 DU-145 荷瘤裸鼠骨转移的影响
活体成像观察可见，模型组有 6 只裸鼠骨骼存
在荧光团，其中 4 只荧光强度较高，荧光团主要集
中在裸鼠肩胛骨、骨盆、胫骨、肋骨，而脊柱未发
现明显荧光存在，1 例荧光团不明显。蝎毒提取物
组有 3 只裸鼠骨骼有荧光团存在，仅 1 只荧光强度
较高，表明蝎毒提取物对 DU-145 荷瘤裸鼠骨转移
具有抑制作用，结果见图 1。
3.3 对 Lewis 细胞 MMP-9 表达的影响
免疫组化检测结果显示，对照组 Lewis 细胞
MMP-9 高表达，而蝎毒提取物组 MMP-9 表达显著
下调（P＜0.01）。免疫组化检测灰度值分析见图 2。


图 1 DU-145 荷瘤裸鼠的活体成像观察
Fig. 1 In vivo imaging observation of DU-145 tumor-bearing mice

与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group
图 2 蝎毒提取物对 Lewis 细胞 MMP-9 表达的影响
Fig. 2 Effect of extract from scorpion venom
on MMP-9 expression in Lewis cell
3.4 对 DU-145 细胞相关蛋白表达的影响
免疫组化检测结果显示，与对照组相比，蝎毒
提取物组 DU-145 细胞中 MMP-9、NF-κB 蛋白表达
水平皆下调，以 MMP-9 下调更为明显（P＜0.05），
TIMP-1、IκB-α 表达则上调（P＜0.01）。蝎毒提取
物组细胞碎片明显增多，细胞贴壁差，悬浮细胞增
多。结果见图 3、4。
Western blotting 检测结果显示，与对照组相比，
蝎毒提取物组 DU-145 细胞 MMP-9、NF-κB 蛋白表
达降低（P＜0.05），TIMP-1 蛋白表达明显升高。蝎
毒提取物组和对照组 TIMP-1 蛋白表达灰度值分别
为 68.2±5.42、43.6±6.45，差异显著（P＜0.01）。
Western blotting检测结果见图5，灰度值分析见图6。
4 讨论
肿瘤细胞发生转移过程中，细胞外基质的降解
是关键环节。基膜的主要成分是 IV 型胶原，因此
IV 型胶原酶在肿瘤浸润和转移中起重要作用。IV
型胶原酶还可维持肿瘤细胞从细胞外基质获取生长
因子和促进肿瘤血管生长以调节肿瘤生长[4]。IV 胶
原酶有 MMP-2 和 MMP-9，MMP-9 主要降解细胞
外基质中 IV 型胶原和明胶，其存在组织型抑制因

对照 模型 蝎毒提取物

200

160
120
80
40
0
对照 蝎毒提取物

M
M
P-
9
灰
度
值

**
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图 3 蝎毒提取物对 DU-145 细胞转移相关蛋白表达的影响
Fig. 3 Effect of extract from scorpion venom on expression of metastasis-associated protein in DU-145 cell

与对照组比较：**P＜0.01
**P < 0.01 vs control group
图 4 DU-145 细胞转移相关蛋白表达的灰度值分析
Fig. 4 Greyscale analysis of expression of metastasis-
associated protein in DU-145 cell
子TIMP-1，TIMP-1通过与MMP-9结合而使MMP-9
失活[5]，已发现很多恶性肿瘤组织表达 MMP-9 与
TIMP-1。本实验结果表明，蝎毒提取物干预 DU-145
细胞后，MMP-9 表达下调，TIMP-1 表达明显上调，
表明 MMP-9 表达下调与 TIMP-1 表达上调有关。
MMP-9 启动子结构区域有两个 AP-1 结合位点，一
个 AP-2 结合位点，一个 NF-κB 结合位点。NF-κB
作为一个转录因子，在炎症、免疫反应及肿瘤发生
和发展等生理、病理过程中有重要意义[6-10]。NF-κB
蛋白主要受其抑制因子 I κB 家族的调节。本实验免
疫组化检测发现，蝎毒提取物组DU-145细胞NF-κB
蛋白表达与 MMP-9 蛋白表达同时下调，表明
MMP-9 蛋白表达与 NF-κB 蛋白表达相关，NF-κB
可促进 MMP-9 的表达；同时 NF-κB 抑制因子 IκB-α

图 5 蝎毒提取物对 DU-145 细胞转移相关蛋白表达的影响 (Western blotting)
Fig. 5 Effect of extract from scorpion venom on expression of metastasis-associated protein
in DU-145 cell (Western blotting)
的表达上调，表明蝎毒提取物通过激活 IκB-α 途径
抑制 NF-κB 表达。
恶性肿瘤发生转移时，首先是癌细胞局部浸润
并渗入血管，然后随血液循环系统转移并在其中存
活，最后移出血管在新的部位定居并增殖，本实验
采用将肿瘤细胞直接注射入小（裸）鼠尾静脉中，
导致肿瘤转移的方法，该模型体现了肿瘤细胞进入
血液后发生转移的过程，与人体内瘤细胞进入血液
250
200
150
100
50
0
MMP-9 TIMP-1 NF-κB IκB-α
**
**
**
**
对照
蝎毒提取物
条
带
灰
度
值



85 000 bp
47 000 bp
36 000 bp
85 000 bp
47 000 bp
36 000 bp
47 000 bp
26 000 bp
20 000 bp
MMP-9 NF-κB TIMP-1
蝎毒提取物 对照 蝎毒提取物 对照 蝎毒提取物 对照



MMP-9 TIMP-1 NF-κB IκB-α
对照




蝎毒
提取物

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与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01
*P < 0.05 **P < 0.01 vs control group
图 6 蝎毒提取物对 DU-145 细胞转移相关蛋白水平表达的
影响 (Western blotting)
Fig. 6 Effect of extract from scorpion venom on expression
of metastasis-associated protein in DU-145 cell
(Western blotting)
循环的情况相似，因此常用于抗肿瘤转移药物的筛
选。因此本实验首先采用向 C57BL/6 小鼠尾静脉注
射 Lewis 肺癌细胞，以建立 Lewis 肺癌肺转移模型。
结果显示，此方法建立肺转移模型成功。模型组小
鼠体质量及肺质量明显增加，而肺指数降低，提示
肿瘤转移到肺中并在肺中生长时，机体被迫提高体
质量以维持高代谢状态；应用蝎毒提取物后，体质
量及肺质量明显下降，肺指数提高，说明蝎毒可有
效抑制转移和抑制肿瘤在肺中的生长。经免疫组织
化学检测显示，在对照组肿瘤转移灶组织中高表达
MMP-9，表明 MMP9 参与了肿瘤细胞转移灶的形
成。经蝎毒提取物干预后，转移灶形成明显减少，
且转移灶肿瘤组织 MMP-9 表达明显降低，提示蝎
毒提取物可能通过抑制 MMP-9 的表达，达到抑制
肿瘤细胞转移和在肺中形成转移灶的目的。
裸鼠尾静脉注射 DU-145 细胞实验中，DU-145
细胞经 CM-DiI 标记 30 d 后，经活体荧光观察可见
模型组裸鼠肩胛骨、肋骨、胫骨及骨盆等处明显存
在荧光团，证明前列腺癌 DU-145 细胞具有较高的
骨转移性，为临床上前列腺癌患者高发骨转移现象
提供了实验依据。
目前蝎毒在世界范围内得到广泛研究，并且已
经从蝎毒中分离出具有抗癌疗效的多肽分子。蝎毒
提取物对多种肿瘤具有治疗作用，但其机制至今尚
未完全明确。本实验结果表明，蝎毒提取物可下调
人前列腺癌 DU-145 细胞 MMP-9 表达水平，其作用
机制可能与 TIMP-1 和 NF-κB 两种途径有关。
参考文献
[1] 张维东, 崔亚洲, 贾 青, 等. 蝎毒多肽提取物对小鼠
S180 肉瘤和 H22 肝癌血管生成抑制作用的实验研究
[J]. 山东中医药大学学报, 2005, 29(2): 152-155.
[2] 张维东, 崔亚洲, 姚成芳, 等. 蝎毒多肽提取物抗肿瘤
血管生成作用的实验研究 [J]. 中国药理学通报, 2005,
21(6): 708-711.
[3] 王兆朋, 张维东, 武利存, 等. 蝎毒提取物抑制 Lewis
肺癌化疗期间再增殖实验研究 [J]. 中草药 , 2011,
42(1): 103-107.
[4] Trudel D, Fradet Y, Meyer F, et al. Significance of MMP22
expression in prostate cancer: An immunohistochemical
study [J]. Cancer Res, 2003, 63(23): 8511- 8515.
[5] Brew K, Dinakarpandian D, Nagase H. Tissue inhibitors
of metalloproteinases: evolution, structure and function
[J]. Biochim Biophys Acta, 2000, 1477(1/2): 267-283.
[6] Sanjeev S, Sanjay G. Suppression of constitutive and
tumor necrosis factor-induced nuclear factor (NF)-κB
activation and induction of apoptosis by apigenin in
human prostate carcinoma PC-3 cells: correlation with
down-regulation of NF-κB responsive genes [J]. Clin
Cancer Res, 2004, 10(9): 3169-3178.
[7] 向松涛, 郭 辉. 核转录因子 κB与前列腺癌 [J]. 中华
男科学, 2003, 9(7): 536-538.
[8] Barbara A, Pratibha B, Kevin W, et al. Chromatin-
dependent E1A activity modulates NF-κB relA-mediated
repression of glucocorticoid receptor-dependent trans-
cription [J]. J Biol Chem, 2005, 280(8): 6349-6358.
[9] Adam J F, Sarah E H, Talib Al-M, et al. Evidence for
incorporation of free-floating cells as a mechanism of
serosal healing [J]. J Cell Sci, 2002, 115(7): 1383-1388.
[10] Ben-Yair R, Kahane N, Kalcheim C. Coherent
development of dermomyotome and dermis from the
entire mediolateral extent of the dorsal somite [J].
Development, 2003, 130(9): 4325-4336.


120
100
80
60
40
20
0
MMP-9 NF-κB TIMP-1
对照
蝎毒提取物
条
带
灰
度
值
**
*
*