全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 3 期 2011 年 3 月 ·470·
正交试验优选黄芪多糖脂质体的制备工艺
范云鹏，王德云*，胡元亮，刘家国，高 焕，王远垒，郭利伟
南京农业大学 中兽医学研究室，江苏 南京 210095
摘 要：目的 优选黄芪多糖脂质体制备的的最佳工艺。方法 采用薄膜分散-微孔滤膜挤压法制备黄芪多糖脂质体，以包
封率和载药量为指标，以脂药比、膜材比和超声时间为因素，采用 L9(34)正交试验设计对制备条件进行优选，鱼精蛋白法测
定黄芪多糖脂质体的包封率，透射电镜测定其形态和粒径。结果 薄膜分散-微孔滤膜挤压法制备黄芪多糖脂质体的最佳工
艺为脂药比 10∶1，膜材比 8∶1，超声时间 20 min。结论 采用最佳工艺制备的黄芪多糖脂质体包封率和载药量较高，形
态和粒径较均匀，重现性好。
关键词：黄芪多糖脂质体；薄膜分散-微孔滤膜挤压法；正交试验；包封率；鱼精蛋白法
中图分类号：R283.6；R286.02 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2011)03 - 0470 - 04
Preparation condition optimization of astragalus polysaccharide liposome
by orthogonal test
FAN Yun-peng, WANG De-yun, HU Yuan-liang, LIU Jia-guo, GAO Huan, WANG Yuan-lei, GUO Li-wei
Institute of Traditional Chinese Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: Objective To optimize the preparation conditions of astragalus polysaccharide (APS) liposome. Methods APS
liposome was prepared by membrane distribution-micromembrane extruding method. L9(34) orthogonal test was adopted to optimize
the preparation conditions which was designed with three factors of lecithin to drug ratio, lecithin to cholesterol ratio, and ultrasonic
time, and two indexes of encapsulation efficiency and drug-loading rate. The encapsulation efficiency of APS liposome was assayed
by Protamine method, the shape and particle size were observed by transmission electron microscope. Results The optimized
preparation conditions were as follows: the ratio of lecithin to drug was 10∶1, the ratio of lecithin to cholesterol was 8∶1, and
ultrasonic time was 20 min. Conclusion The APS liposome prepared under the optimized conditions has following advantages:
high encapsulation efficiency and drug-loading rate, uniform shape and particle size, and good reproduction quality.
Key words: astragalus polysaccharide (APS) liposome; membrane distribution-micromembrane extruding; orthogonal test;
encapsulation efficiency; Protamine method

黄芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是
黄芪的主要有效成分，在调节免疫、抗病毒、抗衰
老等方面具有重要作用[1-4]。目前大多数黄芪多糖制
剂在使用过程中药物在到达作用部位之前，已被降
解代谢或排除，因此需要大剂量或是连续给药。研
究新型的黄芪多糖制剂或是选择一种高效的载体以
提高治疗效果并降低使用剂量，对黄芪多糖的临床
应用具有重要意义。脂质体具有靶向释药、缓释、
无免疫原性、降低药物不良反应等优势，近年来作
为药物载体已被广泛研究[5-10]。本研究采用薄膜分
散-微孔滤膜挤压法制备 APS 脂质体，采用正交试
验设计筛选出制备 APS 脂质体的最佳工艺，旨在提
高黄芪多糖的功效。
1 仪器与材料
Model RE—52A 型旋转蒸发仪，上海亚荣生物
仪器公司；754 紫外可见分光光度计，上海菁华科
技仪器有限公司；SB3200 超声波清洗器，上海新芝
生物技术研究所；Model H—7650 型透射电子显微

收稿日期：2010-06-19
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30901085）；国家科技支撑计划（2008BADB4B06）
作者简介：范云鹏（1983—），男，山东烟台人，在读博士研究生，主要从事兽医中药学与中药药理学研究。
Tel: 13770610887 E-mail: 2007107121@njau.edu.cn
*通讯作者 王德云 Tel: (025)84395203 E-mail: dywang@njau.edu.cn
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镜，Hitachi，High-Technologies 公司；BS110S 型电
子天平，Sartorius 公司。
黄芪购自南京大华中药房，由南京农业大学园
艺学院中药学周立良副教授鉴定为蒙古黄芪
Astragalus membranaceus (Fisch.) Bunge var.
mongholicus (Bunge) Hsiao 的干燥根；大豆卵磷脂
（批号 20090728），上海太伟磷脂有限公司；胆固醇
（批号 20090908），天津市博迪化学有限公司；鱼精
蛋白（批号 P4380），Sigma 公司；Triton-100（批号
9002-93-1），上海源叶生物科技有限公司；其他试
剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 APS 的制备
取蒙古黄芪 2.0 kg，加 8 倍量水煎煮 2 次，合
并滤液浓缩至 2.0 L，缓慢加入 95%乙醇至乙醇体积
分数达 60%，搅匀，静置 24 h，取沉淀，挥去乙醇，
加蒸馏水溶解，重复醇沉 1 次。取沉淀冷冻干燥，
得黄芪多糖，质量分数为 87%。
2.2 制备工艺设计
在预试验的基础上，发现脂药比（卵磷脂与药
物质量比）、膜材比（卵磷脂与胆固醇质量比）和超
声时间对脂质体的制备影响最大，因此，以脂药比
（A）、膜材比（B）和超声时间（C）为考察因素，
按 L9(34)正交表安排试验，因素水平见表 1。
表 1 因素水平
Table 1 Factors and levels
因 素
水平
A B C/min
1 10∶1 4∶1 10
2 15∶1 6∶1 20
3 20∶1 8∶1 30
2.3 APS 脂质体的制备[11]
将大豆卵磷脂（1 g）、胆固醇、维生素 E（0.025
g）溶解于乙醇-氯仿（1∶1）中，混匀后倒入梨形
瓶，在 30 r/min，水浴条件下旋转蒸干溶剂，使其
在玻璃瓶壁上形成干膜。将 APS 溶解在 PBS 溶液
中（3 个水平下 APS 的用量分别为 100、66.7、50
mg），再将 APS 溶液倒入梨形瓶中，在 40 r/min，
旋转水化直至将瓶壁上的干膜完全洗脱下来为止，
并将所得粗混悬液在 25 ℃下水化 1 h，然后水浴超
声 20 min。将所得粗混悬液依次通过 0.8 μm 微孔滤
膜 1 次，0.45 μm 微孔滤膜 3 次，0.22 μm 微孔滤膜
3 次，即得 APS 脂质体混悬液。
2.4 APS 脂质体包封率和载药量的测定[12]
吸取 0.5 mL 脂质体于 10 mL 锥形离心管中，
添加 0.5 mL 鱼精蛋白（10 mg/mL），搅匀，静置 3
min，加入 3 mL生理盐水，在室温条件下离心 30 min
（3 000 r/min），上清液以生理盐水定容至 10 mL。
取 1 mL 溶液，测定其多糖量，即游离药物量。沉
淀以 10% Triton-100 3 mL 溶解，并补充生理盐水
至 10 mL。取 1 mL 溶液，测定其多糖量，即包封
药物量。
包封率＝1－Cf / C 总
载药量 W＝(WT－WF)/WP
Cf 为游离多糖量，C 总为脂质体中包封的多糖与游离多糖之
和；WT为脂质体溶液中多糖的总质量，WF为游离多糖的质
量，WP 为大豆卵磷脂和胆固醇的质量之和
2.5 APS 脂质体中多糖的苯酚-浓硫酸法测定[13]
2.5.1 标准曲线 精密称取干燥至恒定质量的葡萄
糖 10 mg 定容于 100 mL 量瓶中，得质量浓度为 0.1
mg/mL 葡萄糖对照品溶液。在 6 支带塞试管中分别
加入葡萄糖对照品溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，
加蒸馏水至 2 mL，再各加入 5%苯酚溶液 1 mL，摇
匀，迅速垂直液面加入浓硫酸 5 mL，混匀后在沸水
浴中加热 15 min，冷却后用分光光度仪在 490 nm
处测定吸光度值（以 0 mL 葡萄糖对照品溶液管吸
光度值为校正值），以葡萄糖质量浓度对吸光度值进
行线性回归，得回归方程 Y＝59.36 X－0.007 8，
r2＝0.999 3，表明葡萄糖在 2.5～12.5 μg/mL 线性关
系良好。
2.5.2 样品测定 精密吸取脂质体溶液 1 mL，加蒸
馏水至 2 mL，按上述方法测定样品吸光度值，将吸
光度值求平均数后代入回归方程，计算，即得。
2.6 正交试验结果分析
以包封率为指标，各因素对包封率的影响大小
依次为超声时间＞膜材比＞脂药比，最佳制备工艺
为 C2B3A2。以载药量为指标，各因素对载药量的影
响大小依次为脂药比＞膜材比＞超声时间。最佳提
取工艺为 A1B3C2。因此，最佳膜材比为 8∶1，最
佳超声时间为 20 min。进一步进行 F 检验，可知脂
药比对载药量的影响较小，因此脂药比为 10∶1～
15∶1 均可，但从实际生产考虑，脂药比增大，导
致过滤困难，因此选择脂药比为 10∶1（见表 2）。
2.7 APS 脂质体形态及粒径测定
吸取脂质体混悬液适量，将其吸附于覆盖有碳
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表 2 L9(34)正交试验结果
Table 2 Results of L9(34) orthogonal test
试验号 A B C 包封率/% 载药量/%
1 10∶1 4∶1 10 34.28 2.88
2 10∶1 6∶1 20 38.44 3.54
3 10∶1 8∶1 30 42.82 5.90
4 15∶1 4∶1 20 45.24 3.61
5 15∶1 6∶1 30 38.66 2.43
6 15∶1 8∶1 10 39.55 2.45
7 20∶1 4∶1 30 33.86 1.22
8 20∶1 6∶1 10 31.22 1.19
9 20∶1 8∶1 20 48.11 2.68
包封率
1K 38.513 37.793 35.017
2K 41.150 36.107 43.930
3K 37.730 43.493 38.447
R 3.420 7.386 8.913
载药量
1K 4.107 2.570 2.173
2K 2.830 2.387 3.277
3K 1.697 3.677 3.183
R 2.410 1.290 1.104

膜的铜网上，自然晾干后置透射电镜下观察，见图
1。结果表明，APS 脂质体均匀圆整，为球形或近
球形，脂质体可见明显的双层膜结构，脂质体的平
均粒径＜150 nm。


图 1 APS 脂质体透射电镜图片
Fig. 1 Transmission electron micrograph of APS liposomes
2.8 验证试验
按正交试验优化工艺，将反应原料（卵磷脂、
胆固醇和 APS）数量增加 1 倍，其他条件不变，制
备 3 批 APS 脂质体，测定包封率和载药量，结果分
别为 47.48%、5.23%，47.66%、5.57%，47.37%、
5.39%。
3 讨论
包封率是衡量脂质体内在质量的重要指标之
一，常用的分离方法有葡聚糖凝胶柱色谱法、透析
法、超速离心法、超滤膜滤过法等[14]。葡聚糖凝胶
柱色谱法是较为常用的方法，但是在柱色谱过程中，
洗脱液的体积流量及上样量的多少均对脂质体中分
离游离药物有很大影响。若上样量大，脂质体有拖
尾现象；若洗脱速度快，则提前出峰，分离效果不
好[15]，而上样量和洗脱速度较难控制，需要反复摸
索，并且洗脱时间较长。采用葡聚糖凝胶柱色谱法
分离纳米脂质体时，由于其粒径小，出柱晚，与游
离药物不能很好分离，不能准确测定纳米脂质体（≤
180 nm）包封率[16]。因为 APS 脂质体的平均粒径＜
150 nm，属于纳米脂质体，因此本实验利用鱼精蛋
白凝聚法分离 APS 脂质体，以紫外分光光度法为分
析手段，测定 APS 脂质体药物包封率。这是因为鱼
精蛋白凝聚法的适用范围比较广泛，可以测定不同
溶解性质药物脂质体的包封率，对于不同粒径的脂
质体，通过调节鱼精蛋白用量可较准确地测定脂溶
性药物脂质体的包封率，且具有方法简单、速效的
特点[16]。
脂质体的制备方法很多，常用的方法有薄膜
法、高压均质法、逆相蒸发法和表面活性剂增溶法
等[17]。本试验采用的薄膜分散-微孔滤膜挤压法为薄
膜法和高压均质法两者的简化方法，大大降低了制
备的成本，并且通过此种方法制备的 APS 脂质体的
包封率要高于李淑梅等[18]通过逆相蒸发法和薄膜
法制备的 APS 脂质体。
一般认为提高脂药比可以增大脂质体的包封
率，但本试验中发现，随着脂药比的增大包封率并
未出现显著增大。在试验中，最终选择脂药比为
10∶1，在此条件下，脂质体的粒径和形态均较均匀，
并且 APS 的包封率和载药量均能达到最大值。这是
因为制备脂质体所需的卵磷脂质量（1 g）及 APS
质量浓度（4 mg/mL）一定，随着脂药比的增大，
导致 APS 质量减少，PBS 溶液体积减少，使得脂质
体混悬液较为黏稠，不容易通过 0.22 μm 微孔滤膜，
给滤过增加了困难，并导致粒径和形态不均匀。因
此从实际生产考虑，APS 脂质体的最佳制备工艺为
脂药比为 10∶1，膜材比 8∶1，超声时间 20 min。
包封脂质体最合适的药物是脂溶性好或水溶
性特别好的两种类型药[19]。由于 APS 的化学成分
主要为葡聚糖和杂多糖，而葡聚糖有水溶性的 α-
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（1→4）（1→6）葡聚糖和水不溶性的 α-（1→4）葡聚
糖两种[20]，这就导致了 APS 的溶解度一般，属于水
溶性一般的药物。正是由于 APS 的这种性质，导致
了 APS 脂质体中 APS 的包封率在 50%以下。李淑
梅等[18]和 Deng 等[21]研究也表明，APS 脂质体的包
封率在 50%以下，与本试验结果相似。虽然 APS
脂质体中 APS 的包封率在 50%以下，但是邓英杰
等[19]研究证明了 APS 脂质体比 APS 普通制剂和空
白脂质体具有更加显著的免疫增强效果，说明脂质
体能够显著提高 APS 的药效。因此脂质体作为 APS
的载体是切实可行的。
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