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Simultaneous determination of chromones and coumarins in roots of Saposhnikovia divaricata from Longxi area by HPLC

HPLC法同时测定陇西地区防风中色原酮和香豆素类成分



全 文 :中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 24 期 2013 年 12 月

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HPLC 法同时测定陇西地区防风中色原酮和香豆素类成分
孙晶波 1,郜玉钢 2,张秋菊 3,张连学 2*,金 勇 4*
1. 北华大学药学院,吉林 吉林 132013
2. 吉林农业大学中药材学院,吉林 长春 130118
3. 通化师范学院生命科学学院,吉林 通化 134002
4. 延边大学药学院,吉林 延吉 133000
摘 要:目的 建立 HPLC-DAD 法同时测定并比较分析陇西地区防风类药材中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻
素、亥茅酚苷、补骨脂素、欧前胡素、佛手苷内酯、花椒毒素的量。方法 采用甲醇回流法得到提取物,HPLC-DAD 法
测定提取物中 8 种成分量,乙腈-水梯度洗脱,体积流量 1.0 mL/min,检测波长为 254 nm,柱温为 30 ℃。结果 8 种成分
的回归方程 r 值均在 0.999 2~0.999 9,平均加样回收率在 96.2%~104.1%,RSD 均<3%。防风中以 4 种色原酮为主要成
分,同时含有 4 种香豆素;葛缕子及白花前胡中未检测到色原酮,而香豆素量均高于防风。结论 该方法简便、准确,
重复性好,可用于防风类药材中 8 种成分的测定。陇西地区的 2 种习用防风从 8 种主要成分量上看不能代替防风使用。
关键词:防风;色原酮;香豆素;花椒毒素;佛手苷内酯;欧前胡素;补骨脂素;升麻素;HPLC-DAD
中图分类号:R286.022 文献标志码:A 文章编号:0253 - 2670(2013)24 - 3557 - 04
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.024.024
Simultaneous determination of chromones and coumarins in roots
of Saposhnikovia divaricata from Longxi area by HPLC
SUN Jing-bo1, GAO Yu-gang2, ZHANG Qiu-ju3, ZHANG Lian-xue2, JIN Yong4
1. Pharmaceutical College of Beihua University, Jilin 132013, China
2. College of Chinese Medicinal Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China
3. Department of Biology, Tonghua Normal University, Tonghua 134002, China
4. College of Pharmacy, Yanbian University, Yanji 133000, China
Abstract: Objective To develop an HPLC-DAD method for the simultaneous determination and comparative analysis on the contents of
prim-O-glucosylcimifugin, 4′-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol, cimifugin, sec-O-glucosylhamaudol, psoralen, imperatorin,
bergapten, and xanthotoxin in the roots of Saposhnikovia divaricata from Longxi areas. Methods The extracts were obtained by methanol
reflux method and the contents of the eight compounds were determined by HPLC-DAD. The mobile phase, consisting of acetonitrile-water,
was programmed for a gradient elution. The flow rate was 1.0 mL/min, the detection wavelength was 254 nm, and the column temperature
was 25 ℃. Results Excellent linearity with correlation coefficents (r) of 0.999 2—0.999 9 was obtained. The average recoveries of the eight
compounds were 96.2%—104.1% and all RSD values were less than 3%. The contents of the four coumarins in the roots of S. divaricata were
much less than those four chromones. The contents of the four coumarins in the roots of Carum carvi and Peucedahum ledebourielloides were
more than those in S. divaricta, while no chromones were detected except sec-O-glucosylhamaudol in P. ledebourielloides. Conclusion The
method appears to be simple, accurate, and well reproducible, which could be used for the simultaneous determination of the above-mentioned
eight compounds in S. divaricata. According to the above analysis, C. carvi and P. ledebourielloides could not be used as the succedaneum of
S. divaricata on the basis of the eight compound contents.
Key words: Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk; chromones; coumarins; xanthotoxin; bergapten; imperatorin; psoralen;
cimifugin; HPLC-DAD

收稿日期:2013-08-13
基金项目:国家科技支撑项目(2011BAI03B01)
作者简介:孙晶波(1978—),女,讲师,博士,研究方向为中药活性成分及质量评价。Tel: (0432)64608281 Fax: (0432)64608281
E-mail: sjb781219@163.com
*通信作者: 张连学 Tel: (0431)84532952 E-mail: zlx863@163.com
金 勇 Tel: (0433)2436011 E-mail: jiny8029@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 24 期 2013 年 12 月

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伞 形 科 植 物 防 风 Saposhnikovia divaricata
(Turcz.) Schischk.的干燥根为我国常用的大宗药材
之一,常用于治疗感冒头痛、风疹瘙痒、破伤风等
症[1]。近年来,有关防风中色原酮[2-3]、香豆素[4]、
挥发油[5-6]等有效成分的研究报道越来越多。我国有
些地区以其他植物作为防风使用,因植物来源不同,
其有效成分固然会存在差异,对药效也会产生一定
的影响。综上所述,本实验采用 HPLC-DAD 法对
甘肃陇西地区的栽培防风 Saposhnikovia divaricata
(Turcz.) Schischk. 与 2 种习用防风 [ 华山前胡
Peucedanum ledebourielloides K. T. Fu(水防风)、葛
缕子 Carum carvi L. (旱防风)] 中色原酮、香豆
素类成分及其量进行测定方法研究,以及各药材中
成分的对比研究,以期为后续的药理学研究提供一
定的科学依据。
1 仪器与材料
岛津 LC—20A高效液相色谱仪(LC—20AT 高效
泵、SIL—20A 自动进样器、SPD—M 20A 检测器)。
2010 年 8 月 21 日样品采自甘肃陇西,经吉林农
业大学张连学教授鉴定分别为伞形科植物防风
Saposhnikovia divaricata (Turcz.) Schischk.、葛缕子
Carum carvi L 、 华 山 前 胡 Peucedanum
ledebourielloides K. T. Fu 3 种药材均为人工栽培品。
升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素、
补骨脂素、欧前胡素对照品购自中国药品生物制品
检定所;亥茅酚苷、佛手苷内酯、花椒毒素对照品
购自沈阳鼎国试剂公司。甲醇、乙腈为色谱纯。
2 方法
2.1 对照品溶液的制备
精密称取各对照品适量,加甲醇配制成分别含
升麻素苷 0.126 mg/mL,升麻素 0.032 mg/mL,5-O-
甲基维斯阿米醇苷 0.076 mg/mL,亥茅酚苷 0.048
mg/mL,补骨脂素 0.036 mg/mL,花椒毒素 0.030
mg/mL,佛手苷内酯 0.028 mg/mL,欧前胡素 0.022
mg/mL 的混合溶液,作为混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备
精密称取防风、葛缕子、华山前胡粉末各 0.5 g,
加 20 mL 甲醇,称定质量后于 70 ℃水浴回流提取
2 h,放至室温后称质量,用甲醇补足损失的质量,
摇匀,滤过,即得。
2.3 色谱条件
色谱柱:Inertsil ODS-SP(150 mm×4.6 mm,5
μm);流动相为乙腈-水梯度洗脱,0~10 min,20%~
30%乙腈;11~25 min,30%~55%乙腈;26~40
min,55%~65%乙腈;41~45 min,65%~80%乙
腈;46~50 min,80%~20%乙腈;51~60 min,20%
乙腈;体积流量 1.0 mL/min;检测波长 254 nm;柱
温 30 ℃。
2.4 系统适应性及专属性试验
精密吸取混合对照品溶液和供试品溶液各 10
μL,按“2.3”项下色谱条件分析,结果见图 1。8
种待测成分与其相邻色谱峰的分离度均大于 1.5,各

1-升麻素苷 2-升麻素 3-5-O-甲基维斯阿米醇苷 4-亥茅酚苷
5-补骨脂素 6-花椒毒素 7-佛手苷内酯 8-欧前胡素
1-prim-O-glucosylcimifugin 2-cimifugin
3-5-O-Methylvisammioside 4-sec-O-glucosylhamaudol
5-psoralen 6-xanthotoxin 7-bergapten 8-imperatorin
图 1 对照品 (A)、防风 (B)、葛缕子 (C) 和华山前胡 (D)
的 HPLC 图
Fig. 1 HPLC chromatograms of reference substances (A),
S. divaricata (B), C. carvi (C), and P.
Ledebourielloides (D)







0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40 50 60
0 10 20 30 40 50 60
1
2
3
4
5
6
7
8
1
2
3
4
5 6 7 8
5 6
7
8
4 5 6
7
8
t / min
A
B
C
D
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峰均不受其他组分的干扰,理论塔板数以各色谱峰
计,均>30 000,表明该方法专属性良好。
2.5 线性关系考察
对照品溶液分别自动进样 2、4、6、8、10、12、
14 μL,然后以进样量为横坐标(X)对峰面积(Y)
进行回归处理,计算得线性回归方程、相关系数及
线性范围,结果见表 1。
2.6 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液 1 mL,定容至 10 mL,
按照“2.3”项下条件测定,连续进样 6 次,每次 10
μL,结果,升麻素苷、升麻素、5-O-甲基维斯阿米
醇苷、亥茅酚苷、补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内
酯、欧前胡素峰面积的 RSD 值分别为 0.5%、1.2%、
0.3%、0.8%、2.1%、1.6%、2.4%、0.7%。
表 1 对照品标准曲线、相关系数及线性范围
Table 1 Criteria curves, correlation coefficients, and linearity ranges of reference substances
对照品 标准曲线 r 线性范围 / μg
升麻苷 Y=1 491 097 X+54 886.48 0.999 6 0.252~1.764
升麻素 Y=2 579 884 X+27 60.222 0.999 9 0.064~0.448
5-O-甲基维斯阿米醇苷 Y=2 152 583 X+7 656.238 0.999 9 0.152~1.064
亥茅酚苷 Y=2 536 218 X-8 529.517 0.999 2 0.096~0.672
补骨脂素 Y=4 779 754 X+7 028.035 0.999 9 0.072~0.504
花椒毒素 Y=5 820 020 X-22 484.49 0.999 6 0.060~0.420
佛手苷内酯 Y=5 400 822 X-57 228.08 0.999 5 0.056~0.392
欧前胡素 Y=3 545 010 X-10 983.92 0.999 8 0.044~0.308

2.7 重复性试验
称取 5 份防风,制备供试品溶液,于“2.3”项下
条件测定,8 种有效成分的质量分数的 RSD 值分别为
1.4%、2.8%、0.9%、0.6%、1.3%、2.1%、1.7%、1.1%,
表明该方法的重复性良好。
2.8 稳定性试验
取防风供试品溶液 1 份,分别于 0、2、4、8、
12、24 h 共进样 6 次,记录色谱图。计算 24 h 内 8
种有效成分峰面积的 RSD 值分别为 0.8%、0.3%、
1.4%、2.1%、1.9%、2.1%、0.5%、1.1%,表明供试
品溶液在 24 h 内稳定。
2.9 加样回收率试验
精密称取 6 份已测定的防风药材粉末 0.5 g,分
别加混合对照品溶液适量,按“2.1”项下方法制备
供试品溶液,按“2.3”项下条件测定并计算各成分
的质量分数的回收率。结果 8 种有效成分的平均加
样回收率分别为 100.2%、98.1%、96.2%、103.8%、
96.9%、102.9%、104.1%、97.3%,RSD 值分别为
1.8%、2.1%、2.9%、1.6%、0.7%、3.0%、1.0%、
2. 3%,表明回收率良好。
2.10 样品测定
按照“2.2”项下方法制备供试品溶液,于“2.3”
项下条件测定,分析并计算样品中各成分的质量分
数,结果见表 2。
3 结果与分析
本研究中的药材样品均采自同一地区、同一时
间,防风及 2 种习用防风均为栽培品,三者在本研
究条件下具有可比性。
《中国药典》2010 年版规定[1],防风中升麻素
苷和 5-O-甲基维斯阿米醇苷的总质量分数>
0.24%。本研究结果显示,陇西栽培防风中二者总
质量分数为 0.81%,远高于《中国药典》2010 年版
表 2 防风药材中色原酮与香豆素的量
Table 2 Chromone and coumarin contents in S. divaricata
质量分数 / %
药材 升麻苷 升麻素 5-O-甲基维斯阿米醇苷 亥茅酚苷 补骨脂素 花椒毒素 佛手苷内酯 欧前胡素 总计
防风 0.440 8 0.256 8 0.370 0 0.096 5 0.000 4 0.003 2 0.007 7 0.013 8 1.189 2
葛缕子 — — — — 0.001 3 0.002 0 0.025 7 0.010 5 0.039 5
华山前胡 — — — 0.000 2 0.000 2 0.001 0 0.005 1 0.058 0 0.064 5
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的定量标准;而陇西地区 2 种习用防风葛缕子和华
山前胡在相同条件下均未检测到升麻素苷和 5-O-
甲基维斯阿米醇苷。这一结果表明,以《中国药典》
2010 年版主要成分标准为评价指标,陇西产的 2 种
习用防风无法替代防风而做同一用途使用。升麻素
和亥茅酚苷也是防风药材中研究较多的 2 种色原酮
类成分,本研究结果表明,陇西地区的栽培防风中
升麻素质量分数较高(0.2568%),而亥茅酚苷的质
量分数相对较低,仅占防风总质量的 0.096 5%。2
种习用防风中只有华山前胡中检测到少量的亥茅酚
苷,而其他 3 种色原酮类成分均未检测到。
从香豆素类成分量上看,2 种习用防风中 4 种
香豆素类成分(补骨脂素、花椒毒素、佛手苷内酯、
欧前胡素)的总量均高于防风,其中葛缕子以佛手
苷内酯量最高(0.025 7%),华山前胡以欧前胡素量
最高(0.058 0%)。华山前胡中4种香豆素的总量最
高,约为葛缕子4种香豆素总量的 1.62 倍。从 8 种
成分总量来看,2 种习用防风的质量分数分别为
0.039 5%和 0.064 5%,均显著低于防风(1.189 2%)。
因此,从有效成分的角度来看,习用防风与防风差
别巨大,无法互相替代使用。
4 讨论
香豆素类化合物多具有抗癌、抗炎、镇痛、抗
菌等生物活性。近年来的研究结果表明,中药材防
风中也具有多种香豆素类化合物[7],虽然质量分数
较色原酮类成分少,但其在防风药效发挥过程中也
具有重要作用。因此,本实验亦研究比较了陇西地
区的防风及习用防风中 4 种香豆素类成分的量。
本实验所研究的 4 种色原酮类化合物和 4 种香
豆素类化合物均含有共轭系统,能够满足 DAD 检
测的要求;另外,《中国药典》2010 年版规定的防
风质量控制标准中亦采用 HPLC 法测定升麻素苷和
5-O-甲基维斯阿米醇苷的量,因此,本实验选择了
HPLC-DAD 法定量分析了 8 种成分,并对研究过程
中涉及到的因素进行优化。通过对 8 种对照品进行
全波长扫描,结合已有的文献报道[8],综合分析并
确定检测波长为 254 nm。比较了 2 种常用的 HPLC
洗脱系统甲醇-水和乙腈-水,结果表明,甲醇-水系
统在分析这 8 种成分的过程中基线不平,而乙腈-
水系统无此现象,因此选择了后者。通过对不同梯
度洗脱的结果比较,最终确定了“2.3”项下的梯度
洗脱程序。
采用 HPLC 法同时检测了陇西地区的防风及 2
种习用防风中 4 种色原酮类成分的量及 4 种香豆素
类成分的量,对各方法学指标进行了考察。结果表
明,该方法稳定、可行,能准确、有效的评价防风
药材的质量。
参考文献
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