全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 43 卷 第 2 期 2012 年 2 月

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低温诱导黄花蒿中青蒿素的生物合成及其机制研究
杨瑞仪*，卢元媛，杨雪芹，冯丽玲，曾庆平
广州中医药大学热带医学研究所，广东 广州 510405
摘 要：目的 研究低温处理对黄花蒿中青蒿素及其他萜类合成通路的影响。方法 以 4 ℃为胁迫条件，利用高效液相色
谱法测定青蒿素量；硫酸钛沉淀法和 N, N-二甲基-对-亚硝基苯胺漂白反应分别检测黄花蒿叶片过氧化氢（H2O2）和单线态
氧（1O2）量；紫外分光光度法检测过氧化氢酶（CAT）活性；实时荧光定量 PCR 技术定量分析青蒿素合成途径及竞争途径
关键酶基因的表达。结果 4 ℃处理 4 h 后黄花蒿叶片中 1O2和 H2O2量升高，并伴随着青蒿素量和 CAT 活性逐步提高，4、
24、48 h 后青蒿素量分别提高 20%、65%、80%；4 ℃处理 24 h 后，青蒿素合成相关基因（HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、
CPR 和 DBR2）的表达普遍上调，其中 ADS 基因的表达提高 16 倍；而青蒿素合成竞争途径酶（β-石竹烯合酶）基因（CS）
表达则下调近 20 倍。结论 低温刺激可能通过产生高浓度活性氧（ROS）促进青蒿素合成前体转化，上调青蒿素合成相关
基因表达并抑制竞争途径基因表达等途径促进青蒿素合成。
关键词：黄花蒿；青蒿素；低温诱导；活性氧；基因表达
中图分类号：R282.1 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2012)02 - 0350 - 05
Biosynthesis of artemisinin in Artemisia annua induced by low temperature
and its mechanism
YANG Rui-yi, LU Yuan-yuan, YANG Xue-qin, FENG Li-ling, ZENG Qing-ping
Tropical Medicine Institute, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510405, China
Abstract: Objective To investigate the effects of low temperature on the biosynthesis of artemisinin and other terpenoids in
Artemisia annua. Methods After 4 ℃ treatment, A. annua leaves were collected for artemisinin analysis by HPLC. Hydrogen
peroxide (H2O2) and singlet oxygen (1O2) production were detected by Ti(SO4)2 precipitation and the means of bleaching of N,
N-dimethylnitrosoaniline. The catalase (CAT) activity was determined by ultraviolet spectrophotometry. The gene expressions of key
enzymes in artemisinin biosynthetic and competitive pathways were quantitatively assayed by real time fluorescence quantitative
polymerase chain reaction (PCR). Results At 4 ℃ after treatment for 4 h, the burst of 1O2 and H2O2 was followed by the increase of
CAT activity and artemisinin content. The concentrations of artemisinin were 20%, 65%, and 80% higher than those of the control
group after treatment for 4, 24, and 48 h, respectively. The expression levels of artemisinin biosynthetic genes, comprising HMGR,
FPS, ADS, CYP71AV1, CPR, and DBR2, were up-regulated compared with the control group at 4 ℃ after treatment for 24 h. The
increment of ADS mRNA level was 16 times higher than those under 25 ℃. Whereas the expression of β-caryophyllene synthase (CS)
gene encoded the competitive enzyme utilizing the common precursor dramatically decreased about 20-fold. Conclusion These
results indicate that low temperature could induce artemisinin biosynthesis by increasing the conversion of the precursors into
artemisinin caused by the burst of reactive oxygen species (ROS), by the up-regulating the expression of genes involved in artemisinin
biosynthesis, and by down-regulating the expression of gene involved in competitive pathway.
Key words: Artemisia annua L.; artemisinin; low temperature-induced; reactive oxygen species (ROS); gene expression

青蒿素（artemisinin）是我国科学家于 20 世纪
70 年代首次发现的具有独特过氧桥结构的倍半萜
内酯。青蒿素及其衍生物主要用于治疗疟疾，尤其
是抗药性和脑型疟疾[1]。由于其安全性、有效性和
速效性，以青蒿素为基础的联合治疗方案被世界卫
生组织推荐在世界各大主要疟疾流行区推广应用。
除此以外，青蒿素类药物对于血吸虫病、乙型肝炎、
白血病、乳腺癌、结肠癌、小细胞肺癌等也具有一
定的疗效，已被制成多种剂型[2]。因此，青蒿素的
药用价值非常大。就目前而言，从天然植物中提取

收稿日期：2011-03-15
基金项目：广东省自然科学基金资助项目（9145624536-4000003）
作者简介：杨瑞仪（1972—），女，广东省广州市人，医学博士，副研究员，主要从事中药生物工程和分子药理学研究。
*通讯作者 杨瑞仪 Tel: (020)36585100 E-mail: rysyry@gzhtcm.edu.cn
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青蒿素是商品化生产的唯一途径，而黄花蒿
Artemisia annua L. 是目前发现的唯一能合成青蒿
素的天然植物资源[3]，但青蒿素在黄花蒿中的量较
低，一般只有干质量的 0.1%～1%。
有学者认为，在双氢青蒿酸前体向青蒿素转化
的过程中，青蒿素可能承担着活性氧（ reactive
oxygen species，ROS）自由基储备池的角色，双氢
青蒿酸则可能作为抗氧化剂淬灭 ROS 防止氧化胁
迫造成的细胞损伤[4]。Wallaart 等[5]发现经过夜霜季
节后，青蒿素量升高并伴随着双氢青蒿酸的下降，
推测霜冻可能作为一种压力条件启动了双氢青蒿酸
向青蒿素的转化。在环境胁迫（冷、热、强光、干
旱、盐碱等）下，植物中由活性氧造成的氧化胁迫
是一种普遍现象。虽然氧化胁迫诱导植物次生代谢
产物合成的研究已先后在人参、红豆杉、丹参、长
春花中报道，但关于氧化胁迫与青蒿素合成之间相
互关系的研究相对较少。本研究以低温为胁迫条件，
研究其对青蒿素合成的影响，通过测定 H2O2、单线
态氧（1O2）、过氧化氢酶（CAT）等指标，探讨氧
化胁迫介导黄花蒿高产青蒿素的分子机制。
1 材料
黄花蒿Artemisia annua L. 种子（重庆酉阳，华阳
2 号）经广州中医药大学青蒿研究中心黄荣岗鉴定。青
蒿素对照品（美国 Sigma-Aldrich 公司，批号
13806ED）；N, N-二甲基-对-亚硝基苯胺（日本东京化
成工业株式会社，批号 3Q58C）；组氨酸（美国
Sigma-Aldrich 公司，批号 423834）；RNAprep pure 植
物总RNA 提取试剂盒（天根生化科技北京有限公司）；
RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit
（Fermentas 中国公司）；SYBR Green Realtime PCR
Master Mix（日本Toyobo 公司产品）；引物由 Invitrogen
公司合成；其他试剂均为国产分析纯。
P680 高效液相色谱仪（美国 Dionex 公司）；
Ultrospec 3300 pro 紫外/可见光分光光度计（美国
GE 公司）；ABI7300 实时荧光定量 PCR 仪（美国应
用生物系统公司）；SPX—250B—G 微电脑光照培养
箱（上海博迅实业有限公司）。
2 方法
2.1 植物培养及低温处理
黄花蒿种子用 70%乙醇浸润 30 s，3% NaOCl
浸泡 30 min，无菌水漂洗 4～5 次，均匀散播在 1/2
MS 培养基润湿的滤纸上，避光发芽。种子发芽后
移至含 0.8%琼脂的 1/2 MS 固体培养基，25 ℃光照
培养（光照周期：16 h 光/8 h 暗）。种子发芽 30 d
后，选取长势均一的无菌苗移至 4 ℃光照培养箱进
行低温处理（光照周期：16 h 光/8 h 暗），分别在 0、
4、24、48 h 取叶片进行检测。
2.2 青蒿素的测定
青蒿素的测定参照文献方法[6]，叶片于 50 ℃
烘箱中烘 24 h，烘干后研成细粉，过筛，精确称取
0.100 g 于 10 mL 量瓶中，加入丙酮 10 mL，超声提
取 30 min，用丙酮补足至 10 mL。提取液滤过后进
样检测。同时，精确称取青蒿素对照品 0.010 g，
加入甲醇溶解配成 0.298 mg/mL 溶液，分别取 6、
10、14、20、30 μL 进样，绘制标准曲线为 Y＝0.483 3
X＋0.007 9，线性范围为 1.788～8.940 μg。色谱条
件：Phenomenex BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5
μm），以乙腈-水（48∶52）为流动相，体积流量 1
mL/min，柱温 30 ℃，检测波长 216 nm。以每克叶
片干质量所含青蒿素量来表示青蒿素量（mg/g）。
2.3 H2O2和 1O2 测定
H2O2 的测定参照硫酸钛沉淀法[7]，以每克叶片
（鲜质量）中所含 H2O2 量来表示其水平，单位为
μmol/g。1O2的检测参照文献方法[6]，反应液中加入
N, N-二甲基-对-亚硝基苯胺作为 1O2 的吸收剂，通
过 N, N-二甲基-对-亚硝基苯胺的漂白反应来检测
1O2 的生成。5 mL 反应液（45 mmol/L pH 7.1 PBS、
10 mmol/L 组氨酸、50 μmol/L N, N-二甲基-对-亚硝
基苯胺）中加入 150 mg 剪碎的叶片，空白对照不
加叶片。光照（3 000 lx）下反应 1 h，反应液 10 倍
稀释后读取波长 440 nm 处的吸光度（A）值。计算
低温处理相对于对照条件（25 ℃）1O2 的生成率。
生成率=（A440 (空白)－A440 (4 ℃)）/（A440 (空白)－A440 (25 ℃)）
2.4 CAT 活性测定[8]
精确称取 0.500 g 鲜叶片，加入少量石英砂、2
mL 2%聚乙烯吡咯烷酮、100 mg CaCO3，冰浴研磨
成匀浆，4 ℃ 12 000×g 离心 5 min，取上清加入
50 mmol/L pH 7.0 磷酸缓冲液定容至 10 mL，此为
CAT 粗酶提取液。取 10 倍稀释的 CAT 粗酶提取液
1.00 mL，加入 10 mmol/L H2O2 2.00 mL，迅速混匀，
5 min 内连续读取波长 240 nm 处的 A 值，计算每
分钟的 A 值变化（ΔA240）。以 1.00 mL 10 倍稀释的
CAT 粗酶提取液与 2.00 mL H2O 混合液为空白对
照。用每克叶片（鲜质量）每分钟催化 H2O2 分解
量来表示 CAT 活性，单位为 μmol/(min·g)。
2.5 实时荧光定量 PCR 检测基因表达
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鲜叶片 100 mg，按 RNAprep pure 植物总 RNA
提取试剂盒（Tiangen）说明书提取总 RNA。取 1 μg
总 RNA，按照 RevertAidTM H Minus First Strand
cDNA Synthesis Kit（Fermentas）说明书进行逆转录
反应，合成 cDNA。以 10 倍稀释的 cDNA 为模板与
SYBR Green Real time PCR Master Mix（Toyobo）
混合，RTFQ-PCR 反应在 ABI7300 实时荧光定量
PCR 仪上进行。各基因引物见表 1，由 Invitrogen
公司合成。以 actin 基因为内参，以目的基因与 actin
mRNA 拷贝数的比值表示基因的相对转录水平。
表 1 定量 PCR 引物
Table 1 Primers for real time fluorescence quantitative PCR
基 因 GenBank 收录号 引 物 引物序列 扩增片段 / bp
HMGR RU14625 HMGR-3 5’-GCACAGTTGGAGGAGGGACA-3’ 100
HMGR-4 5’-TGAGCGTTTGAGCCTGGTG-3’
FPS U36376 FPS-3 5’-TTCTTTCATCTGCCCTTGGTT-3’ 100
FPS-4 5’-GGTTGCCCTCTGCGTGTATG-3’
ADS DQ241826 ADS-7 5’-AGTTTGTTAGAAACCTGATGGTTGAA-3’ 105
ADS-8 5’-GGTTAGCACCGCCAGTAATGA-3’
CYP71AV1 DQ872632 CYP71AV1-3 5’-TGGTTCTGCCAAGAGAGTGC-3 102
CYP71AV1-4 5’-GGTCCCTATTTATCGCAAAGACG-3’
CPR DQ984181 CPR-3 5’-GATAACGAAGACGGGACACCA-3’ 102
CPR-4 5’-GCTCAAAACATCGGCATAGGA-3’
DBR2 EU848577 DBR-5 5’-CTCAAGGGGATGCTGATTTG-3’ 150
DBR-6 5’-GGTAATCCGTGTACCCAACG-3’
SQS AY445506 SQS-3 5’-CGGACTAAAACAATGGCTGATG-3’ 104
SQS-4 5’-GTGATGGTCGTTTGGGCATT-3’
FS AY835398 FS-3 5’-CAGCCACAAGGAGGAACAAG-3’ 295
FS-4 5’-CATAGGGTGAACGAAGAACGA-3’
CS AF472361 CS-3 5’-CAGGTGGTGGAAAGGTCTTG-3’ 229
CS-4 5’-CGACCACCTTTGAATTGCTT-3’
EPS AJ001539 EPS-5 5’-GCAAGATGGGCAAAAGAAGA-3’ 166
EPS-6 5’-TGACAAGAGGAGGATTGGTGA-3’
actin EU531837 actin-5 5’-GCATCCCGTTCTTTTGACTG-3’ 317
actin-6 5’-GCTCTGCTGTGGTGGTGAA-3’

2.6 数据分析
每个指标的测定均重复 6 个样本，每个样本
测定均重复 3 次。数据采用 SPSS 11.5 软件进行
统计，采用配对 t 检验进行显著性分析。
3 结果
3.1 低温诱导青蒿素生物合成
由图 1 可以看出，经过 4 ℃低温处理 4 h 后，
青蒿素量开始上升（P＜0.05），24 h 后上升幅度加大
（P＜0.01）。与对照（25 ℃）培养相比，冷刺激 4、
24、48 h 后青蒿素量分别提高 20%、65%、80%。
3.2 低温对黄花蒿 1O2和 H2O2 生成的影响
在 4 ℃处理过程中，黄花蒿叶片 1O2 和 H2O2
的量都是先升高后降低，在 4 h 后即达到最大值。
以 1O2 相对生成率（4 ℃/25 ℃）来表示低温处理
下 1O2 的生成变化，处理 4 h 后 1O2 上升 1 倍，随
后下降，在 24、48 h 分别比对照升高 40%、30%
（图 2）；H2O2 量在 4 h 时为对照的 1.6 倍，并维持
至 24 h，处理 48 h 后，H2O2 量回落至略高于对照
水平（图 3）。

与 25 ℃组比较：* P＜0.05 ** P＜0.01，下同
*P<0.05 **P<0.01 vs 25 ℃ control group, same as below
图 1 低温对青蒿素合成的影响
Fig. 1 Effects of low temperature on artemisinin synthesis
3.3 低温对 CAT 活性的影响
由图 4 可以看出，与 25 ℃对照相比，CAT 活
性在 4 ℃处理 4 h 后提高了 2.2 倍，并进一步升高，
在 24 h 达到最大值，为对照的 5.3 倍。48 h 后 CAT
活性有所下降，但维持在对照的 2.8 倍水平。
3.4 低温诱导青蒿素生物合成基因表达
经过 4 ℃低温处理 24 h 后，青蒿素合成相关基
因：HMGR、FPS、ADS、CYP71AV1、CPR 和 DBR2
0 h 4 h 24 h 48 h
10
8
6
4
2
0
*
** **
青
蒿
素
/
(m
g·g
−1
)
*
** **25 ℃
4 ℃
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图 2 低温处理对 1O2生成率的影响
Fig. 2 Effects of low temperature treatment
on 1O2 production rate

图 3 低温处理对 H2O2生成量的影响
Fig. 3 Effects of low temperature treatment on H2O2 production

图 4 低温处理对 CAT 活性的影响
Fig. 4 Effects of low temperature treatment on activities of CAT
的表达都普遍上调（表 2）。其中 ADS 和 HMGR 的
上调幅度较大，转录水平比对照增加 16 倍和 3.2 倍。
CYP71AV1、DBR2、CPR、FPS 的 mRNA 水平分别
为对照的 2.8、2.5、1.9、1.5 倍。
3.5 低温对其他萜类合成基因表达的影响
在黄花蒿萜类合成中，FPP 不仅是 ADS 的底
物，同时也是 SQS、CS、FS 以及 EPS 的底物。经
过 4 ℃低温处理 24 h 后，ADS 基因表达大幅上调
（表 3）的同时，各竞争途径的萜类合酶基因的表达
在低温诱导条件下也呈现不同的变化。从表 3 可见，
SQS 和 FS 基因对低温诱导无应答，诱导前后表达
水平无明显差异，而 EPS 基因的表达提高 3 倍，CS
基因的表达则显著下降近 20 倍。
4 讨论
植物的大多数生理生化过程都有 ROS 的产生。
一般认为 ROS 是一种有害的氧代谢中间物，是引起
细胞结构和功能损伤的主要因素；但同时 ROS 也是
一种普遍存在的信号分子，参与植物的防御反应、
基因表达调控等。Wallaart 等[4,9]从黄花蒿中检测到
双氢青蒿酸及其氢过氧化物，首次提出双氢青蒿酸
可能充当 ROS 清除剂的假设，并认为双氢青蒿酸
可能通过参与氧自由基催化的非酶促反应转化成
青蒿素。双氢青蒿酸等青蒿素合成前体在黄花蒿中
的量相对较为丰富，但进一步的过氧化反应似乎成
为青蒿素合成的“瓶颈”，1O2 等 ROS 在此过程中
起重要作用。有研究发现，在黄花蒿褐变的老叶中
检测到 1O2 浓度爆发式增长，同时青蒿素前体转化
成青蒿素的速率加快，青蒿素产量提高[10-11]。一些
表 2 低温处理对青蒿素生物合成基因表达的影响 ( 3=± n , sx )
Table 2 Effects of low temperature treatment on gene expressions of artemisinin biosynthesis ( 3=± n , sx )
相对转录水平 组 别
HMGR FPS ADS CYP71AV1 CPR DBR2
25 ℃ 0.08±0.03 0.11±0.02 0.17±0.04 0.05±0.02 1.58±0.25 2.05±0.33
4 ℃ 0.35±0.03** 0.28±0.18* 2.92±0.19** 0.13±0.03** 2.95±0.29** 5.04±1.68**

表 3 低温处理对黄花蒿萜类合成基因表达的影响
( 3=± n , sx )
Table 3 Effects of low temperature treatment on gene expres-
sions of terpenoids biosynthesis ( 3=± n , sx )
相对转录水平 组 别
SQS CS FS EPS
25 ℃ 0.51±0.06 0.68±0.19 0.29±0.05 0.31±0.14
4 ℃ 0.54±0.18 0.03±0.01** 0.32±0.05 1.21±0.39**
人工模拟的胁迫条件，如高浓度盐和重金属[12]、寡
糖诱激子[13]等也同样可以通过促进 ROS 生成而有
利于青蒿素的积累。在本实验中，经过 4 ℃低温处
理后，黄花蒿中 1O2 和 H2O2 浓度逐渐上升，但 48 h
后伴随着 CAT 活性和青蒿素量的提高，浓度开始下
降。Pu 等[7]用水杨酸处理黄花蒿发现 H2O2 和超氧
阴离子浓度在 4 h 迅速升高，促使双氢青蒿酸向青
蒿素转化，而后随着青蒿素量的逐渐上升而逐步下

0 h 4 h 24 h 48 h
400

3 00

200

100

C
AT
活
性
/
(μ
m
ol
·m
in
−1
·g−
1 )
***
**
25 ℃
4 ℃


0 h 4 h 24 h 48 h
0.30
0.25
0.20
0.15
0.10
0.05
0
H
2O
2 /
(μ
m
ol
·g
−1
)
*
* 25 ℃
4 ℃

0 h 4 h 24 h 48 h
250
200
150
100
50
0 1
O
2
相
对
生
成
率
/
%

*
*
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降，与本课题组的结果相符，揭示 ROS 可能作为信
号分子促进青蒿素的转化。
另外，本研究还发现经过低温处理后青蒿素合
成相关基因的表达普遍上调，尤其是编码青蒿素特
异合成途径的第一个关键限速酶——ADS 的基因的
表达上升幅度最大。本课题组在以往的研究中也发
现 4℃处理黄花蒿苗 30 min 后，ADS、CYP71AV1 和
CPR 的表达量上调[14]，但上调幅度不如作用 24 h 高。
在蛋白表达水平上也证实，经过冷诱导后 ADS 与
CYP71AV1这两个酶的浓度分别上升50%和80%[15]。
用水杨酸处理黄花蒿同样也可见ADS和HMGR表达
量提高，而青蒿酸、双氢青蒿酸和青蒿素量也相应
提高[7]。可见，低温胁迫可通过直接诱导青蒿素合成
相关基因表达而促进青蒿素合成。在黄花蒿中，以
FPP 为底物可以在不同的萜类合酶的作用下开始不
同的萜类合成，调控这些萜类合酶的表达，比如过
量表达 ADS 基因，同时抑制与青蒿素合成竞争底物
的酶的基因表达，对于增加青蒿素生物合成途径的
代谢流量，促进青蒿素合成有积极的意义。本课题
组利用农杆菌介导的基因转化法将反义 SQS 整合于
黄花蒿基因组，通过表达反义 SQS 来阻遏 SQS 表达，
减少类固醇合成途径对底物 FPP 的竞争性利用，获
得了高产青蒿素的转基因株，其 SQS 表达水平最高
下降 90%，ADS 表达水平为原来的 3 倍，表明在压
力作用下萜类合成的代谢流量会发生变化[16]。本研
究发现，低温条件一方面可促进青蒿素合成途径
ADS 的表达，另一方面可抑制青蒿素合成竞争途径
β-石竹烯合酶基因的表达，以改变代谢流方向。
综合起来，短暂的低温刺激可能通过以下途径
提高青蒿素的合成：（1）产生高浓度 ROS 促进青蒿
素合成前体的转化；（2）诱导青蒿素合成相关基因
尤其是特异酶基因表达，促进青蒿素前体合成；（3）
刺激青蒿素生物合成途径，抑制竞争途径，藉此增
加青蒿素合成途径的代谢流量。病虫害感染、创伤、
冷、热、强光、缺氧、干旱、盐碱等氧化胁迫条件
都能诱发 ROS 生成，研究结果对于今后利用氧化胁
迫条件提高青蒿素产量有重要意义。
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