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肾炎宁对 IgA肾病大鼠肾脏局部肾素血管紧张素系统的影响
郭登洲1 ,边 东1 ,王月华1 ,陈志强1 * ,韩培英2 ,孙玉凤1 ,靳跃芳2
( 1 河北医科大学,河北 石家庄 050011; 2 石家庄第九医院, 河北 石家庄 050000)
摘 要:目的 探讨肾炎宁对 IgA 肾病大鼠肾脏局部肾素血管紧张素系统的影响。方法 将 SD 大鼠随机分为 4
组:对照组、模型组、阳性对照组 (贝那普利+ 氯沙坦)、肾炎宁组。按各组相应药物剂量 ig 给药, 于第 15 周末行
IgA 免疫荧光检测, 并用放射免疫法检测大鼠肾组织 Ang 的量, 采用紫外分光光度法测定血管紧张素转换酶
( ACE) 活性,采用原位杂交法测定 AT 1R 的表达。结果 肾炎宁组、阳性对照组与模型组比较 IgA 免疫荧光强
度、Ang 量、ACE 活性和 AT 1R 的表达均显著下降 ( P< 0 05)。结论 肾炎宁可能通过抑制肾脏局部肾素血管
紧张素系统,发挥对 IgA 肾病的治疗作用。
关键词:肾炎宁; IgA 肾病; 肾素血管紧张素系统
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05080204
IgA 肾病是目前最常见的原发性肾小球肾炎之
一, 15% ~ 20% 的患者在确诊后 10 年内、30% ~
35% 的患者在确诊后 20 年内进入终末期肾病
( ESRD)
[ 1] 。多项临床研究表明, 血管紧张素转换
酶抑制剂 ( ACEI) 和血管紧张素转换酶1型受体拮
抗剂 ( ARB) 在缓解 IgA 肾病肾损害、抑制肾局部
肾素血管紧张素系统 ( RAS) 途径,从而减少尿蛋
白漏出,推迟 ESRD 发挥着重要的作用[ 2]。但由于
两者使用的局限性, 以及临床实际效果的差异性, 亟
待寻找更有效的治疗手段。
根据中医理论,探究本病病因病机, 提出!益气
养阴化瘀祛湿法∀, 并依法组方肾炎宁治疗 IgA 肾
病,临床取得了较好的疗效[ 3, 4]。同时前期也通过整
体实验及离体细胞培养证明该方对 IgA 肾病的部分
致病因素具有调节作用[ 5~ 7]。鉴于此, 本研究试图通
过观察肾炎宁对 IgA 肾病肾组织 RAS 部分组分的
影响,以进一步探讨其临床药效及部分作用机制。
1 材料
牛血清白蛋白 ( bo vine serum albumin, BSA) ,
购自上海晶美生物科技有限公司; 脂多糖 ( LPS,美
国 SIGMA 公司) ;异硫氰酸 ( FIT C) 标记羊抗大鼠
IgA 抗体 ( Serotec 公司)。A ng 放射免疫试剂盒
(北京北方生物技术研究所) , ACE 检测试剂盒 (海
军总医院科技开发中心) , AT 1R 原位杂交试剂盒
(武汉博士德生物技术有限公司)。Olympus 光学
显微 镜 ( 日本 Olympus 公司 ) , 冰冻 切片机
( Bright , 5030) ,荧光显微镜 ( Olympus BX60) , 752
型 Spectr um 紫外分光光度计 (上海光谱仪器有限
公司)。
清洁型 SpragueDaw ley ( SD) 大鼠 48 只, 河
#802# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091016 基金项目:河北省科技攻关计划项目 ( 00276205D) ; 河北省科学技术研究与发展计划项目 ( 092061106D)作者简介:郭登洲,博士研究生,主任医师,主要从事中西医结合肾脏疾病的临床与基础研究。
* 通讯作者 陈志强 T el: 13832110168 Em ail : w angyueh ua@ m edmail. com. cn
北医科大学实验动物中心提供, 动物合格证编号:
SCXK (冀) 20081003, 体质量 220~ 260 g。
肾炎宁由黄芪、党参、茯苓、白术、女贞子、旱莲
草、生地黄、白茅根、川芎、白花蛇舌草、三七粉、仙鹤
草等组成,由河北医科大学附属中医院药房提供, 按
比例称取后常规煎煮 2 次, 合并煎液浓缩溶液至每
毫升药液含生药量 3 82 g, 由河北医科大学附属中
医院制剂室提供;氯沙坦由杭州默沙东制药有限公
司提供,盐酸贝那普利由北京诺华制药有限公司提
供。大鼠给药剂量按药理学实验动物给药方法计
算,均为成人剂量的 10 倍。
2 方法
2 1 造模、分组及给药: 按随机数字表法将实验动
物分为造模组 36 只,对照组 12 只。造模组参考汤
颖等[ 8] IgA 肾病造模改良方法, 运用脂多糖+ 牛血
清白蛋白+ 四氯化碳 ( CCl4 ) 联合造模。隔天 ig 免
疫原 BSA 400 mg/ kg, 较常用剂量增加1倍,持续 6
周; sc 蓖麻油 0 5 mL+ CCl4 0 1 mL,每周 1次, 持
续 9周 ( CCl4注射方式由既往的 ip 改为 sc,剂量为
诱导肝纤维化量的 1/ 3 ) , 并联合运用脂多糖
( LPS) ,分别于第 6、8 周尾 iv 0. 05 mg。同时对照
组 ig 蒸馏水, 尾 iv 及 sc生理盐水。9周后, 将造模
组动物按随机数字表分成模型组、阳性对照组 (贝
那普利+ 氯沙坦组) 及肾炎宁组各 12 只。肾炎宁
组及阳性对照组自第9周起 ig 成人剂量的 10倍剂
量, 即氯沙坦 10 mg/ kg, 贝那普利 4 mg/ kg, 肾炎宁
24 g/ kg (前期研究中,观察到以此剂量肾炎宁灌服
IgA 肾病大鼠, 证实其能够降低 IgA 肾病大鼠蛋白
尿、血尿, 并通过降低转化生长因子1、结缔组织生
长因子及巨噬细胞移动抑制因子发挥对 IgA 肾病
的治疗作用) ,每天 1次,连续 6 周。模型组及对照
组 ig 等量蒸馏水,所有大鼠在整个实验期间均予以
标准饮食。
2 2 IgA 免疫荧光检查: 实验结束时用水合氯醛麻
醉大鼠,取外围的肾皮质一部分做冰冻切片进行免
疫荧光 IgA 检查,免疫荧光强度分级半定量标准参
照国内外通用的 5级法分级: ! ∃ ∀低倍镜下不能显
示,高倍镜下似乎可见; ! + ∀低倍镜下似乎可见, 高
倍镜下可见; ! + + ∀低倍镜下可见,高倍镜下清晰可
见; ! + + + ∀低倍镜下清晰可见, 高倍镜下耀眼;
! + + + + ∀高倍镜下刺眼。
2 3 放射免疫法检测肾组织血管紧张素 ( Ang
) : 取大鼠肾组织约 200 mg, 冷生理盐水冲洗后加
入 0 1 mmo l/ L 醋酸 1 mL,研磨匀浆离心后取上清
液 (母液) - 20 % 保存备用。取 0 5 mL 母液加入
蒸馏水 4 5 mL, 配制成 1% 肾组织匀浆液, 于放免
测量仪上检测肾组织 Ang 。
2 4 紫外分光光度法检测肾组织 ACE 活性:取大
鼠肾组织约 100 mg, 加入 5倍体积的冷 0 1 mo l/
mL TrisHCl缓冲液 ( pH 7 8) ,冰浴中充分研磨匀
浆离心后取上清液。利用马尿酸甘氨酰苷氨酸在
ACE 的作用下水解成马尿酸及甘氨酰苷氨酸的特
性,用醋酸乙酯提取马尿酸,采用紫外分光光度法测
定马尿酸量,从而间接测定 ACE 活性。
2 5 原位杂交检测肾组织血管紧张素 1型受体
( AT 1R) 的表达: 石蜡切片常规脱蜡至水, 3%
H 2O 2灭活 15 min, 滴加复合消化工作液 30 min,滴
加 10 L 预杂交液, 37 % 1 h,滴加 15 L 探针,盖
专用盖玻片,湿盒内 42 % 过夜,滴加生物素标记的
鼠抗地高辛,湿盒内 37 % 1 h,滴加生物素过氧化
物酶复合物,湿盒内 37 % 40 m in, DAB 显色, 苏木
精复染, 脱水,透明,封片。原位杂交结果采用北京
航天大学 Motic Med 6. 0 病理图像分析系统分析,
每例各选 10 个肾小管间质视野, 测定其阳性面积
占整个视野面积的百分比 (阳性面积/视野总面
积 & 100%) ,取平均值。
2 6 统计学处理: 全部数据采用 SPSS 13 0 统计
软件进行处理, 计量资料以 x ∃ s 表示,组间两两比
较采用 t 检验法。
3 结果
3 1 造模情况: 除对照组外,各实验组大鼠在造模
时均有不同程度的食欲减少, 精神萎靡, 且在注射
LPS 后第 2 天情况加重。模型组在第 1 次注射
LPS 后第 2天死亡 1只,第 2次注射 LPS 后第 2天
死亡 2只,治疗组亦是在两次注射脂多糖后第 2天
分别死亡 1只,死亡大鼠均已从实验中剔除。
3 2 肾组织免疫检查:对照组大鼠肾小球系膜区无
IgA 沉积。模型组表现为系膜区弥漫性颗粒状 IgA
沉积,个别呈团块状,荧光强度为 + + ~ + + + ,表
明模型复制成功。两治疗组 IgA 沉积较模型组减
轻,荧光强度为 + ~ + + ,肾炎宁组荧光强度略弱
于阳性对照组 (图 1)。
3 3 肾组织 Ang 检测: 模型组、阳性对照组和肾
炎宁组 Ang 量比对照组显著升高 ( P < 0 01,
0 05) ; 而与模型组比较, 阳性对照组和肾炎宁组则
显著降低 ( P< 0 01) ; 两治疗组比较,阳性对照组比
肾炎宁组略低,但无统计学差异 (表 1)。
3 4 肾组织 ACE活性检测: 模型组比对照组 ACE
#803#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
图 1 各组肾组织 IgA 免疫荧光检测
Fig. 1 IgA Immunof luorescence assay of nephridial tissue in every group
活性明显升高 ( P< 0 01) ; 而两治疗组与对照组比
较,则无明显差异; 与模型组比较,两治疗组则显著
下降 ( P< 0 01) ;两治疗组相比较,阳性对照组低于
肾炎宁组,但无统计学差异 (表 1)。
表 1 各组 Ang 、ACE、AT1R 检测结果
Table 1 Determination of Ang content, ACE activity,
and AT1R expression in every group
组 别
剂量/
( g# kg- 1) 例数
Ang /
( pg #mg- 1)
ACE/
U
AT 1R/
%
对照 - 12 769∃ 1 59 17 33 ∃ 2 59 6 49 ∃ 115
模型 - 9 1528∃ 2 87* * 27 80 ∃ 3 83* * 40 70 ∃ 533* *
阳性对照 (氯沙 0 01+ 0 004 11 947∃ 1 85* ∋ ∋ 16 28 ∃ 2 53 ∋ ∋ 18 74 ∃ 363* * ∋ ∋
坦+ 贝那普利)
肾炎宁 24 11 953∃ 2 06* ∋ ∋ 18 63 ∃ 2 66 ∋ ∋ 20 44 ∃ 472* * ∋ ∋
与对照组比较: * P< 005 * * P< 0 01
与模型组比较: ∋ ∋P < 0 01
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s cont rol group
∋ ∋P< 0 01 v s m odel group
3 5 肾组织 AT 1R 的表达: AT 1R 主要表达于肾
小管上皮细胞内。对照组肾小管上皮细胞可见稀疏
的棕黄色颗粒;与对照组比较, 模型组、阳性对照组
和肾炎宁组的表达明显加强 ( P< 0 01) ; 而两治疗
组的表达则比模型组有显著下降 ( P< 0 01) ;两治
疗组比较,无明显差异 (表 1、图 2)。
4 讨论
IgA 肾病是一组以 IgA 或以 IgA 为主的免疫
复合物在肾小球系膜区沉积,临床上以血尿,伴或不
伴蛋白尿为常见表现的临床病理综合征。其发病率
逐年递增, 随着对 IgA 肾病研究的日益深入, 已知
其预后并不乐观。本病在中医内科中主要归属于
!尿血∀、!腰痛∀、! 水肿∀范畴, 多数患者起病隐匿。
其发病与多种因素有关。但其基本病机是本虚标
实。(金匮要略注)云: !五脏六腑之血, 全赖脾气统
摄∀。脾有统摄血流在经脉中流行、防止溢出脉外的
图 2 各组 AT1R 原位杂交检测
Fig. 2 AT1R Hybridisation in situ assay in every group
功能。脾的功能正常则血不会溢出脉外。反之, 脾
气亏虚、统血不力,即可导致尿血。肾气虚惫, 失于
封藏,也致尿血日久不愈,蛋白等精微物质从尿中流
失。肾阴亏虚, 阴虚火旺,灼伤脉络亦可见精微物质
从尿中流失。脾虚不能运化水湿,肾虚不能化气行
水,精微外泄而水液停滞, 则见尿浊浮肿; 病情继续
发展,气血俱伤,脾肾失养, 浊毒内停,三焦受阻, 升
降失常,水湿泛滥。病程日久, 肾之络脉气阴两虚,
气虚无力运血而致血瘀; 阴虚火旺, 煎熬津液,津亏
液少则血液黏稠不畅而致阴虚血瘀, 肾络瘀阻, 致使
肾体受损, 肾用失司, 导致本病的发生。总之, IgA
肾病形成机制是非常复杂的,既有脾肾脏腑功能失
调 , 至气阴两虚, 又有湿浊瘀血作祟。鉴于此提出
!益气养阴化瘀祛湿法∀治疗本病, 并依法组方肾炎
宁,临床取得了较好的疗效[ 3, 4]。方中黄芪益气固
表,利水消肿,且黄芪大补宗气, 使气旺血行。党参、
#804# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
茯苓、白术补中、健脾、益气、祛湿; 白茅根、生地黄、
女贞子、旱莲草养阴补肾、凉血止血;川芎活血行气;
三七粉、仙鹤草活血止血。该方标本兼顾, 虚实并
重,确能切中病机。
研究发现, IgA 肾病病理性 pIgA1 (循环聚合
型 IgA1) 分子可在体外直接上调肾系膜细胞肾素、
Ang 及转化生长因子 ( T GF) 等的表达, 而上
述现象在其他肾小球肾炎产生的 pIgA1 分子中并
未出现。从而提示, IgA 肾病病理性 pIgA1 可特异
性激活肾小球系膜局部 RAS [ 9]。Ang 为肾纤维
化的关键始动因子, 其生物效应主要通过与 AT 1R
的结合产生, Ang 与 A T 1R 结合后,经由磷脂酰肌
醇 3 激酶 ( PI3 kinase )、丝裂原激活蛋白激酶
( MA PK)、核因子 B ( N F B) 等多条途径,刺激系
膜细胞及肾小管上皮细胞分泌致纤维化因子, 后者
可通过诱导细胞增殖及肌成纤维细胞形成、促进细
胞外基质沉积等,而导致肾小球系膜增生及小管间
质纤维化[ 10, 11] 。ACE 是 RAS 代谢途径的关键酶。
在 IgA 肾病进程中, ACE 通过其水解产物 Ang ,
Ang 与 AT 1R结合,发挥触发肾局部慢性炎症、促
进肾纤维化过程等作用[ 6]。本研究中, 肾炎宁能显
著减少 IgA 肾病大鼠肾组织中 A ng 的量, 降低
ACE 的活性, 并能抑制肾组织 AT 1R 的表达, 表明
其可能是通过阻断肾脏局部 RA S 的途径, 发挥对
IgA 肾病的治疗作用,并且与贝那普利+ 氯沙坦组
相比差异无统计学意义。
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五积散及其含药血清体外抗病毒作用研究
饶 健1, 2 ,蔡光先2 * ,伍参荣2 ,王宇红3 ,莫韦皓3
( 1 湖南省食品药品监督管理局药品认证审评中心, 湖南 长沙 410013; 2 湖南中医药大学, 湖南 长沙 410280;
3 湖南中医药大学第一附属医院 中药药理∗心血管+实验室, 湖南 长沙 410007)
摘 要:目的 探讨五积散新制剂、五积散传统制剂、五积散处方中茯苓细胞破壁粉、当归等 9 味药材 SFECO 2提
取物以及麻黄等 5 味药材水提取物的体外抗病毒活性以及细胞保护作用。方法 采用体外细胞病变 ( CPE) 法,
测定上述 5 种受试物对柯萨奇病毒 ( Cox . V) 与轮状病毒 ( H RV ) 的抗病毒活性,以及测定其含药血清对 Cox . V
与 HRV 感染细胞的保护作用, 计算细胞存活率、半数抑制浓度 ( IC50) 以及药物的治疗指数 ( T I)。结果 5 种受
试物对 Co r. V 与 HRV 均有抑制作用; 其中以五积散新制剂对病毒的抑制作用效果最佳, 其对 Co r. V 与 HRV 的
IC50分别为 0 038、0 029 mg/ mL , T I 分别为 29 20、38 32,其含药血清作用于 Cor. V 与 HRV 感染细胞后细胞存
活率分别为 ( 82 18∃ 0 061)%、( 93 69 ∃ 0 041)% , 与病毒对照组比较差异显著 ( P< 0 05)。结论 5种受试物均
有抗 HRV 与 Cor. V 的活性以及细胞保护作用,其活性大小顺序为五积散新制剂> 五积散传统制剂> 当归等 9 味药
材 SFECO2提取物> 麻黄等 5味药材水提取物> 茯苓细胞破壁粉,五积散新制剂抗病毒作用最强。
关键词:五积散; 细胞破壁粉; 柯萨奇病毒; 轮状病毒; 抗病毒
中图分类号: R286 1 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05080504
#805#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091003 基金项目:湖南省科技厅重点项目 ( 06SK200J) ; 长沙市科技局重点课题 ( K080210331)作者简介:饶 健( 1958 , ) ,男,博士,研究方向为中医内科药物新工艺新制剂。T el: ( 0731) 8633377 Email: raojw lp@126. com
* 通讯作者 蔡光先