全 文 ：丹参酮
A 对白血病 K562 细胞的体外诱导凋亡作用研究
刘晓丹1 , 刘文达2 , 刘培庆3 ,王春芝1 ,徐  妍1 ,林东军1 ,黄河清3 ,吴传斌3 , 肖若芝1 ,黄仁魏1 ,刘加军1 *
( 1
中山大学附属第三医院 血液科/中山大学血液病研究所 ,广东 广州  510630; 2
中山大学附属第三医院 输血科,
广东 广州  510630; 3
中山大学药学院 药理学与毒理学实验室,广东 广州  510080)
摘  要:目的  研究丹参酮
A 对人急性白血病 K562 细胞的诱导凋亡作用及其作用机制。方法  以不同浓度的
丹参酮
A ( 10~ 50
mol/ L ) 作用于体外培养的 K562 细胞 24、48、72 h, 应用 MTT 法检测细胞生长抑制率,流式
细胞术 ( FCM ) 检测细胞凋亡率,并对 50
mo l/ L 的药物作用不同时间后亚 G 1期细胞进行检测。应用免疫印迹法
( Western blo tting) 检测 Caspase3 及其裂解底物多聚 ADP核糖聚合酶 ( PARP) 的表达水平,并对凋亡调节蛋白
Fas、Bax、Bcl2、Bak、Bid 的表达水平进行检测。结果  20
mo l/ L 以上的丹参酮
A 可显著抑制 K562 细胞的生
长、诱导细胞发生凋亡, 并呈现出明显的量效与时效关系; FCM 检测结果表明 50
mo l/ L 丹参酮
A作用不同时
间后,亚 G1期细胞 (凋亡细胞) 逐渐增多。20
mo l/ L 以上的丹参酮
A作用 48 h 后 Caspase3 逐渐被活化出现
17 000 的亚单位, Caspase3 的作用底物 PARP 被活化裂解出现 89 000 的亚单位片段,而且 Caspase3 的激活以及
PARP 的裂解可被 Caspase3 的特异性抑制剂 zDEVDFMK 所阻断, 促凋亡蛋白 Fas 以及 Bax 的表达水平明显
升高,而凋亡抑制蛋白 Bcl2 及其他促凋亡蛋白 Bak 和 Bid 的表达水平则无明显变化。结论  丹参酮
A 可以通
过诱导白血病 K562 细胞凋亡而发挥体外抗白血病作用, 上调促凋亡蛋白 Fas 和 Bax 的表达水平及激活 Caspase
3 可能是丹参酮
A 诱导白血病 K562 细胞发生凋亡的重要作用机制之一。
关键词:丹参酮
A ; 白血病; K562 细胞; 细胞凋亡
中图分类号: R733
7    文献标识码: A    文章编号: 0253 2670( 2010) 10 1663 04
Investigation on apoptosis inducing effect of tanshinone
A on leukemia K562 cells in vitro
LIU Xiaodan1 , LIU Wenda2 , L IU Peiqing3 , WANG Chunzhi1 , XU Yan1 , L IN Dongjun1 ,
HUA NG Heqing3 , WU Chuanbin3 , XIAO Ruozhi1 , HUANG Renwei1 , L IU Jiajun1
( 1
H emato lo gical Department & Institute, T hird H ospital o f Sun YatSen Univer sity, Guangzhou 510630, China;
2. Department of T ransfusion, Third H ospital of Sun Yatsen Univ ersity , Guangzhou 510630, China;
3. Labo rato ry of Pharmaco lo gy and Toxico lo gy , School of Pharmaceutical Science
of Sun Yatsen Universit y, Guang zhou 510080, China)
Abstract: Objective  To invest igate the apoptosis inducing ef fect of tanshinone
A ( Tan
A ) on hu
man acute leukemic K562 cells and its mechanisms. Methods  K562 Cells w ere t reated by differ ent concen
t rat ion o f Tan
A ( 10 ! 50
mol/ L) fo r 24, 48, and 72 h. T he inhibitory r ate of the cells w as measured by
MT T assay , cell apoptosis w as exam ined by f low cytometry ( FCM ) . Wester n blo tt ing w as used to detect
caspase3 and poly ( ADPribose) polymerase ( PARP) expression as w ell as apoptot ic modulators, such as
Bax, Bcl2, Bak, Bid, and Fas. Results  Tan
A ( over 20
mo l/ L ) could inhibit the g row th and induce
apoptosis in K562 cells in both t ime and do sedependent manners. FCM Analysis show ed that the subG1
cells ( apoptot ic cells) w ere g radual ly increased af ter t reatment by 50
mol/ L T an
A for different hours.
Wester n blo tt ing show ed cleavage of the caspase3 zymogen protein w ith the appearance of its 17 000 sub
unit , and a 89 000 subunit cleavage product of ADPribo se PARP after T an
A ( ov er 20
mo l/ L ) t reat
ment fo r 48 h. Mor eover , activat ion of caspase3 and PARP was dramat ically inhibited by caspase3
specific inhibitor zDEVDFMK. Wester n blot t ing also revealed that the expression of proapoptot ic pro
tein Fas and Bax w as upregulated signif icant ly while expression o f ant iapoptot ic protein Bcl2 as w ell as
other proapoptot ic protein Bak and Bid remained unchanged. Conclusion  Tan
A exhibits in vitro antileuke
mia effect by induction of apoptosis in K562 cells, and act ivation of caspase3 as well as upregulation of the expres
sion of proapoptotic protein Fas and Bax may be one of its signif icant apoptosis inducing mechanisms.
Key words: tanshinone
A ( T an
A ) ; leukem ia; K562 cell; apoptosis
∀1663∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
收稿日期: 20100423                     基金项目:教育部新世纪优秀人才支持计划资助项目 ( NCET0721) ; 广东省科技计划资助项目 ( 2010B030700006)作者简介:刘晓丹( 1981 ! ) ,男,山东滨州人,硕士研究生,主要从事细胞凋亡机制研究。
* 通讯作者  刘加军  T el: ( 020) 85252227  Fax: (020) 85253336  Email : jiajun. l@ 163. com
  丹参酮
A ( tanshinone
A ) 是从丹参 S alvia
mil t iorr hiz a Bunge 中提取出来的一种脂溶性蒽醌
类衍生物。既往资料表明[ 12] ,丹参酮
A除了具有
抗炎、抗氧化等多种传统功能外,还可以通过调节肿
瘤坏死因子( TNF)以及改变血管内皮素 ( ET )
的表达水平等机制保护血管内皮细胞的功能 [ 3]。已
有资料表明, 丹参酮
A对多种肿瘤细胞如乳腺
癌[ 4]、肝癌细胞[ 5] 等具有显著的体外抗肿瘤作用; 而
且丹参酮
A联合三氧化二砷可以诱导白血病 MR2
细胞发生凋亡, 从而降低 MR2 细胞的耐药性 [ 6] , 丹
参酮
A与阿霉素联用对 K562 细胞的促凋亡作用
有协同效果[ 7]。前期体外研究资料表明 [ 8] , 丹参酮

A可以降低白血病细胞的侵袭及黏附功能, 对白
血病 NB4 细胞具有体外增殖抑制及诱导凋亡作用。
本研究以体外培养的 K562 细胞为研究对象, 观察
不同浓度的丹参酮
A对 K562 细胞的生长抑制及
诱导凋亡作用, 并对其作用机制进行了探讨, 为其抗
肿瘤临床应用与开发提供依据。
1  材料
  RPM I 1640 培养液为美国 Gibco 公司产品; 小
牛血清为杭州四季青生物制品厂产品; 抗人 Bax、
Bcl2、Bak、Bid、Fas、Caspase3 及 PARP ( Caspase
3底物) 抗体为美国 Gibco 公司产品。丹参酮
A
由中山大学药学院药理学与毒理学实验室提供 (质
量分数> 98%)。
超净工作台(杭州)、CO2细胞培养箱、普通及倒
置显微镜 ( Olympus 产品)、平板离心机 (国产)、96
孔培养板 ( Deta, 美国)、FACScan 型流式细胞仪
( Becton Dickinson,美国)。
2  方法
2
1  细胞培养:将 K562 细胞 (由中山大学肿瘤中
心提供) 接种于含 10% 灭活小牛血清的 RPMI
1640 培养液中, 在 37 # 、5% CO 2、饱和湿度下培
养,每 1~ 2 天换液 1次, 取对数生长期的细胞进行
实验,分别用各种浓度的丹参酮
A处理细胞, 未加
药组为对照组。
2
2  细胞生长抑制率的规定: 采用噻唑蓝 ( M TT )
还原法进行检测。取对数生长期的 K562 细胞, 调
整细胞浓度为 2 ∃ 106 / mL, 将 K562 细胞分装于数
个 25 mL 的培养瓶中, 每瓶为 4 mL,分别加入丹参
酮
A储存液,调整其终浓度分别为 10、20、30、40、
50
mol/ mL。取 96 孔板数个, 每孔加入上述细胞
悬液 100
L,每种药物浓度为一组, 每组设 6 个平
行孔, 根据实验设计培养不同的时间。每组细胞培
养不同的时间后从培养箱中取出, 然后每孔加入
MTT ( 5 mg/ mL) 10
L,再继续培养 4~ 6 h 后取
出,离心后吸去上清液,每孔加入 DMSO 100
L,再
将培养板震荡均匀 5 min 左右,显微镜下观察着色
颗粒消失后,在 20 min 内以 570 nm 为测试波长,
630 nm 为参考波长,读取吸光度 ( A ) 值,计算细胞
生长抑制率[抑制率= (对照组 A 值- 实验组 A
值) /对照组 A 值∃ 100% ]。
2
3  流式细胞仪检测细胞凋亡比例:收集不同药物
浓度处理不同时间后的 K562 细胞,以 PBS 缓冲液
清洗 2 次, 将细胞沉淀充分混匀, 用 70% 冷乙醇
4 # 固定 24 h 以上。离心去除乙醇固定液, 用
PBS 清洗 1 次后, 加入 200
g/ mL 去 DNA 酶的
RNA 酶,流式细胞仪分析不同 DNA 量的细胞分
布。应用 ModifitL TL 1. 00 ( MAC) 分析系统进行
数据处理,低于 G 1期的细胞为凋亡细胞, 其占细胞
总数的比例为凋亡比例。
2
4  免疫印迹法 ( Wester n blot t ing ) 检测凋亡调
节蛋白:收集丹参酮
A处理 48 h 后的细胞 1 ∃ 106
个,提取细胞总蛋白, 经 BioRad 法定量蛋白, 取
40 g 总蛋白上样,经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝
胶电泳 ( SDPAGE) 后, 转移到醋酸纤维素膜上,
5% 脱脂奶粉室温封闭 3~ 4 h, 4 # 下与抗 Bax、
Bcl2、Bak、Bid、Fas 或抗 Caspase3、PARP 抗体孵
育过夜,辣根过氧化酶标记的羊抗兔二抗室温下孵
育 2 h,洗膜后用 DA B 显色并拍照。
2
5  统计学分析:每组实验均重复 3次以上,各组
实验数据用 x % s 表示, SPSS 13
0软件进行统计学
分析,采用单因素方差分析。
3  结果
3
1  对 K562细胞生长的抑制作用:与对照组 (未
加药物治疗组) 比较, 10
mol/ L 丹参酮
A对
K562细胞的生长无明显作用 ( P> 0
05) , 20
mo l/
L 以上浓度组随着药物作用时间的延长, 细胞生长
抑制率逐渐升高, 50
mol/ L 丹参酮
A引起的细胞
生长抑制率明显高于其他浓度的药物 ( P< 0
01) ,
结果见图 1。
3
2  对细胞凋亡率及亚 G 1期细胞比例的影响: 由
图 2可看出, 20
mo l/ L 以上的丹参酮
A对 K562
细胞具有显著的凋亡诱导作用, 并呈现出一定的时
间和浓度依赖性。10
mol/ L 丹参酮
A组 K562
细胞的凋亡率明显低于其他药物浓度组的凋亡率
( P< 0
01)。由图 3可看出, 50
mol/ L 丹参酮
A
作用不同时间后亚 G 1期细胞峰 (凋亡细胞) 逐渐升
∀1664∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
与对照组比较: * * P< 0
01
* * P < 0
01 v s cont rol group
图 1 丹参酮
A对 K562 细胞的生长抑制作用 (x % s, n= 6)
Fig. 1 Inhibition of tanshinone
A on growth
of K562 cells ( x% s, n= 6)
图 2 丹参酮
A对 K562 细胞凋亡的影响 ( x% s, n= 6)
Fig. 2 Effect of tanshinone
A on apoptosis
of K562 cells ( x% s, n= 6)
图 3  丹参酮
A( 50
mol/ L)作用不同时间后
K562 细胞亚 G1期细胞比例
Fig. 3 SubG1 cells ratio of K562 cells treated with 50

mol/ L tanshinone
A for different time
高 (图中箭头所指) ,作用 72 h 亚 G 1期细胞比例为
41
3%,明显高于对照组及其他时间点亚 G1期细胞
比例 ( P< 0
05)。
3
3  Caspase3 及 PRAP 表达的变化: Western
blot t ing 检测结果显示, 20
mol/ L 以上的丹参酮

A作用 48 h 后, 随着药物浓度的增加, Caspase3
逐渐被活化出现 17 000 亚单位的条带, 药物对
Caspase3 的活化作用具有明显的浓度依赖性, 在
Caspase3 被活化的同时, PARP 被裂解出现
89 000 的亚单位片段, Caspase3 的活化以及
PARP 裂解片段的强度随药物浓度的增加而增强
(图 4A)。将 K562 细胞与 Caspase3 的特异性抑
制剂 zDEVDFMK ( 20
mol/ L ) 共同孵育 1 h 后,
再加入 50
mol/ L 的丹参酮
A培养 24、48、72 h,
结果表明 Caspase3 的激活及其底物 PARP 的裂
解可特异性地被 zDEVDFMK 所阻断 (图 4B)。
ACaspase3及其底物 PRAP 可以被丹参酮
A 裂解
BCaspase3及 PRAP 的裂解可以特异性地被 zDEVDFMK 所
阻断  1~ 5分别为 10、20、30、40、50
mol/ L 丹参酮
A
ACaspase3 and PRAP w ere cleaved by tanshinone
A t reat
ment  Bact ivat ion of Caspase3 and PRAP was inhib ited
by zEDVDFMK  1 ! 510, 20, 30, 40, and 50
m ol / L
tan shin on e
A
图 4 丹参酮
A作用后 K562 细胞 Caspase3
及 PRAP表达水平的变化
Fig. 4  Expression of Caspase3 and PRAP of K562 cells
after tanshinone
A treatment
3
4  丹参酮
A作用 48 h 后凋亡调节蛋白的变化:
Western blot t ing 结果显示, 对照组和 10
mo l/ L
的丹参酮
A作用 48 h 后对凋亡调节蛋白的表达无
明显的影响,而当丹参酮
A浓度在 20
mol/ L 以
上时,随着药物浓度的增加,促凋亡蛋白 Fas及 Bax
的表达水平则逐渐升高;但是,另外两种促凋亡蛋白
Bid和 Bak 的表达水平则无明显变化,同样,凋亡拮
抗蛋白 Bcl2的表达水平也无明显变化 (图 5)。
4  讨论
  Bcl2家族是细胞凋亡过程中重要的调节因素
之一, Bcl2 家族中的各种成分可以通过与其他凋亡
相关因子的协同或拮抗作用调控凋亡的过程。
∀1665∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 10 期 2010 年 10月
1~ 510、20、30、40、50
mol/ L 丹参酮
A
1 ! 510, 20, 30, 40, and 50
mol/ L tan shinone
A
图 5  丹参酮
A作用 48 h 后凋亡调节蛋白表达水平的变化
Fig. 5  Protein expression of apoptotic modulatory protein
after tanshinone
A treatment for 48 h
Bcl2 家族包括促进凋亡的成员如 Bax、Bak、Bid
等,以及抑制凋亡发生的成员如 Bcl2、BclX 等。
已有资料表明 [ 9] , 凋亡拮抗蛋白特别是 Bcl2 表达
水平的高低与肿瘤的发生、发展及临床疗效、预后等
均密切相关, 靶向性抑制 Bcl2 家族中凋亡拮抗蛋
白的表达以及诱导细胞发生凋亡已经逐渐成为白血
病治疗的重要策略之一[ 1011]。Fas 是另外一种重要
的凋亡调节蛋白,它主要是通过死亡因子及其受体
介导的信号转导途径诱导细胞发生凋亡。近年资料
表明[ 12] ,通过上调 Fas 的表达水平可以降低白血病
K562 细胞的生长潜力以及促进细胞发生凋亡。
Caspases 是一切凋亡信号传导的共同通路, 正常情
况下 Caspases 在细胞内以无活性的酶原形式存在,
当凋亡过程被启动后凋亡信号可传导至 Caspases
酶原, 使其部分肽链发生水解, 形成具有活性的
Caspases, 然后各种 Caspases 如同凝血过程一样产
生&瀑布式∋层层激活,最终导致细胞发生凋亡,目前
已发现在人体内的 Caspases 共有 14 种, 其中起核
心作用的是 Caspase3。Caspase3被激活后可裂解
产生 17 000 的活性亚单位, 后者可进一步激活
Caspases 活化的核酸内切酶 ( CAD) , 活化的 CAD
可切割 DNA, 导致细胞发生凋亡。在多种细胞包
括白血病细胞和实体瘤细胞凋亡的过程中均有
Caspase3活性的变化, 多数资料显示,无论是药物
还是某些生物活性因子所诱导的肿瘤细胞凋亡, 都
是通过激活 Caspases 途径开始 [ 13]。
本研究以白血病 K562 细胞株为研究对象, 观
察了丹参酮
A对白血病 K562 细胞的生长抑制及
诱导凋亡作用。结果表明 20
mo l/ L 以上的丹参
酮
A能抑制 K562 细胞的生长及诱导细胞发生凋
亡,而且呈现出一定的时间效应与剂量效应关系。
50
mo l/ L 的丹参酮
A作用不同时间后, 应用
FCM 检测结果显示, 随着药物浓度增加, 亚 G1期细
胞 (凋亡细胞) 比例逐渐增多; 在细胞凋亡过程中,
随着药物浓度的增加, Caspase3 被活化, 通过其裂
解底物 PARP 而诱导细胞凋亡,在细胞凋亡的同时
促凋亡蛋白 Fas 及 Bax 的表达水平逐渐升高。
综上所述, 丹参酮
A可以通过诱导白血病
K562细胞凋亡而发挥体外抗白血病作用, 上调促
凋亡蛋白 Fas 和 Bax 的表达水平以及激活
Caspase3 可能是丹参酮
A诱导白血病 K562 细胞
发生凋亡的重要作用机制之一。
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