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重组天花粉蛋白体外诱导宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因去甲基化的研究
尤程程1 ,黄利鸣2 3 ,韩 　钰1 ,王艳林2 ,黄益玲2
(11 三峡大学分子生物研究所 ,湖北 宜昌 　443002 ; 21 三峡大学医学院 病理教研室 ,湖北 宜昌 　443002)
摘 　要 :目的 　研究重组天花粉蛋白 (recombinant t richosanthin , r TCS) 对宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因甲基化
状态和基因表达的影响。方法 　应用不同质量浓度的 r TCS (20、40、80μg/ mL) 处理体外培养的宫颈癌 HeLa 细
胞后 ,MSP 法检测用药前后细胞中 p27 基因的甲基化状态 ,Real2Time PCR 法检测用药前后细胞中 p27 和 DNA
甲基转移酶21 (DNM T1) mRNA 水平的变化 ,Western2blotting 法检测用药前后细胞中 p27 蛋白表达的变化。结
果 　HeLa 细胞中 p27 基因为低表达 ,基因启动子区 Cp G岛呈部分甲基化状态。40μg/ mL r TCS 处理导致 p27 基
因启动子区 Cp G 岛去甲基化 ;在 20、40、80μg/ mL 的 r TCS 作用 48 h 后 ,p27 基因 mRNA 相对表达水平分别升高
2122、4100、6103 倍 ,p27 蛋白水平表达也逐渐增加 ;宫颈癌 HeLa 细胞中 DNM T1 mRNA 高表达 ,40μg/ mL r TCS
处理 48 h 可至 DNM T1 mRNA 表达水平降低 78 %。结论 　r TCS 通过抑制 DNM T1 ,逆转 p27 基因启动子区
Cp G 岛的甲基化状态 ,使宫颈癌 HeLa 细胞中 p27 基因表达活化。r TCS 能逆转宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因甲基
化状态 ,调控 p27 基因和 DNM T1 的表达。
关键词 :重组天花粉蛋白 ; p27 基因 ; 宫颈癌 ; DNA 甲基化
中图分类号 :R286191 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :0253 2670 (2010) 02 0245 05
I n vit ro introduction of recombinant trichosanthin on demethylation of p27 in HeLa cells
YOU Cheng2cheng1 , HUAN G Li2ming2 , HAN Yu1 , WAN G Yan2lin1 , HUAN G Yi2ling2
(11 Institute of Molecular Biology , Three Gorges University , Yichang 443002 , China ; 2. Department of Pathology ,
Medical College of Three Gorges University , Yichang 443002 , China)
Abstract : Objective 　To investigate the effect s of recombinant t richosant hin ( r TCS) on met hylation
stat us and expression level of p27 gene in HeLa cells. Methods 　HeLa cells was t reated by different con2
cent ration (20μg/ mL , 40μg/ mL , and 80μg/ mL ) of r TCS for 48 h and then met hylation2specific poly2
merase chain reaction (MSP) was used to detect t he p romoter met hylation stat us of t he p27 gene , real2time
PCR was used to detect levels of p27 and DNM T1 mRNA , and Western blot ting assay was used to detect
expression level of p27 protein before and af ter t reatment wit h r TCS. Results 　Low expression level and
promoter met hylation stat us of t he p27 gene were detected in HeLa cells. Treat ment with 40μg/ mL r TCS
·542·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
3 收稿日期 :2009206212　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家自然科学基金资助项目 (30873282) ; 湖北省自然科学基金资助项目 (2009CDA060)
作者简介 :尤程程 (1984 —) ,女 ,湖北十堰人 ,助教 ,硕士。Tel : (0717) 6397179 　E2mail :yocncn @163. com3 通讯作者　黄利鸣
totally demet hylated p27 promoter . Treat ment wit h 20μg/ mL , 40μg/ mL or 80μg/ mL r TCS resulted in a
2. 222 , 4. 002 or 6. 032folds increase in p27 mRNA level , respectively , and also a great increase in p27 p ro2
tein level . A high DNM T1 expression level was observed in HeLa cells and t reatment wit h 40μg/ mL r TCS
resulted in a 78 % decrease at the DNM T1 mRNA exp ression. Conclusion 　r TCS could reverse p romoter
hypermet hylation and re2activate the expression of p27 gene by inhibiting DNM T1 expression in HeLa
cells , which indicates it s potential use in cancer therapy.
Key words : t richosant hin ; p27 gene ; uterine cervix cancer ; DNA met hylation
　　近年研究发现 ,肿瘤相关基因的启动子区域
Cp G 岛高甲基化是引起宫颈癌的一个重要原因[1 ] 。
抑癌基因 p27 是细胞周期调节蛋白依赖性激酶抑
制剂 ( cyclin2dependent kinase inhibitor , CD KIs)
家族成员之一 ,p27 基因启动子区的高甲基化可以
引起该基因表达缺失 ,进而导致肝癌、结直肠癌、胃
癌等肿瘤的发生[ 2～4 ] 。由于 DNA 甲基化抑制基因
表达的过程是可逆性的 ,如能获得有效去甲基化的
药物 ,即可通过去甲基化而使因甲基化失活的抑癌
基因重新表达[5 ] 。
天花粉蛋白 (t richosant hin , TCS) 是从葫芦科
植物栝楼的块根中提取出来的单链核糖体失活蛋
白 ,在临床上可以引发中期妊娠流产 ,对子宫外妊
娠、绒毛膜上皮癌有一定疗效。TCS 成熟肽由 247
个氨基酸残基组成 ,相对分子质量约为 24 000 ,
PI = 9. 4 ,具有 N2糖苷酶活性 ,能水解真核细胞核糖
体的 28 S rRNA 的 4 324 位上的腺苷酸的 N2C 糖
苷链 ,使核糖体不可逆失活 ,从而抑制蛋白质的合
成[6 ] 。本课题组前期实验证明 TCS 在体外能通过
诱导细胞凋亡明显抑制人宫颈癌 HeLa 细胞的生
长[7 ] ,且能够逆转宫颈癌 HeLa 细胞中 p16 和
TSL C1 基因的高甲基化状态[ 8 ,9 ] 。但是由于 TCS
天然资源的限制和植物蛋白分离纯化过程复杂 ,阻
碍了 TCS 的临床应用。本课题组前期实验中利用
大肠杆菌原核表达系统获得基因重组天花粉蛋白
(r TCS) ,发现其有与天然 TCS 相似的生物活性。
本研究利用纯化的 r TCS 处理 HeLa 细胞 ,进一步
分析 r TCS 对宫颈癌 HeLa 细胞 p27 基因启动子区
甲基化状态的影响及其作用机制。
1 　材料与方法
111 　材料 : 重组天花粉蛋白 ( r TCS) 为本所制
备[10 ] ;人宫颈癌 HeLa 细胞株由三峡大学分子生物
研究所提供 ;RPMI 1640 培养基和小牛血清 (BCS)
购自美国 Gibico 公司 ; Wizard DNA Clean2up 购自
Promega 公司 ; Trizol 总 RNA 抽提试剂购自 In2
vit rogen 公司 ;工具酶和 GeneRuler TM 100 bp Plus
DNA Ladders 购自 Fermentas 公司 ; SYBR   Prime
Script TM R T2PCR Kit ( perfect real time , 批 号
DRR063M) 购自大连 Takara 公司 ;鼠抗人 p27 抗
体及辣根过氧化物酶标记羊抗鼠二抗购自北京中杉
金桥生物技术有限公司 ; PVDF 膜和 ECL 发光检测
试剂盒为 Amersham 公司产品 ; PCR 引物合成由上
海生物技术工程有限公司完成。
112 　细胞培养 :人宫颈癌 HeLa 细胞株培养于 5 %
CO2 、37 ℃湿化孵箱中 ,RPMI 1640 培养基含体积
分数 10 % BCS、1 ×105 U/ L 青霉素、100 mg/ L 链
霉素。实验时 HeLa 细胞处于对数生长期 ,活细胞
数超过 95 % ,于培养瓶中分别加入含不同质量浓度
r TCS (20、40、80μg/ mL ) 的培养液 ,作用 48 h 后
收集细胞进行后续实验 ,以未加 r TCS 干预的细胞
为对照组。
113 　甲基化特异性 PCR (MSP) 法检测 HeLa 细
胞中 p27 基因的甲基化状态 :收集各组细胞 ,常规
酚2氯仿法提取细胞 DNA ,紫外分光光度法检测
DNA 浓度和纯度 ,按文献方法[11 ] 进行 DNA 修饰
及纯化。MSP 反应体系为 25μL ,包括样品 DNA 2
μL (含 DNA 011μg) 、10 ×PCR 缓冲液 215μL 、上
下游 PCR 引物各 015μL 、10 mmol/ L dN TP 1μL 、
Taq 酶 015μL 、双蒸水 18μL 。反应条件 :95 ℃预
变性 5 min ;94 ℃、30 s ,53 ℃、45 s ,72 ℃、30 s ,35
个循环 ; 72 ℃延伸 10 min。以 Cp G 甲基转移酶
(M. SssI) 处理和未处理的正常人外周血细胞 DNA
作为阳性和阴性对照 ,以双蒸水作为空白对照。
MSP 引物设计参照文献方法[3 ] :甲基化上游引物 :
5′2AA GA GGCGA GT TA GCGT ,甲基化下游引物 :
5′2AAAACGCCGCCGAACGA ; 非甲基化上游引
物 : 5′2A T GGAA GA GGT GA GT TA GT , 非甲基化
下游引物 : 5′2AAAACCCCAA T TAAAAACA。预
期甲基化 p27 扩增产物长度为 195 bp ,非甲基化
p27 扩增产物长度为 212 bp 。PCR 产物经 2 % 琼
脂糖凝胶电泳后凝胶成像记录结果。
114 　实时荧光定量 PCR 分析 r TCS 对 p27 和
·642· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
DNA 甲基转移酶 1 (DNM T1) 基因表达的影响 :收
集各组细胞 , 用 TRIzol 试剂提取各组细胞总
RNA ,紫外分光光度法检测 RNA 浓度和纯度 ,琼
脂糖凝胶电泳检测其完整性。以此总 RNA 为模
版 ,用逆转录酶和 Oligo (d T) 20 引物合成 cDNA 第
一链。再用 cDNA 第一链为模板进行实时荧光定
量 PCR (SYBR   Green 试剂盒) 。PCR 体系为 25
μL ,其中 SYBR   Premix Ex TaqTM (2 ×) 1215μL 、
cDNA 015μL 、上下游引物各 015μL 、去离子水 11
μL ,反应条件 : 93 ℃变性 15 s、56 ℃退火 15 s、
72 ℃延伸 40 s、40 个循环。实时连续测定基因扩
增过程中产生的荧光 ,以达到指数扩增时特定荧光
值的循环周数 (Ct 值) 表示目的基因 mRNA 的表
达量。每个样品设 3 个复孔 , Ct 取其均值 , 以
β2actin 为 内 参 照。ΔCT = CT目的基因 - CTβ2actin ,
ΔΔCT =ΔCT处理组 - ΔCT对照组 。不同样本间目的基
因表达的相对差异量 = 2 - ΔΔCT 。PCR 引物设计参考
相关文献方法[12 ,13 ] 。p27 上游引物 P1 : 5′2GA G2
GGCAA GTACGA GT GGCAA ,p27 下游引物 P2 :
5′2CT GCGCA T T GCTCCGCTAACC ; DNM T1 上
游引物 P3 :5′2ACCGCT TCTACT TCCTCGA GGC2
CTA , DNM T1 下 游 引 物 P4 : 5′2GTTGCAGTC2
CTCTGTGAACACTGTGG;β2actin 上 游 引 物 P5 : 5′2TGGCACCCAGCACAATGAA ,β2actin 下游引物P6 : 5′2CTAAGTCATAGTCCGCCTA GAAGCA 。上述3 种基因 PCR 产物的长度分别为 238、335、186 bp。115 　免疫印迹法分析 r TCS 对 p27 蛋白表达的影响 :用蛋白裂解液 (50 mmol/ L Tris2HCl p H 7. 4、150 mmol/ L NaCl、011 % SDS、015 % N P40、015 %去氧胆酸钠) 提取各组细胞总蛋白 ,考马斯亮蓝法测定浓度。取 10 μg 总蛋白变性 10 min 后 ,行12 % SDS2PA GE 分离 ,然后电转移至 PVDF 膜。用含 50 g/ L 脱脂奶粉的 TBST 缓冲液室温封闭1 h 后 ,PVDF 膜置于 1 ∶1 000 稀释的一抗 (鼠抗人p27) 中 ,4 ℃过夜 ,洗膜后再置于 1 ∶3 000 稀释的二抗 (羊抗鼠 IgG) 稀释液中 ,37 ℃孵育 1 h ,化学发光显影。实验中以β2actin 蛋白作为内参标准。116 　统计学处理 :采用 SPSS 1010 统计软件包进行配对 t 检验。2 　结果211 　r TCS 对 p27 基因甲基化状态的影响 :p27 基因在 HeLa 细胞中呈部分甲基化状态 ,在经过不同质量浓度 r TCS 处理 48 h 后 ,p27 基因在 20μg/mL 组中甲基化条带减弱 ,但仍呈部分甲基化状态 ;40μg/ mL 组仅出现非甲基化条带 ,呈现完全去甲基化状态 (图 1) 。
M2甲基化反应　U2非甲基化反应　IVD2甲基化阳性对照　dd H2O2空白对照　NL2非甲基化阳性对照
M2met hylation 　U2un2met hylation 　IVD2met hylated positive cont rol 　dd H2O2blank cont rol 　NL2un2met hylated positive cont rol
图 1 　rTCS 作用后 HeLa 细胞 p27 基因甲基化状态的改变
Fig. 1 　Promoter methylation state of p27 gene in HeLa cells treated by different concentration of rTCS
212 　r TCS 对 p27 基因和 DNM T1 基因表达的影
响 :应用半定量 R T2PCR 技术分析 r TCS 对 p27 和
DNM T1 基因表达的影响 ,发现 r TCS 处理前 HeLa
细胞中 p27 基因为低表达 ,DNM T1 基因为高表达 ;
经 20、40、80μg/ mL r TCS 处理后 ,p27 基因的表达
明显增强 ,DNM T1 基因的表达明显减弱 (图 2) 。
进一步应用实时荧光定量 PCR 技术检测 ,发现经
20、40、80μg/ mL r TCS 处理后 ,p27 基因的表达分
别比对照组升高 2122、410、6102 倍。DNM T1 基因
的表达分别是对照组的 76 %、22 %、15 % (表 1) 。
213 　r TCS 对 HeLa 细胞内 p27 蛋白表达的影响 :
应用免疫印迹法分析了 r TCS 处理前 HeLa 细胞中
p27 蛋白的表达量 ,结果发现 , HeLa 细胞中 p27 的
图 2 　RT2PCR 分析 rTCS 对 HeLa 细胞 p27 和
DNMT1 基因 mRNA 表达的影响
Fig. 2 　Effects of rTCS on mRNA expression of p27 and DNMT1
基础表达量低 , r TCS 用药后 ,p27 蛋白表达明显增
加 (图 3) 。
3 　讨论
　　宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在我
·742·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
表 1 　rTCS 对 HeLa 细胞 p27 和 DNMT1 基因表达
水平的影响 ( x ±s , n = 3)
Table 1 　Effects of rTCS on gene expression of p27
and DNMT1 in HeLa cells ( x ±s , n = 3)
组别 ρ/ (μg ·mL - 1) p27 DNM T1
对照 0 11 00 ±01 18 11 00 ±0123
r TCS 20 21 22 ±01 54 3 01 76 ±0107 3
40 41 00 ±01 43 3 3 01 22 ±0119 3 3
80 61 03 ±01 61 3 01 15 ±0134 3 3
　　与对照组比较 : 3 P < 0105 　3 3 P < 0101
　　3 P < 01 05 　3 3 P < 01 01 vs cont rol group
图 3 　rTCS 对 HeLa 细胞内 p27 蛋白表达的影响
Fig. 3 　Effects of rTCS on p27 protein expression in HeLa cells
国 ,宫颈癌发病率居女性恶性肿瘤的第二位 ,并且有
明显的年轻化趋势。研究发现 ,肿瘤的发生和发展
与相关基因表达异常或表观遗传异常密切相关。基
因表观遗传包括 DNA 甲基化、组蛋白修饰、染色质
改型和 RNA 干涉等[ 14 ,15 ] 。其中 ,DNA 甲基化异常
被认为是基因突变和缺失之外 ,肿瘤抑制基因失活
的第 3 种机制 ,而且在某些情况下是其失活的唯一
机制 ,由此基因启动子区 Cp G 岛的高甲基化引起的
基因失表达现象已成为近年来肿瘤研究的热点。
p27 基因是 CD KIs 的家族成员之一 ,相对分子
质量为 217 ×104定位于人染色体 12p1221311 ,包含
2 个外显子和 1 个内含子。p27 基因的表达产物
p27 蛋白可使细胞停止在 G1中期而调节细胞生长。
研究表明 p27 是一个抑癌基因 ,它具有诱导细胞分
化、促进凋亡、调节肿瘤耐药性以及防御炎性损伤等
功能。在许多人类肿瘤 (如乳腺癌、结肠癌、肺癌、
前列腺癌、恶性淋巴瘤、卵巢癌和肾癌[16～18 ] ) 中 p27
表达水平降低 ,且其蛋白表达的阳性率与这些肿瘤
的恶性程度呈显著负相关。对肝癌、结直肠癌、胃癌
等肿瘤的研究[2～4 ] 均证实 ,p27 基因启动子区的高
甲基化是 p27 基因在这些肿瘤中转录失活的重要
机制。
宫颈癌中 p27 蛋白表达减少。Farley 等[19 ] 发
现在宫颈轻、中和重度非典型增生中 ,p27 蛋白染色
阳性的细胞分别占 94 %、89 %、44 % ,是逐渐下降
的 ,提示在宫颈肿瘤发生中 p27 蛋白表达减少。在
轻度和中度非典型增生中 p27 蛋白的表达较重度
非典型增生显著增加 ( P < 01001) ,提示 p27 蛋白
参与宫颈癌的发生。Kim 等[20 ] 发现宫颈肿瘤中
3919 % 表现高 p27 蛋白表达 ,p27 蛋白表达与肿瘤
体积 ( P < 0101) 、浸润深度 ( P < 01001) ,高分期
( P < 01001) 和不良存活期 ( P < 0101) 有关。低
p27 蛋白表达的患者预后较差 ,提示 p27 蛋白参与
宫颈鳞状细胞病变的进展。Goff 等[21 ]的研究表明 ,
在正常和浸润前病变中 p27 蛋白染色无显著差别 ,
p27 蛋白丢失与浸润 > 50 %、大小 > 4 cm 和手术后
放疗均无显著关系 ,与远处淋巴管侵袭有关 ( P <
0105) 。Alf sen 等[ 22 ] 也指出 ,p27 和 p27 蛋白的表
达与分期、年龄和组织病理参数之间无显著关联。
多变量分析表明 ,低 p27 蛋白表达和高 p16 蛋白表达
是宫颈癌预后不良的有力指标 (p27 , P < 0. 01 ,危害
比为 3118 ;p16 , P < 0101 ,危害比为 0116) 。
由于 Cp G 岛甲基化导致抑癌基因转录失活是
一个可以逆转的表观遗传学基因修饰过程 ,且该逆
转 (Cp G 岛去甲基化) 可直接恢复抑癌基因功能 ,
因此 ,DNA 去甲基化恢复抑癌基因功能的研究也
成为肿瘤基因治疗的新型手段之一[23 ] 。DNA 甲基
化程度依赖于 DNA 甲基转移酶 (DNA met hyl2
t ransferase , DNM T) 活性 ,它的主要功能是将甲基
转移至胞嘧啶的含氮杂环上。人体细胞含有多种
DNM T ,其中 DNM T1 的主要功能是在细胞分裂过
程中维持 DNA 新生链的甲基化状态。高 DNM T
活性可通过抑癌基因高甲基化使之失活 ,由此导致
肿瘤的形成。因此 ,特异性地抑制 DNM T1 活性 ,
如竞争性底物 (发夹式半甲基化寡核苷酸) 、核苷类
似物 (52aza2C、52aza2CdR) 、小分子抑制物 ( SA H) 、
反义寡核苷酸等 ,可使因高甲基化转录失活的抑癌
基因恢复功能 ,从而逆转肿瘤细胞生物学活性。目
前研究较多的去甲基化药物是核苷类似物 ,但是该
类药物存在诱变性 ,浓度高时具有细胞毒性等不良
反应 ,临床应用受到很大限制。因此 ,寻找新的安全
的去甲基化药物用于肿瘤治疗具有重要的临床
意义。
本研究进一步发现 ,在宫颈癌 HeLa 细胞中存
在 p27 基因启动子区的异常甲基化。经 20μg/ mL
r TCS 处理后 ,甲基化程度减弱 ,40μg/ mL r TCS 处
理则导致完全去甲基化。实时定量 PCR 结果显示
p27 基因 mRNA 表达水平较 r TCS 处理前增加
2～6 倍 ,p27 蛋白表达也比处理前明显增高。上述
结果表明高甲基化是 HeLa 肿瘤细胞中 p27 基因
表达抑制的重要原因 ,而 r TCS 可通过基因启动子
区去甲基化而活化 HeLa 细胞内 p27 基因表达。
·842· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月
本实验结果还表明在 HeLa 细胞中 DNM T1 高表
达 ,40 μg/ mL r TCS 处理 HeLa 细胞 48 h 可使
DNM T1 mRNA 表达水平降低 78 % ,即 r TCS 抑制
HeLa 细胞 DNM T1 的表达。
由于启动子区异常甲基化是肿瘤发生中的早期
事件 ,对 p27 基因甲基化的检测 ,有可能成为早期
发现宫颈癌的一种手段。r TCS 可以逆转 p27 基因
甲基化状态 ,增强 p27 基因表达 ,这一作用可能是
通过抑制 DNM T1 的表达来实现的 ,提示 r TCS 有
可能是新型的 DNM T 抑制剂 ,因而具有潜在的临
床应用价值。
致谢 :三峡大学分子生物研究所全体成员对笔
者的大力帮助和支持 !
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·942·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 2 期 2010 年 2 月