全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1330·
干蟾皮中蟾毒内酯类成分的提取工艺研究
昝日增 1，胡万杨 2，黄玉叶 2，余 跃 2，宋霄宏 2*
1. 武警浙江省总队杭州医院，浙江 杭州 310051
2. 浙江中医药大学药学院，浙江 杭州 310053
摘 要：目的 探讨干蟾皮中蟾毒内酯类成分的最佳提取工艺。方法 通过正交试验法考察乙醇体积分数、乙醇用量、提取
时间、提取次数对干蟾皮中蟾毒内酯类成分提取效果的影响，并以酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的总量—总毒基量为考察指标，
采用超高效高压液相色谱-紫外检测器检测。结果 最佳提取工艺为以 10 倍量 80%乙醇提取 2 次，每次 2 h。结论 所优选
出的提取工艺方法可行、稳定、合理。
关键词：干蟾皮；酯蟾毒配基；华蟾酥毒基；提取工艺；超高效高压液相色谱-紫外检测
中图分类号：R284.2；R286.02 文献标志码：B 文章编号：0253 - 2670(2011)07 - 1330 - 04
Extracting technology of bufadienolides in Bufo Corium
ZAN Ri-zeng1, HU Wan-yang2, HUANG Yu-ye2, YU Yue2, SONG Xiao-hong2
1. Hangzhou Hospital of Zhejiang General Team of Armed Police, Hangzhou 310051, China
2. Pharmaceutical College, Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine, Hangzhou 310053, China
Key words: Bufo Corium; resibufogenin; cinobufagin; extracting technology; UPLC-ELSD

干蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍 Bufo bufo
gargarizans Cantor 的干燥皮，研究表明其具有清热
解毒、利水消胀之功效，主治痈疽、肿毒、瘰疬、
肿瘤等[1]。干蟾皮中化学成分种类繁多，据报道含
有 30 种以上的甾体化合物，生理活性物质主要是蟾
蜍毒素（bufotoxin）及水解产物蟾毒配基，其中以
蟾毒内酯类、蟾毒色胺类为主[2-5]，干蟾皮提取的华
蟾素为我国自行研发的二类新药，可有效缓解癌痛
症状[6]。本实验采用正交试验法，以酯蟾毒配基和
华蟾酥毒基的总量为考察指标，用超高效高压液相
色谱-紫外检测器进行检测，优选最佳提取工艺，为
进一步制备现代制剂提供原料。
1 仪器与材料
电子天平（上海民桥精密科学仪器有限公司）；
AB135—S 分析天平（梅特勒-托利多）；RE—5205
旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DK—S22
型电热恒温水浴锅（巩义市予华仪器有限公司）；
Waters Acquity 超高效高压液相色谱仪-紫外检测器
（美国 Waters 公司）。
酯蟾毒配基对照品（批号 110718-200507）、华
蟾酥毒基对照品（批号 110803-200504）购于中国
药品生物制品检定所。干蟾皮（批号 20100526）产
地江苏，购于亳州药材市场，经浙江中医药大学资
源鉴定教研室陈孔荣副教授鉴定为蟾蜍科动物中华
大蟾蜍 Bufo bufo gargarizans Cantor 的干燥皮。
甲醇、乙腈为色谱纯；95%乙醇、环己烷、丙
酮、氯仿均为分析纯；100～200 目柱色谱硅胶（试
剂级，青岛海洋化工厂分厂）；0.22 μm 针筒式微孔
滤膜过滤器（上海兴亚净化材料厂）。
2 方法与结果
2.1 蟾毒配基类成分的测定
2.1.1 色谱条件 色谱柱为 BEH Phenyl（100
mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-水（30∶70），
体积流量 0.3 mL/min，柱温 35 ℃，检测波长 296
nm。酯蟾毒配基与华蟾酥毒基峰以及两者与其他成
分峰的分离度均大于 1.5。理论塔板数按酯蟾毒配

收稿日期：2010-09-06
基金项目：浙江省科技厅资助项目（2007C33048）
作者简介：昝日增（1954—），男，主任药师，浙江中医药大学客座教授，主要研究方向为中药新制剂。
Tel: (0571)87135053 E-mail: zanrizeng@163.com
*通讯作者 宋霄宏 Tel: (0571)86613524 E-mail: songxiaohong999@163.com
中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 42 卷 第 7 期 2011 年 7 月 ·1331·
基、华蟾酥毒基峰计算均不低于 16 000。
2.1.2 对照品溶液的制备[7-8] 分别精密称取减压
干燥至恒定质量的酯蟾毒配基对照品 4.23 mg、华
蟾酥毒基对照品 4.24 mg，甲醇定容至 10 mL 棕色
量瓶中，摇匀；从上述对照品溶液中分别精密吸取
0.2 mL，加甲醇定容至 5 mL 量瓶中，摇匀，即得
含酯蟾毒配基 16.92 μg/mL、华蟾酥毒基 16.96
μg/mL 的混合对照品溶液。
2.1.3 供试品溶液的制备 称取干蟾皮粗粉（过 2
号筛）50 g，用 10 倍量 80%乙醇溶液提取 2 次，每
次 1.5 h，滤过，合并提取液，浓缩，定容至 50 mL
量瓶中。移取 9 mL 提取液，水浴蒸干，加 2 g 硅胶，
研磨均匀，60 ℃烘 1 h。粉末以 100～200 目硅胶
15 g 装柱，环己烷-氯仿-丙酮（4∶3∶3）洗脱，收
集洗脱液 150 mL，蒸干，残渣用甲醇定容至 10 mL
量瓶中，精密吸取 1 mL，甲醇定容至 5 mL 量瓶中，
过 0.22 μm 微孔滤膜，取续滤液，作为供试品溶液。
2.1.4 线性关系考察 分别精密吸取混合对照品溶
液 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 μL 进样，以对照品
进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标进行线性
回归，得回归方程：酯蟾毒配基 Y＝2 524 633.246
X－327.553，r＝1.000 0；华蟾酥毒基 Y＝2 775 844.533
X－747.688，r＝1.000 0；表明酯蟾毒配基在 8.46～
84.6 ng、华蟾酥毒基在 8.48～84.8 μg 呈良好线性
关系。
2.1.5 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 5
μL，连续进样 6 次，计算得酯蟾毒配基和华蟾酥毒
基峰面积的 RSD 分别为 0.79%、0.84%。
2.1.6 稳定性试验 精密吸取按“2.1.3”项下处理
得到的供试品溶液 3 μL，按上述色谱条件，分别在
0、2、4、6、8、12、24 h 进样测定，计算得酯蟾毒
配基、华蟾酥毒基峰面积的RSD分别1.29%、2.15%，
表明供试品溶液在 24 h 内稳定。
2.1.7 重现性试验 分别称取干蟾皮粗粉 6 份，按
“2.1.3”项下操作，依法测定，外标法计算得酯蟾毒
配基和华蟾素毒基质量分数的 RSD 分别为 2.38%、
2.08%。
2.1.8 加样回收率试验 精密称取干蟾皮粗粉 6
份，分别加入酯蟾毒配基对照品 465.30 μg、华蟾酥
毒基对照品 848.00 μg，制备供试品溶液，进样测定，
计算得酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的平均回收率分别
为 100.80%、99.54%，RSD 分别为 1.36%、2.35%。
2.1.9 样品测定 取不同工艺制备的样品，制备供
试品溶液，依法测定，计算酯蟾毒配基和华蟾素毒
基的量。色谱图见图 1。






1-酯蟾毒配基 2-华蟾酥毒基
1-resibufogenin 2-cinobufagin

图 1 对照品（A）和供试品（B）的 UPLC 图谱
Fig. 1 UPLC chromatograms of reference substances (A)
and sample (B)

2.2 干蟾皮提取工艺的考察
2.2.1 提取溶媒的选择 称取干蟾皮粗粉 3 份，每
份 50 g，分别以水和 50%、70%乙醇溶液为溶媒，
用药材 10 倍量溶媒提取 2 次，每次 1.5 h，滤过，
合并 2 次提取液，回收浓缩，定容至 50 mL 量瓶中。
按“2.1.3”项下处理得供试品溶液，依法测定，外标
法计算酯蟾毒配基和华蟾素毒基的量。结果见表 1。
采用 70%乙醇溶液为提取溶媒效果较好。
2.2.2 正交试验 根据醇提单因素考察结果并参考
相关文献报道[9-10]，以酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的
总量——总毒基量为指标，考察乙醇体积分数（A）、

表 1 提取溶媒的考察
Table 1 Investigation of solvent extraction
溶 媒 酯蟾毒配基/
(μg·g−1)
华蟾酥毒基/
(μg·g−1)
总毒基/
(μg·g−1)
水 28.96 65.01 93.97
50%乙醇 46.43 60.25 106.68
70%乙醇 54.22 68.95 123.17
1 2
0 5 10 15 20
1
2
0 5 10 15 20
t / min
A
B
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乙醇用量（B）、提取时间（C）、提取次数（D）对
提取效果的影响。
称取干蟾皮粗粉 50 g，共 9 份，采用 L9（34）
正交表安排试验，进行提取，合并提取液，回收乙
醇，浓缩液定容至 50 mL 棕色量瓶中。按“2.1.3”
项下操作，依法测定，外标法计算酯蟾毒配基、华
蟾素毒基的量以及总毒基量。正交试验设计及结果
见表 2，方差分析见表 3。

表 2 L9(34) 正交试验设计及结果
Table 2 L9(34) Orthogonal test and results

表 3 方差分析
Table 3 Analysis of variance
方差来源 偏差平方和 自由度 均方 F 值 显著性
A 36.28 2 18.14 1.00
B 404.47 2 202.24 11.12
C 700.32 2 350.16 19.26 P＜0.05
D 233.09 2 116.55 6.41

根据直观分析和方差分析可知，各因素对提取
工艺的影响程度依次为 C＞B＞D＞A，即提取时
间＞乙醇用量＞提取次数＞乙醇体积分数；且仅有
提取时间对工艺的影响显著（P＜0.05）。以总毒基
提取率为指标确定的最佳醇提工艺为 A2B2C3D2，即
以 10 倍量 80%乙醇溶液提取 2 次，每次 2.0 h。
2.2.3 验证试验 称取干蟾皮粗粉 50 g，共 3 份，
按最佳提取工艺条件进行平行试验。结果见表 4。
表明所采用的提取工艺简便、稳定，方法可行。
3 讨论
干蟾皮的活性成分与蟾酥基本一致[11]，其蟾毒
内酯类成分具有杀伤和抑制肿瘤细胞生长的作用[5]。
《中国药典》2010 年版以酯蟾毒配基和华蟾酥毒基
的总毒基量为蟾酥的质控指标。由于《中国药典》
中未收载干蟾皮，故本实验选择酯蟾毒配基和华蟾
表 4 验证试验
Table 4 Verification tests
试验号
酯蟾毒配基/
(μg·g−1)
华蟾酥毒基/
(μg·g−1)
总毒基/
(μg·g−1)
1 54.30 92.30 146.60
2 54.83 93.08 147.91
3 54.69 93.92 148.61
平均值 54.61 93.10 147.71

酥毒基的总毒基量为干蟾皮的考察指标，并对提取
工艺进行优化，结果表明采用醇提所得的总毒基量
明显高于水提所得的总毒基的量。
由于干蟾皮含有油脂性成分且与酯蟾毒配基和
华蟾酥毒基的化学性质极为相似，本实验曾采用石
油醚、氯仿等有机溶剂萃取法对供试品进行处理，
但这种液-液萃取法所得到的供试品中 2 个组分的
主峰之间出现拖尾现象，分离效果不佳，且杂质峰
干扰较大，对定量分析带来一定的影响。因此，本
实验采用硅胶柱色谱法对干蟾皮提取液进行纯化
处理[12-14]，以环己烷-丙酮-氯仿（4∶3∶3）为洗脱
液，使 2 种蟾毒配基能较完全地与其他成分分离。
经验证，该处理方法准确、有效，重现性好。
对 HPLC 法与 UPLC 法测定结果进行比较，结
试验号 A/% B/倍 C/ h D/次 酯蟾毒配基/(μg·g−1) 华蟾酥毒基/(μg·g−1) 总毒基/(μg·g−1)
1 70（1） 8（1） 1（1） 1（1） 38.99 57.28 96.27
2 70（1） 10（2） 1.5（2） 2（2） 55.19 71.35 126.54
3 70（1） 12（3） 2（3） 3（3） 61.45 63.63 125.08
4 80（2） 8（1） 1.5（2） 3（3） 50.20 58.89 109.09
5 80（2） 10（2） 2（3） 1（1） 59.72 76.79 136.51
6 80（2） 12（3） 1（1） 2（2） 62.87 54.16 117.03
7 90（3） 8（1） 2（3） 2（2） 65.01 66.11 131.12
8 90（3） 10（2） 1（1） 3（3） 59.29 60.97 120.26
9 90（3） 12（3） 1.5（2） 1（1） 47.89 56.66 104.55
K1 347.89 336.48 333.55 337.33
K2 362.62 383.31 340.18 374.68
K3 355.93 346.65 392.71 354.43
R 4.92 15.61 19.72 12.45
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果显示 HPLC 法中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的出峰
时间较长，一般在 30～40 min，而 UPLC 法中 2 个
组分的出峰时间明显缩短，仅为 12 min 左右；采用
HPLC 法测定蟾毒配基类成分所用的流动相系统主
要有甲醇-水、乙腈-水、乙腈-缓冲盐 3 种[15-17]，其
中甲醇-水系统需要的甲醇量较大，供试品的分析时
间较长；乙腈-水系统大大减少了有机溶剂的用量并
且有效地缩短了供试品的分析时间；乙腈-缓冲盐虽
能获得较好的分析效果，但由于磷酸盐在流动相中
的溶解度相对较小，易造成色谱仪的管路系统堵塞。
综合以上分析，本实验选择乙腈-水系统，并考察不
同流动相配比和不同体积流量条件下酯蟾毒配基和
华蟾酥毒基的分离效果。结果表明，以乙腈-水（30∶
70）为流动相，体积流量 0.3 mL/min，干蟾皮中酯
蟾毒配基和华蟾酥毒基能得到很好的分离。表明该
分析方法操作简便、灵敏度高。
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