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芫花高效液相色谱指纹图谱研究
逄楠楠 ,毕开顺 ,闫宝庆 ,陈晓辉 3 ①
(沈阳药科大学药学院 ,辽宁 沈阳 　110016)
摘 　要 :目的 　研究芫花药材的高效液相色谱指纹图谱。方法 　采用 RP2HPLC 法。色谱柱 : Kromasil C18 (250
mm ×4. 6 mm , 5μm) ,流动相 :甲醇20. 05 %磷酸水 ,梯度洗脱 ,体积流量 :1. 0 mL/ min ,柱温 :35 ℃,检测波长 :238
nm。结果 　在色谱指纹图谱中 ,确立了其中 21 个共有峰 ,建立了芫花药材的共有模式 ,在 19 批芫花药材中有 17
批样品的指纹图谱相似度在 0. 90 以上。结论 　该方法简便、准确、重现性好 ,为评价芫花药材的质量提供了依据。
关键词 :芫花 ;指纹图谱 ;RP2HPLC
中图分类号 :R28217 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0520818204
Fingerprint analysis of Flos Genkwa by HPLC
PAN G Nan2nan , BI Kai2shun , YAN Bao2qing , CH EN Xiao2hui
(School of Pharmacy , Shenyang Pharmaceutical University , Shenyang 110016 , China)
Abstract : Objective 　To establish t he chromatograp hic fingerp rint analysis for t he quality cont rol of
Flos Genkw a1 Methods 　RP2H PL C Met hod was applied to establish the chromatograp hic fingerp rint1 The
separation was performed on a Kromasil C18 column (250 mm ×4. 6 mm , 5μm) wit h a gradient elution
composed of met hanol and 0. 05 % p hosp hate acid1 The column temperat ure was set at 35 ℃and t he flow
rate was 1. 0 mL/ min1 The detective wavelength was at 238 nm1 Results 　Twenty2one characteristic peaks
were established in t he fingerp rint1 The mut ual model of Flos Genkw a was established and t he similarities
were calculated1 The similarity of 17 samples in all t he 19 samples was more t han 0. 901 Conclusion 　The
met hod is simple and accurate wit h good rep roducibility1 It can be used for t he quality cont rol of Flos
Genkw a1
Key words : Flos Genkw a ; fingerp rint ; RP2H PL C
　　芫花始载于《神农本草经》[ 1 ] ,为瑞香科植物芫
花 D a p hne genkw a Sieb1 et Zucc 的干燥花蕾 ,收载
于《中国药典》2005 年版 (一部) ,味苦、辛 ,性温 ,有
毒 ,归肺、脾、肾经[2 ] ,其为传统的泻下逐水药。内服
用于治疗水肿胀满、胸腹积水、痰饮积聚、气逆咳喘、
二便不利 ,外用治疗疥癣秃疮、冻疮。现代研究表明
芫花还具有镇痛、镇静、抗惊厥、抗炎、抗肿瘤、免疫
调节、抗生育等作用[3 ,4 ] 。
·818· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
①收稿日期 :2009209210　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :逄楠楠 (1984 —) ,女 ,山东龙口人 ,硕士研究生 ,研究方向为中药质量控制研究。
Tel : (024) 23986292 　E2mail :nnange132 @163. com3 通讯作者　陈晓辉　Tel : (024) 23986259 　E2mail :cxh_syphu @yahoo. com
《中国药典》2005 年版 (一部) 芫花项下仅有性
状、鉴别和炮制等项目 ,目前指标成分定量已有报
道[5 ] 。为更全面控制芫花药材的质量 ,本实验采用
RP2H PL C 法建立了芫花药材的色谱指纹图谱。指
纹图谱是顺应中药多组分、多靶点的整体综合作用
的特点 ,从“全成分”的角度出发的一种现代中药质
量控制方法 ,现广泛用于中药质量控制[6 ,7 ] ,该方法
准确 ,重现性好 ,操作简便可行 ,为评价芫花药材的
质量提供了依据。
1 　仪器与试剂
Agilent1100 高效液相色谱仪 ,四元泵 ,自动进
样器 ,在线脱气机 ,柱温箱 ,自动进样器 ,DAD 检测
器 (美国 Agilent 公司) ;BP210S 电子分析天平 (德
国赛多丽斯公司) 。
芫花素252O2β2D2茜黄樱草糖苷、芫花素252O2β2
D2葡萄糖苷、木犀草素、椴苷、芹菜素、羟基芫花素
和芫花素为自制 (经核磁和质谱确证结构 ,采用
H PL C 峰面积归一化法计算质量分数 ,质量分数均
大于 98. 5 %) ;甲醇 (色谱纯) ,磷酸 (色谱纯) ,水为
二次重蒸水。
芫花药材经沈阳药科大学中药学院孙启时教授
鉴定为芫花正品药材。其来源见表 1。
表 1 　芫花样品的来源
Table 1 　Origins of Flos Genkwa samples
样品编号 　来　源 样品编号 　来　源
1 安徽 1 11 山东 2
2 安徽 2 12 山东 1
3 福建 13 陕西
4 广东广州 14 山西 1
5 河北 15 山西 2
6 河南 16 辽宁沈阳
7 江西 17 四川
8 山东临沂 1 18 广东珠海
9 山东临沂 2 19 江苏
10 江苏南京
2 　方法与结果
2. 1 　色谱条件 :色谱柱为 Kromasil C18柱 (250 mm ×
4. 6 mm , 5μm ,大连中汇达公司) ;流动相 :甲醇 (A)2
0. 05 %磷酸水溶液 (B) :梯度洗脱程序 : 0 min , A2B
(15 ∶85) ;10 min , A2B (45 ∶55) ;22 min ,A2B (45 ∶
55) ;38 min ,A2B (60 ∶40) ;52 min ,A2B (95 ∶5) ;65
min ,A2B (95 ∶5) 。体积流量 : 1. 0 mL/ min ;检测波
长 :238 nm ;柱温 :35 ℃;进样量 :20μL。
2. 2 　对照品溶液的制备 :精密称取芫花素252O2β2
D2茜黄樱草糖苷、芫花素252O2β2D 葡萄糖苷、木犀
草素、椴苷、芹菜素、羟基芫花素和芫花素对照品适
量 ,置 5 mL 量瓶中 ,用色谱甲醇溶解并稀释至刻
度 ,摇匀 ,得含芫花素252O2β2D2茜黄樱草糖苷 0. 21
mg/ mL 、芫花素252O2β2D2葡萄糖苷 0. 20 mg/ mL ,
木犀草素 0. 22 mg/ mL 、椴苷 0. 25 mg/ mL 、芹菜素
0. 40 mg/ mL 、羟基芫花素 0. 38 mg/ mL 、芫花素
0. 36 mg/ mL的混合对照品溶液。
2. 3 　供试品溶液的制备 :取芫花药材粉末 0. 5 g ,精
密称定 ,置 50 mL 具塞锥形瓶中 ,精密加入 70 %甲
醇 20 mL ,密塞 ,称定质量 ,超声处理 20 min ,取出 ,
放冷 ,再称定质量 ,用 70 %甲醇补足减失的质量 ,摇
匀 ,经 0. 22μm 微孔滤膜滤过 ,取续滤液 ,即得。
2. 4 　指纹图谱方法学的考察
2. 4. 1 　精密度试验 :取芫花供试品溶液 ,在上述色
谱条件下重复进样 6 次 ,记录色谱图 ,结果表明 ,各
共有峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的
RSD 均小于 3. 0 % ,表明仪器精密度良好 ,符合指纹
图谱要求。
2. 4. 2 　重现性试验 :取芫花药材 ( No . 1) 6 份 ,按
“2. 3”项下制备供试品溶液 ,进样分析 ,记录色谱图 ,
计算各共有峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰
面积的 RSD 均小于 3. 0 % ,表明该方法重现性良
好 ,符合指纹图谱要求。
2. 4. 3 　稳定性试验 :取芫花供试品溶液 ,在室温下
放置 ,分别于 0、2、4、6、8、12、24 h 进样分析 ,计算各
共有峰与内参比峰的相对保留时间和相对峰面积的
RSD 均小于 3. 0 % ,表明该供试品在 24 h 内稳定。
2. 5 　芫花样品 H PL C 指纹图谱 :取所收集的芫花
药材粉末 0. 5 g ,精密称定 ,按“2. 3”项下方法制备
19 批供试品溶液 ,分别取各供试品溶液 20μL 进行
测定 ,记录色谱图。以芹菜素为内参比峰 ,确定了
21 个共有峰 ,指认了其中 7 个色谱峰 ,分别为芫花
素252O2β2D2茜黄樱草糖苷 (7 号) 、芫花素252O2β2D2
葡萄糖苷 (9 号) 、木犀草素 (11 号) 、椴苷 (12 号) 、芹
菜素 (14 号) 、羟基芫花素 (15 号) 和芫花素 (17 号) ,
色谱图见图 1 (2 号样品) 。
2. 6 　芫花样品聚类分析 :将各色谱峰面积相对于称
样量量化 ,应用“SPSS”软件对其进行系统聚类分
析 ,采用组间均联法 ( between2group linkage) ,以夹
角余弦 (co sin) 作为样品相似度的测度。聚类分析
将 19 批芫花样品分为 3 类 ,聚类分析结果见图 2。
2. 7 　芫花样品共有模式建立 :结合聚类分析结果 ,
从 19 批芫花药材中选取第 Ⅰ类的 9 个样品 (1、2、5、
7、8、14、16、17、19 号样品) ,采用国家药典委员会颁
布的中药色谱指纹图谱相似度评价系统 A 版 ,通过
色谱峰多点校正的方法对色谱峰进行自动匹配生成
药材的色谱指纹图谱共有模式 ,色谱图见图 3。
·918·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
72芫花素252O2β2D2茜黄樱草糖苷　92芫花素252O2β2D2葡萄糖苷
112木犀草素　122椴苷　142芹菜素　152羟基芫花素　172芫花素
72genkwanin252O2β2D2primeveroside 　92genkwanin252O2β2D2
glucoside 　112luteolin 　122tiliroside 　142apigenin
152hydroxygenkwanin 　172genkwanin
图 1 　芫花样品色谱指纹图谱
Fig. 1 　Chromatographic f ingerprint of Flos Genkwa
图 2 　聚类分析结果
Fig. 2 　Results of hierarchical cluster analysis
R2共有模式　S1～S921、2、5、7、8、14、16、17、19 号样品
R2mutual model 　S1 —S92nine batches of Flos Genkw a samples
number 1 ,2 ,5 ,7 ,8 ,14 ,16 ,17 , and 19
图 3 　9 批药材色谱图
Fig. 3 　Comparability of nine batches
of Flos Genkwa samples
2. 8 　各产地药材指纹图谱相似度评价 :采用国家
药典委员会颁布的中药色谱指纹图谱相似度评价系
统 B 版对上述 19 批药材的指纹图谱进行相似度的
分析 ,相似度结果见表 2。分析结果表明 ,相似度分
析结果与系统聚类结果一致 ,2 种方法得到了相互
验证。由相似度计算结果结合聚类分析和形态鉴定
结果 ,相似度在 0. 90 以上的可以认为该药材为推荐
品 ,0. 90 以下 (3 ,18 号)的为该药材的为非推荐品。
表 2 　相似度计算结果
Table 2 　Results of similarity analysis
样品编号 　来 　源 相似度 样品编号 　来 　源 相似度
1 安徽 1 0. 989 11 山东 2 0. 944
2 安徽 2 0. 974 12 山东 1 0. 934
3 福建 0. 873 13 陕西 0. 944
4 广东广州 0. 957 14 山西 1 0. 991
5 河北 0. 977 15 山西 2 0. 940
6 河南 0. 965 16 辽宁沈阳 0. 992
7 江西 0. 983 17 四川 0. 996
8 山东临沂 1 0. 991 18 广东珠海 0. 896
9 山东临沂 2 0. 944 19 江苏 0. 991
10 江苏南京 0. 934
3 　讨论
3. 1 　检测波长的选择 :采用 DAD 检测器考察了
190～400 nm 不同检测波长处的色谱图 ,结果表明
238 nm 处的色谱图特征性强 ,信息量大 ,各成分的
响应值较为均匀 ,具有良好的代表性 ,因此选择 238
nm 作为检测波长。
3. 2 　流动相系统的选择 :实验中考察了甲醇2水、甲
醇20. 1 %醋酸水、甲醇20. 05 %磷酸水、乙腈2水等多
种流动相系统 ,结果表明采用甲醇20. 05 %磷酸水溶
液作为流动相系统进行梯度洗脱时 ,各色谱峰分离
度较好 ,且基线平稳。同时 2 倍保留时间的色谱图
显示 ,65 min 后无其他色谱峰出现。
3. 3 　色谱柱的选择 :实验中考察了美国奥泰公司
Apollo C18 、美国 Dikma 公司 Diamonsil C18 、大连中
汇达公司 Kromasil C18 3 根不同厂家的色谱柱 ,结
果表明 ,采用 Kromasil C18色谱柱时基线平稳 ,色谱
峰数目较多 ,分离度和峰形较好 ,因此选择中汇达公
司的 Kromasil C18色谱柱进行指纹图谱研究。
3. 4 　提取方法的优化 :对多种提取方法进行了考察
和优化 ,分别对提取溶剂 (甲醇、乙醇、水以及不同比
例的甲醇2水溶液) 、提取方式 (超声、加热回流) 及提
取时间进行了考察 ,最终选择用 70 %甲醇超声 20
min ,方法简便 ,得到的色谱峰信息丰富。
　　芫花中含有多种化学成分 ,简单的测定一个或
几个有效成分的量为主的传统的质量分析方法不能
全面地反映药材的质量 ,因此建立全面、系统而又特
征地反映其化学成分的指纹图谱 ,可以为其质量评
价和控制提供一个有效的参考方法。
通过建立芫花高效液相色谱指纹图谱 ,确立了
21 个共有峰 ,并指认了其中 7 个色谱峰。这 7 个成
分在芫花对照指纹图谱中占共有峰总峰面积的
54. 1 % ,具有较强的特征性和代表性。结合聚类分
·028· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
析和相似度评价 ,发现不同产地的芫花药材指纹图
谱有一定的差别 ,21 个共有峰的相对保留时间符合
程度较好 ,但相对峰面积差别较大。由此说明不同
产地芫花药材质量差别较大 ,应用本实验所建立的
方法控制芫花药材的质量更为可靠。
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GAP 生产基地龙胆的质量控制及评价
曹 　悦1 ,2 ,左代英2 ,刘敬武3 ,孙启时2 3 ①
(11 辽宁省食品药品检验所 ,辽宁 沈阳 　110023 ;21 沈阳药科大学 ,辽宁 沈阳 　110016 ;
31 辽宁天瑞绿色产业科技开发有限公司 ,辽宁 清原 　113300)
摘 　要 :目的 　建立龙胆药材的指纹图谱研究方法并进行聚类分析。方法 　色谱柱为 Shimadzu C18 (3. 0 mm ×75
mm , 1. 7μm) ;流动相 :乙腈20. 4 %磷酸 (5. 5 ∶94. 5) ,体积流量 :0. 8 mL/ min ;检测波长 :240 nm ;柱温为 40 ℃。结
果 　獐牙菜苦苷、龙胆苦苷分别在 0. 154 8～1. 858 mg/ mL ,0. 322～5. 152 mg/ mL 呈良好的线性关系 ,平均回收率
分别为 102. 09 % ,RSD = 1. 68 %( n = 6) ;103. 80 % ,RSD = 1. 11 %( n = 6) 。指纹图谱的精密度与重现性试验中的各
色谱峰的相对保留时间与相对峰面积的 RSD 小于 2. 1 % ,指纹图谱相似度结果与聚类分析谱系图一致。结论 　建
立的指纹图谱适用于龙胆药材的标准化种植及质量控制。
关键词 :龙胆 ;指纹图谱 ;聚类分析 ;超高效液相色谱法
中图分类号 :R28411 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0520821205
Quality control and evaluation of Ra dix et Rhizoma Gentia nae from GAP production base
CAO Yue1 ,2 , ZUO Dai2ying2 , L IU Jing2wu3 , SUN Qi2shi2
(11Liaoning Provincial Institute of Food and Drug Control , Shenyang 110023 , China ; 21 Shenyang Pharmaceutical University ,
Shenyang 110016 , China ; 31Liaoning Tianrui Science and Technology Development Co1 , L td1 , Qingyuan 113300 , China)
Abstract : Objective 　To establish met hod for t he fingerp rint of R adi x et R hi z om a Genti anae using
U FL C wit h t he hierarchical cluster analysis1 Methods 　Column : Shimadzu C18 (3. 0 mm ×75 mm , 1. 7
μm) ;mobile p hase : Acetonit rile20. 4 % p hosp horylation (5. 5 ∶94. 5) ; flow rate : 0. 8 mL/ min ; detection
wavelengt h : 240 nm ; temperat ure : 40 ℃1 Results 　This met hod had a good linearity in t he range of 0. 154
8 —1. 858 mg/ mL , and t he average recovery was 102. 09 % wit h RSD of 1. 68 % for swertiamarin1 It had a
good linearity in t he range of 0. 322 —5. 152 mg/ mL , and t he average recovery was 103. 80 % wit h RSD of
1. 11 % for gentiopicroside1 The RSD of precision and rep roducibility were lower t han 2. 1 %1 The result of
fingerp rint studying was t he same wit h t he hierarchical cluster analysis1 Conclusion 　This met hod can be
used as standardized implantation and quality cont rol of R adi x et R hi z om a Genti anae1
Key words : R adi x et R hi z om a Genti anae ; fingerp rint ; hierarchical cluster analysis ; U FL C
　　龙胆为龙胆科植物条叶龙胆 Genti ana m anshu2
rica Kitag1 、龙胆 G1 scabra Bunge、三花龙胆 G1 t ri f lora Pall1 或坚龙胆 G1 ri gescens Franch1 的干燥根及根茎[1 ] 。前三者习称“龙胆”,后一种习称“坚
·128·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
①收稿日期 :2009209222　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :国家科技支持计划 (2006DAI06A05208)
作者简介 :曹　悦 (1978 —) ,男 ,辽宁沈阳人 ,硕士研究生 ,主管药师 ,主要从事药品分析检验。
Tel : (024) 25425645 　E2mail :cy_0319 @163. com3 通讯作者　孙启时　Tel : (024) 23986468 　E2mail : sunqishi @sina. com