全 文 ：补阳还五汤预先干预对大鼠脑死亡后心肺炎症细胞因子表达的抑制作用
陈 洁1 ,曾耀英2 ,曾慧兰3 , 刘嘉雯1 , 苏泽轩1 ,郝彤彤1
( 1 暨南大学附属第一医院 泌尿外科/肾移植科,广东 广州 510630; 2 暨南大学 组织移植与免疫中心,
广东 广州 510632; 3 暨南大学附属第一医院 血液科,广东 广州 510630)
摘 要:目的 观察补阳还五汤预先干预大鼠抑制其脑死亡后心、肺炎症细胞因子表达。方法 雄性 Wistar 大鼠
30 只 ,体质量 180~ 200 g, 随机分 3 组。对照组:正常大鼠麻醉后取心和肺; 脑死亡模型组:诱导大鼠脑死亡;补阳
还五汤组:脑死亡诱导前 7 d, 连续每天 1 次给大鼠 ig 补阳还五汤水煎剂 ( 1 8 mL / 100 g , 12 6 g/ kg )。大鼠脑死
亡诱导成功, 机械呼吸 6 h,若平均动脉压大于 80 mmH g ,则取其心和肺。RTPCR 检测心、肺组织肿瘤坏死因子
( TNF) 和白细胞介素1 ( IL1) mRNA 表达, Western blott ing 检测心、肺组织 TNF和 IL1蛋白及磷酸化
p38 丝裂原活化蛋白激酶 ( pp38M APK ) 蛋白表达。结果 模型组心肺 T NF、IL1 mRNA 和蛋白表达及 p
p38MAPK 蛋白表达比对照组显著增加 ( P< 0 01)。补阳还五汤组各指标比模型组显著降低 (P < 0 05) ,但仍比
对照组显著增加 (P< 0 01)。结论 补阳还五汤预先干预大鼠能显著抑制其脑死亡后心肺炎症细胞因子表达, 可
能与其在不同层面阻断 p38M APK 信号通路关键靶点有关。
关键词:补阳还五汤; 脑死亡; 炎症细胞因子; p38 丝裂原活化蛋白激酶
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05075705
Inhibition on inflammatory cytokine expressions in heart and lung from brain death rats
pretreated with Buyang Huanwu Decoction
CHEN Jie1 , ZENG Yaoy ing2 , ZEN G Huilan3 , L IU Jiawen1 , SU Zexuan1 , HAO T ongtong1
( 1Depart ment o f U ro log y and Organ T ransplantation, the First A ffiliated H ospital of Jinan U niversit y, Guang zhou 510630,
China; 2. Institution of T issue T ransplantation and Immunology, Jinan Univer sity, Guangzhou 510632, China;
3. Department of H ematolog y, the Fir st Aff iliated H ospital of Jinan Univ ersity , Guang zhou 510630, China)
Abstract: Objective To observe the inhibit ion of inf lammatory cytokine expr essions in hearts and
lungs f rom brain death ( BD) rats pret reated w ith Buyang Huanwu Decoction ( BYHWT ) . Methods Male
Wistar rats, w eighing f rom 180 to 200 g , w er e random ly divided into three exper imental groups: cont ro l
group ( n= 10) : hear ts and lungs w ere got ten f rom normal rats after anesthesia; BD g roup ( n= 10) : rat
brain death w as gradually induced; BYHWT + BD gr oup ( n= 10) : 7 d before BD induction, rats w ere ig
administer ed w ith BYHWT ( 1. 8 mL/ 100 g ) once daily. Six hours after successful onset of BD, only the
rats w ho se mean arterial blood pressure w ere more than 80 mmHg were accepted as BD donor s. Hearts and
lungs w ere then obtained. RTPCR was used to detect the expressions of T NFand IL1mRNA. West
ern blo tt ing method w as applied to determining the expressions of both T NFand IL1 proteins, and the
phosphory lated p38 MAPK ( pp38 MA PK) proteins. Results The expressions of mRNA and protein lev
els of both TNFand IL1, and also the pp38 MAPK pro teins levels, w ere significant ly enhanced in BD
group compared to the control g roup ( P< 0 01) . While those in BYHWT + BD group w er e stat ist ically
decreased ( P< 0 05) compared to BD group, but they w ere still significant ly increased ( P< 0 01) in com
parison w ith the contro l gr oup. Conclusion Pretr eatment of the r ats w ith BYHWT prior to the induct ion
of rat brain death could significant ly suppress the expression of inf lammatory cy tokines in the hearts and
lungs from BD rats. This phenomenon may relate to the blockage o f key tar get points in p38 MAPK signa
l ing pathw ay .
Key words: Buyang Huanwu Decoct ion; brain death ( BD) ; inf lammatory cytokine; p38 m ito genact i
vated pro tein kinase ( p38 MAPK)
757 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090929 基金项目:教育部留学回国人员科研启动基金资助项目 (教外司留[ 2006] 331) ; 教育部科学技术研究重点项目 ( 206108) ; 国家中医药管理局留学回国人员科技活动择优资助项目 (国中医药研 2006L HR04号)作者简介:陈 洁( 1965 ! ) ,男,江苏苏州人,博士,副教授,副主任医师,硕士生导师,从事临床肾移植医疗和科研工作,研究方向为提高脑死亡供体器官质量与移植物长期存活和功能。T el : 13631383297 Email: jkcharite@ yahoo. com. cn
脑死亡供体器官在许多国家和地区已越来越多
地成为临床器官移植供体的主要来源[ 1]。实验和临
床研究[ 2~ 4] 显示来自脑死亡供体的肝、心、肾、肺移
植后发生急慢性排斥反应的速度比来自活体供体的
明显加快,这与脑死亡供体器官免疫原性增高关系
密切。移植前降低脑死亡供体器官的免疫原性成为
移植界关注的热门话题[ 5~ 8] 。而中药在这一领域的
研究鲜有报道。经典古方补阳还五汤是历来中医临
床治疗中风病的常用方, 有补气、活血、通络等多方
面作用,对中风后遗症疗效显著。近年来研究发现,
补阳还五汤治疗缺血性脑血管疾病[ 9, 10] , 可减轻缺
血再灌注损伤的收缩脑血管的作用,还能很好地清
除氧自由基,增加对常压缺氧的耐力,抑制血小板聚
集和血栓形成[ 11] ,但研究主要集中在防治脑缺血再
灌注损伤方面, 在治疗心肺缺血再灌注损伤功效方
面研究尚不多见。本实验旨在诱导大鼠脑死亡前预
先用补阳还五汤干预, 观察补阳还五汤对大鼠脑死
亡后心、肺炎症细胞因子:肿瘤坏死因子( T NF)
和白细胞介素1( IL1) mRNA 和蛋白表达以及
磷酸化 p38 丝裂原活化蛋白激酶 ( pp38 MAPK)
蛋白表达的调控作用, 为中药在降低脑死亡供体器
官免疫原性方面探索新的途径。
1 材料
11 实验动物: Wistar 大鼠 30 只, 雄性, SPF 级,体
质量 180~ 200 g,购自南方医科大学实验动物中心。
1 2 实验仪器: Leica 显微镜 ( WILD M 690 德国) ,
ALC ! V8A 动物呼吸机 (上海奥尔科特生物科技
有限公司) , BL ! 420E+ 生物机能实验系统 (成都
泰盟科技有限公司) ,显微外科手术器械 1 套。T 1
Thermocycler 型 PCR 仪 ( Biometra 公司) ,凝胶扫
描分析系统 ( Muli Genius 公司) , DU ! 640 型蛋
白/核酸分析仪 ( Beckman 公司) , 6131 型蛋白检测
仪和 5804R 型高速冷冻离心机 ( Eppendor f 公司) ,
SD 半干转印仪 ( BioRad 公司) ,水平、垂直电泳系
统 ( Amersham Pharmacia Biotech 公司)。
1 3 实验试剂:酶制剂 MMLV 购自 Promega 公
司, RNase 抑制剂、RNasefr ee DNase I、Realtime
PCR Master Mix 均购自 T akara 公司; Wester n
blo tt ing 相关试剂、Western 及 IP 细胞裂解液、
BCA 蛋白浓度测定试剂盒购自 Beyot ime 公司,
PVDF 膜购自 BioRad 公司, IL1羊多克隆抗体、
TNF兔多克隆抗体、pp38 鼠单克隆抗体购自
Santa Cr uz 公司, act in 鼠单克隆抗体购自 Protein
Tech Group. Inc. , HRP 标记山羊抗兔 IgG ( H +
L)、HRP 标记兔抗羊 IgG ( H+ L)、HRP 标记羊抗
小鼠 IgM 均购自北京博奥森生物技术有限公司,增
强型 HRPDAB 底物显色试剂盒购自 TianGen 公
司; 蛋白及核酸分子量标准 Prestained Pr otein
M arker 购自 Fermentas公司, 150 bp DNA Marker
购自 Takar a 公司; RN A 抽提试剂 Trizol 购自 In
vit rog en 公司, DEPC 购自 SigmaA ldrich 公司。
1 4 补阳还五汤处方组成及剂型:补阳还五汤由黄
芪 120 g、当归尾 3 g,赤芍 5 g,地龙 3 g、川芎 3 g、
红花 3 g、桃仁 3 g 组成[ 12]。常规方法制备水煎剂,
煎成 200 mL,生药质量浓度 0 70 g / mL, 4 ∀ 冰箱
保存。
2 方法
2 1 大鼠脑死亡模型的建立:采用渐进式诱导大鼠
脑死亡[ 13, 14] 。大鼠以 10% 水合氯醛 ( 0 3 mL/ 100
g ) ip 麻醉, 手术视野 70% 乙醇消毒, 仰卧位,左下
肢外展,左侧股动脉用 PE50 导管插管, 远端连接
BL ! 420+ 生物机能实验系统, 持续测定有创动脉
压,将钝头套管插入气管行气管插管。再俯卧位,剪
去头部皮肤、肌肉、骨膜, 在大鼠矢状线中点右侧
0 2~ 0 5 cm 处钻一直径 1 mm 的孔, 将 3F
Fogarty 导 管 ( Fogarty Arterial Embolectomy
Catheter 3F ; Baxter Healthcare Co . , Irvine, CA)
垂直插入颅内, 缓慢注入生理盐水 ( 160~ 170 L)
逐渐增大导管气囊,增加颅内压,形成脑干疝和脑死
亡。脑死亡诱导后气管套管远端接动物呼吸机,持续
人工呼吸 6 h,频率 102 次/ min,潮气量 4 mL。脑死
亡诱导成功标准:反射消失;自主呼吸停止;瞳孔散大
固定。
2 2 分组及补阳还五汤预先干预方案:大鼠随机分
为 3组,对照组: 正常大鼠麻醉后取心和肺组织; 脑
死亡模型组:诱导大鼠脑死亡; 补阳还五汤组:诱导
大鼠脑死亡前, 每天 1 次 ig 补阳还五汤水煎剂
( 1 8 mL/ 100 g ,剂量为 12 6 g/ kg [ 15] ) ,连续 7 d,第
8天诱导大鼠脑死亡。
2 3 标本获取与保存: 大鼠脑死亡诱导成功 6 h
后,如平均动脉压大于 80 mmHg ,就成为脑死亡供
体,获取心、肺组织, - 80 ∀ 冰箱和 RTPCR 保存
液保存。
2 4 RTPCR 检测心、肺 TNF、IL1 mRNA 表
达:采用 Primer 5. 0 设计引物,上海生工生物公司
合 成。 TNF: 上 游 引 物 5#CAGACCCT CA
CACTCAGATCAT C3#, 下 游 引 物 3#GTCG
GCT AAACGGT AAAGTAT5#,产物长度 269 bp。
758 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
IL1: 上游引物 5#GAAAT AGCAGCTT T CGA
CAGTGAG3#, 下游引物 3#CCTGGGT TCGT G
GAAGAAAAG5#,产物长度 254 bp。GA PDH: 上
游引物 5#T GTT CCT ACCCCCAAT GT GTC3#, 下
游引物 3#CGCT GAAGT TGTCGTT GAGGG5#,
产物长度 170 bp。RNA 提取试剂盒提取总 RNA。
依 RTPCR 试剂盒说明操作,扩增条件: 94 ∀ 、30 s,
60 ∀ 、45 s, 72 ∀ 、1 min, 30 个循环,最后 72 ∀ 延伸
4 min。取 5 L 扩增产物, 2% 琼脂糖凝胶电泳。
2 5 Wester n blot t ing 检测 IL1、T NF和 p
p38MAPK 蛋白表达: 配细胞裂解液提取细胞总蛋
白, BCA 法测定总蛋白浓度。各样本提取等量总蛋
白。经 100 ∀ 5 min 变性后,进行 SDSPAGE。电
泳后将凝胶上的蛋白条带电转移至 PVDF 膜。一
抗 ( 1∃ 200) 4 ∀ 孵育过夜,二抗 ( 1∃ 2 000) 室温
孵育 1 h。增强型 HRPDA B 底物显色, 显色完毕
后拍照,并用 Alpha EaseFC 软件分析 TFN、IL
1和 pp38MAPK 蛋白的表达量。
2 6 统计学处理: 所有数据以 x % s 表示, 应用
SPSS 13 0 统计软件进行分析,多个样本间比较行
Onew ary ANOVA 分析。
3 结果
3 1 RTPCR 检测心、肺 TNF和 IL1 mRNA
表达:模型组心、肺组织 T NF和 IL1mRNA 表
达比对照组明显增加 ( P< 0 01)。补阳还五汤组
心、肺组织 T NF和 IL1 mRNA 表达显著低于
模型组 ( P< 0 05) , 但仍较对照组明显增高 ( P<
0 01) , 3组间心、肺 TNF和 IL1mRNA 表达差
异具有统计学意义 ( P< 0 05) ,结果见图 1和表 1。
3 2 Western blot t ing检测心、肺组织T NF和
MM ark er 1对照组 2模型组 3补阳还五汤组
MMarker 1cont rol group 2model group 3BYHWT group
图 1 RTPCR 检测心、肺组织 TNF和 IL1 mRNA表达
Fig. 1 RTPCR Detection of TNF and IL1 mRNA expressions in heart and lung tissues
表 1 补阳还五汤对脑死亡大鼠心、肺组织 TNF和 IL1
mRNA 表达的影响 ( x% s, n= 10)
Table 1 Ef fect of BYHWT on expression of TNF
and IL1 mRNA in heart and lung tissues
of BD rats ( x% s, n= 10)
组别
剂量/
( g kg- 1 )
心脏
TNF IL1
肺脏
TNF IL1
对照 - 0030 % 0 008 0 180% 0009 0150% 0012 0120 % 0013
模型 - 0340 % 0 012* * 0 430% 0012* * 0580% 0007* * 0450 % 0012* *
补阳还五汤 12 6 0220 % 0 011* * & 0 240% 0008* * & 0210% 0009* * & 0230 % 0012* * &
与对照组比较: * * P < 0 01; 与模型组比较: &P < 0 05
* * P< 0 01 v s cont rol gr ou p; &P< 0 05 v s m odel group
IL1蛋白表达:模型组心、肺组织 T NF和 IL1
蛋白表达比对照组明显增加 ( P< 0 01)。补阳还五
汤组心、肺组织 T NF和 IL1蛋白表达显著低于
模型组 ( P< 0 05) , 但仍比对照组显著增高 ( P <
0 01)。组间心、肺组织 TNF和 IL1蛋白表达
差异具有统计学意义 ( P< 005) ,结果见图2和表 2。
3 3 Western blott ing 检测心、肺组织 pp38MAPK
蛋白表达:模型组心、肺组织 pp38MAPK 蛋白表达
比对照组明显增加 ( P< 0 01)。补阳还五汤组心、肺
组织 pp38MAPK 蛋白表达显著低于模型组 ( P<
0 05) ,但较对照组显著增高 ( P< 0 01)。各组间心、
肺组织 pp38MAPK 蛋白表达差异具有统计学意义
( P< 0 05) ,结果见图2和表 2。
4 讨论
供体脑死亡后外周器官缺血缺氧、促炎细胞因
子过度释放、炎性细胞快速浸润,这些早期非特异性
炎症反应强化了移植后的免疫反应, 加速移植后急、
慢性排斥反应发生, 影响移植器官功能和长期存
活[ 1 ]。因此,移植前降低脑死亡供体器官免疫状态
是器官移植界一项新的研究策略。
759 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
1补阳还五汤组 2模型组 3对照组
1BYHWT group 2model group 3cont rol group
图 2 Western blotting 检测心、肺组织 TNF、IL1和 p p38MAPK 蛋白表达
Fig. 2 Western blotting detection of TNF, IL1, and pp38MAPK protein expressions in heart and lung tissues
表 2 补阳还五汤对脑死亡大鼠心、肺组织 TNF、IL1和 pp38MAPK蛋白表达的影响 ( x % s, n= 10)
Table 2 Effect of BYHWT on TNF, IL1, and p p38MAPK protein expressions
in heart and lung tissues of BD rats ( x % s, n= 10)
组别 剂量/
( g kg- 1 )
心脏
TNF IL1 pp38M APK
肺脏
TNF IL1 pp38M APK
对照 - 0 002 0 % 0 000 4 0 080 0 % 0 002 0 0 030 0 % 0 000 4 0 002 0 % 0 000 5 0 002 0 % 0 000 4 0 003 0 % 0 000 4
模型 - 0 090 0 % 0 005 0* * 0 270 0 % 0 006 0* * 0 260 0 % 0 004 0* * 0 190 0 % 0 008 0* * 0 190 0 % 0 006 0* * 0 170 0 % 0 005 0* *
补阳还五汤 12 6 0 070 0 % 0 005 0* * & 0 170 0 % 0 008 0* * & 0 130 0 % 0 004 0* * & 0 130 0 % 0 010 0* * & 0 140 0 % 0 006 0* * & 0 008 0 % 0 006 0* * &
与对照组比较: * * P < 0 01; 与模型组比较: &P < 0 05
* * P< 0 01 v s cont rol gr ou p; &P< 0 05 v s m odel group
本实验诱导大鼠脑死亡后,发现心肺 TNF及
IL1表达比对照组明显增加 ( P< 0 01)。用补阳
还五汤预先干预大鼠, 再诱导脑死亡, 心肺 T NF
及 IL1表达比模型组显著降低 ( P< 0 05) , 说明
补阳还五汤可显著抑制 TN F及 IL1的表达, 一
定程度上降低心肺免疫原性。
p38MAPK 是丝裂原活化蛋白激酶的一个亚
类, p38MAPK 信号通路参与炎症反应调控 [ 16]。缺
血再灌注损伤动物实验中, p38MAPK 磷酸化导致
肾脏 T NF、IL1明显表达, 是肾脏炎症损伤的重
要因素。本实验发现, 单纯脑死亡大鼠心肺
p38MAPK 磷酸化水平比正常大鼠显著升高 ( P<
0 01) ,补阳还五汤预先干预后心肺 p38MAPK 磷
酸化水平比单纯脑死亡时明显降低 ( P< 0 05) , 同
时发现心肺 p38MAPK 磷酸化水平升高和降低, 与
心肺 T NF及 IL1表达增加和减少相一致。与
前期研究结果相一致 [ 17] ,补阳还五汤有可能通过抑
制 p38MAPK 信号通路的某些关键靶点,抑制了炎
症细胞因子的表达。究竟是信号通路的哪些关键靶
点受到了抑制,将在今后的进一步研究中证实。
本研究结果表明用补阳还五汤预先干预大鼠,
能显著抑制脑死亡后心肺炎症细胞因子表达,为中
药在降低脑死亡供体器官免疫原性方面探索新的
途径。
参考文献:
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( 11) : 15091511
葎草酮对人胃癌细胞 SGC7901 N乙酰基转移酶 1活性
及基因表达的抑制作用
高世勇1, 2 ,郎 朗1, 2 ,邹 翔1, 2 ,汲晨锋1, 2 ,季宇彬1, 2 , 马 强1, 2 , 岳 磊1, 2 ,曲中原1, 2 ,尚 明1, 2
( 1 哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心 药物研究所博士后科研流动站,黑龙江 哈尔滨 150076;
2 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心, 黑龙江 哈尔滨 150076)
摘 要:目的 探讨葎草酮抗肿瘤作用以及其与 N乙酰基转移酶 1 ( NAT1 酶) 之间的关系。方法 采用 H PLC
法,以对氨基苯甲酸 ( PABA ) 为底物,测定 PABA 被 NAT1 乙酰化为乙酰化对氨基苯甲酸 ( Ac PABA) 的量, 间
接反映 NAT1 酶的活性。采用 RTPCR 法,测定葎草酮对 NAT1 mRNA 表达的影响。结果 葎草酮能够显著降
低 SGC7901 完整细胞和细胞质中 AcPABA 的生成量;随着作用时间的增加, A cPABA 的生成量逐渐增加, 但与
其相同时间点的阴性对照组比较, 葎草酮组 AcPABA 的生成量明显减少; 葎草酮能够降低 SGC7901 细胞中
NAT1 mRNA 的表达。结论 葎草酮通过抑制 NAT1 的活性和基因表达两个方面减少芳香胺类化合物代谢为乙
酰化的芳香胺类致癌物的量,从而预防癌症的发生,防止癌症的进一步恶化。
关键词:葎草酮; 人胃癌细胞 SGC7901; N乙酰基转移酶 1 ( NAT1) ; NAT1 mRNA 表达
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05076106
Inhibition of humulon on arylamine Nacetyltransferase1 activity and gene expression
in SGC7901 cells
GAO Shiyong1, 2 , LANG Lang 1, 2 , ZOU Xiang1, 2 , JI Chenfeng1 , 2 , JI Yubin1, 2 ,
M A Qiang
1, 2
, YUE Lei
1, 2
, QU Zhongyuan1, 2 , SHANG M ing1, 2
( 1 Postdoctor al Research Station, Institut e o f Mater ia Medica, Center of Research and Development on Life Sciences
and Env ironment Sciences of H arbin Univ ersity of Commerce, Harbin 150076, China; 2. M OE Eng ineering
Research Center of Natural Anticancer Drug s, H arbin Univer sity o f Commerce, H arbin 150076, China)
Abstract: Objective To study the ant itumor effects o f humulon on ar ylamine Nacety lt ransferase1
( NAT 1) act ivity. Methods Employ ing H PLC, using PA BA as subst rate, in intact SGC7901 cells and
their cytoplasm, making PABA being acety lated to AcPABA by NAT1 as the activity of NAT 1. Rever se
tr anscriptase polymerase chain react ion ( RTPCR) assay w as used to study the expression o f the NAT1
mRNA. Results The results show that humulon could inhibit the product ion of AcPABA in intact SGC
7901 cell and the cy toplasm , the product ion of AcPABA was g radually increased w ith the interact ion t ime
increasing. But comparing w ith corr esponding negat iv e contro l group#s, the production of AcPABA was
761 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091210 基金项目:国家自然科学基金资助项目 ( 30873403) ; 黑龙江省教育厅重点项目 ( 11511102)作者简介:高世勇( 1975 ! ) ,男,博士,副研究员,硕士生导师,哈尔滨商业大学药物研究所所长,研究方向为肿瘤药理学。
Email: sygao2002@ 163. com