全 文 ：高疗效,减少服用剂量和便于质量控制,同时也方便
于制剂成型的目的。本实验采用多组分 HPLC 法
测定,既控制了吴茱萸生物碱类成分,又控制了柠檬
苦素类成分,为后期纯化工艺提供了保障。吴茱萸
碱和吴茱萸次碱不溶于水、酸水和碱水等水溶性溶
剂[ 7] ,柠檬苦素类化合物属于三萜类似物,易溶于有
机溶剂,在甲醇、乙醇中溶解度较大,难溶于水[ 8] , 故
可以采用水沉工艺进行纯化。但从实验中发现, 柠
檬苦素随着 pH 值增大溶解度也增大, 在碱性水溶
液中柠檬苦素的溶解度增大, 而在酸性水溶液中溶
解度较低,这可能与其结构中含有内酯键、醛基和醚
键有关,能够表现酸性。
应用氧化铝柱对物质进行分离纯化,是溶剂对
化合物的溶解力和氧化铝柱的吸附能力的一个综合
结果。本实验开始采用湿法上样,但适度洗脱液不
能完全溶解沉淀,在洗脱过程中容易堵塞色谱柱, 采
用干法上样能较好解决此问题。在洗脱液的考察
时,发现吴茱萸碱和吴茱萸次碱在极性较低(环己
烷、二氯甲烷)的洗脱液就能被洗脱下来, 而柠檬苦
素要在极性较强的洗脱剂(醋酸乙酯)才能被洗脱下
来,根据相似相溶原理,吴茱萸碱和吴茱萸次碱属于
吲哚类生物碱,极性较弱,而柠檬苦素含有多个氧原
子,极性相对较强些。
本实验先进行醇提水沉工艺, 然后中性氧化铝
柱色谱纯化吴茱萸中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和柠檬
苦素,并达到了有效部位的要求,便于制剂成型。该
工艺可用于吴茱萸的活性成分的纯化,且经济简便,
易于操作,转移率较高。
参考文献:
[ 1] 李 飞 方剂学[ M ] 北京:人民卫生出版社, 2002
[ 2] 徐继华,刘文英,屠旦来 吴茱萸多糖的分离和组成研究 [ J]
中草药, 2009, 40( 4) : 573576
[ 3] 于静华,刘春禹,吕小丹, 等 吴荣萸药理研究进展 [ J ] 吉林
中医药, 2005, 25( 2) : 53
[ 4] Atsuda H , Yoshikaw a M, linuma M, e t al Ant inocicept ive
an d ant iinf lammatory act ivit ies of lim on in is olated f rom the
f ruit s of Evodia ru taecar p a var bodinieri [ J] Planta Med ,
1998, 64: 339342
[ 5] 李 丽,贾 英,陈晓辉,等 HPLC法同时测定吴茱萸中吴茱
萸苦素和柠檬苦素的含量[ J] 中国天然产物, 2003, 1( 3) : 158
160
[ 6] 鲍天冬,董 宇,杨 庆,等 高效液相色谱法同时测定制吴茱
萸及其提取物中吴茱萸碱、吴茱萸次碱和吴茱萸内酯含量[ J]
中国实验方剂学杂志, 2007, 13( 6) : 13
[ 7] 柯铭清 中草药有效成分理化与药理特性[ M ] 长沙:湖南科
学技术出版社, 1982
[ 8] 杨 云,张 晶, 陈玉婷 天然药物化学成分提取分离手册
[ M ] 北京:中国中医出版社, 2003
板蓝根多糖的降解和单糖组成的毛细管区带电泳测定研究
郭怀忠1, 2 , 张 斌1 , 徐相涛1 ,张硕敏1
( 1 河北大学药学院,河北 保定 071002; 2 河北省药物质量分析控制重点实验室, 河北 保定 071002)
摘 要:目的 优化板蓝根多糖的提取、降解工艺,并对其单糖组成进行测定。方法 通过正交试验对板蓝根多糖
的提取和降解条件进行优化。以 1苯基3甲基5吡唑啉酮( PMP)为单糖的柱前衍生化试剂,用毛细管区带电泳
法( CZE)测定板蓝根多糖的单糖组成。结果 板蓝根多糖最佳降解条件为: 1 mo l/ L 硫酸溶液, 95 恒温降解5 h。
板蓝根多糖由木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖等组成。结论 采用优化工艺提取和降解板蓝根多
糖,结果稳定, 重现性好,毛细管区带电泳法用于板蓝根多糖的单糖组成测定及其质量控制,准确, 可靠,结果满意。
关键词:板蓝根; 多糖;正交试验; 衍生; PMP; 单糖
中图分类号: R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05074404
板蓝根为十字花科植物菘蓝 I sati s indigotica
For t 的干燥根,始载于!神农本草经∀, 性寒、味苦,
归心、胃经,有清热解毒、凉血消肿的功效 [ 1]。研究
表明板蓝根含有靛玉红、靛蓝、多种氨基酸和多糖等
成分[ 2]。有些糖类在抗肿瘤、抗肝炎、抗心血管疾
病、抗衰老等方面具有独特的生物活性[ 3]。目前有
报道板蓝根多糖为均多糖,单糖组成为木糖[ 4]。本
实验采用 1苯基3甲基5吡唑啉酮( PM P)进行单
#744# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090828 基金项目:河北大学自然科学基金资助项目( 2007111)作者简介:郭怀忠( 1968 ∃ ) ,男,内蒙古商都县人,副教授,博士, 2005年 7月获沈阳药科大学药物分析专业理学博士学位, 2005年 10月于天津大学药学院从事教学和科研工作, 2007年 7月至今工作于河北大学药学院,承担国家 863计划以及国家自然基金等项目的科研工作,参加国家药典委员会项目% 板蓝根注射液指纹图谱研究&工作, 获得实用新型专利 1项,发表论文 30余篇,研究方向为中药质量控制及其药效学研究、色谱分析。Tel: ( 0312) 5971107 Em ail: gh uaizh@ yahoo com cn
糖衍生,高效毛细管电泳法测定板蓝根多糖中的单
糖组成,为板蓝根多糖的质量控制提供参考。
1 仪器与试药
CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪
器有限公司) ; H W2000色谱工作站; PHS ∃ 3C型酸
度计(上海理达仪器厂) ; L500低速自动平衡离心机
(长沙湘仪离心机仪器有限公司) ; T6紫外分光光度
计(北京普析通用仪器有限责任公司) ; 毛细管柱( 50
cm ∋ 50 m,有效长度 40 cm, 河北永年锐沣色谱器
件有限公司)。
1苯基3甲基5吡唑啉酮 ( PMP, 日照力德士
化工有限公司, 批号 20090324) ; D木糖(保定市化
工二厂提供, 批号 20070908) , D阿拉伯糖(北京索
莱宝科技有限公司分装, SigmaA3131, 批号 D8120,
质量分数(99 0%) , D葡萄糖(天津市福晨化学试
剂厂, 批号 20070927,分析纯) , L鼠李糖(合肥博美
生物科技有限责任公司, 批号 20081020, 质量分
数(98 0% ) , D甘露糖 (北京索莱宝科技有限公
司,批号 20090108, 质量分数(99 5% ) , D半乳糖
(北京索莱宝科技有限公司分装, Amresco 0637, 批
号 D8310, 质量分数(99 0% ) ; 其他试剂均为分析
纯;乙醇(医用规格) ;蒸馏水。
板蓝根药材为市售, 经保定市药品检验所田桂
敏副主任药师鉴定为十字花科植物菘蓝 I sati s in
digotica Fort 的干燥根。
2 方法与结果
2 1 板蓝根多糖的提取与纯化[ 5] :取 20 g 板蓝根
药材,置于 250 mL 蒸馏烧瓶中, 分 3次回流提取,
蒸馏水加入量分为 200、100、100 mL; 回流时间分别
为 120、60、30 min。提取液合并后, 离心, 减压浓
缩,加入乙醇使含醇量为 85%, 静置过夜。离心后
收集下层固体, 并溶于水中。活性炭脱色后, 采用
Sevag 法除蛋白,再加水至 40 mL,加乙醇使含醇量
为 85% ,静置过夜, 离心收集下层固体,并于 60
下真空干燥,即得板蓝根多糖。精密称取板蓝根多
糖10 mg ,加水溶解,移至 100 mL 量瓶中,加水稀释
至刻度,摇匀, 在 200~ 300 nm 进行紫外扫描, 结果
未发现蛋白质和核酸的特征吸收峰。
2 2 多糖的毛细管电泳测定
2 2 1 电泳条件:未涂层弹性石英毛细管柱( 50 cm∋
50 m,有效长度 40 cm) ,缓冲液为 180 mmol/ L 硼酸
溶液( 0 3 mol/ L NaOH 溶液调 pH 值为 10 0) ;检测
波长为 245 nm;电压 10 kV;柱温为室温;虹吸进样,
进样量 8 cm ∋ 5 s。毛细管电泳分析结果见图 1。
1内标(硫脲) 2PMP 3木糖 4阿拉伯糖
5葡萄糖 6鼠李糖 7甘露糖 8半乳糖
1intern al standard ( thiour ea) 2PMP 3xylose 4arabin ose
5glucose 6rhamnose 7mann ose 8galactos e
图 1 板蓝根多糖降解样品( A)和单糖( B)PMP衍生物的
CZE图谱
Fig 1 CZE Chromatogram of PMP derivatives
of degraded Radic Isatidis polysaccharide
( A) and monosaccharides ( B)
2 2 2 衍生试剂溶液的配制:称取 PMP0 877 8 g,
溶于甲醇中, 并定容至 10 mL, 制备成浓度为 0 5
mol/ L 的溶液。
2 2 3 单糖对照品溶液的配制: 分别精密称取木
糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖对照
品 49 6、55 8、51 6、51 8、48 6、52 0 mg,分别置于
25 mL 量瓶中, 加入蒸馏水,稀释至刻度,振荡摇匀,
作为对照品溶液。
2 2 4 内标溶液的配制:精密称取硫脲 251 2 mg,
置 50 mL 量瓶中, 加入蒸馏水, 并稀释至刻度,振荡
摇匀,作为内标溶液。
2 2 5 线性关系考察: 精密量取 2 mg/ mL 木糖、阿
拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖和半乳糖的对照品溶
液 0 05、0 1、0 2、0 3、0 4 mL 及内标溶液 10 mL,
分置 5 mL 量瓶中, 定容,得到质量浓度分别为 20、
40、80、120、160 g/ mL 的溶液,衍生。以对照品溶液
的质量浓度为横坐标,相应的峰面积比值为纵坐标,
进行线性回归,线性范围为 19 8~ 2089 g/ mL。回
归方程为木糖: Y= 0 003 7X- 0 030 2, r= 0 999 5;
阿拉伯糖: Y= 0003 2X + 0 016 0, r= 0 999 4; 葡萄
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糖: Y= 0 001 7X+ 0 008 2, r= 0 999 6;鼠李糖: Y=
0002 4X+ 0 010 2, r= 0 999 8; 甘露糖: Y= 0004 0
X+ 0 012 3, r= 0 998 8; 半乳糖: Y = 0 003 0X -
0 005 1, r= 0 999 4。
2 2 6 精密度试验: 精密量取各单糖对照品溶液
0 20 mL, 分置 5 mL 量瓶中, 加入硫脲溶液 1 0
mL,水稀释至刻度,配成 80 g/ mL 混合溶液, 衍生
后各连续进样 5 次。计算得木糖、阿拉伯糖、葡萄
糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖峰面积与内标硫脲峰面
积比值的 RSD 分别为 0 75%、0 41%、1 0%、
0 35%、0 96%、1 1%。
2 2 7 重现性试验: 取同一批次板蓝根多糖 5份,
经降解、衍生,制备 5 份供试品溶液,按上述条件测
定,结果木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、半
乳糖峰面积与内标峰面积比值的 RSD 分别为
1 8%、0 94%、0 65%、1 6%、1 0%、0 83%。
2 2 8 稳定性试验: 取同一批次板蓝根多糖, 经降
解、衍生, 制备供试品溶液, 分别于 0、2、4、6、8、12、
24 h进样测定, 结果木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李
糖、甘露糖、半乳糖峰面积与内标峰面积比值的
RSD 分别为 2 4%、1 1%、0 86%、2 2%、1 5%、
1 3% ,表明供试品溶液至少在 24 h内稳定。
2 2 9 加样回收试验:以板蓝根多糖中较多的葡萄
糖和阿拉伯糖为代表, 取 3份板蓝根多糖样品, 每份
约 20 mg,精密称定,降解后分别加入不同量的葡萄
糖和阿拉伯糖,制备低、中、高 3个不同质量浓度水
平的供试品溶液, 每一水平 3 份, 衍生后进行测定。
记录峰面积,计算葡萄糖的平均回收率在 93 0% ~
96 5% , RSD小于 1 3% ;阿拉伯糖的平均回收率在
93 0% ~ 94 3%, RSD小于 2 2%。
2 3 板蓝根多糖的降解:参考有关文献报道[ 6] , 通
过预实验得到以硫酸法降解板蓝根多糖效果较好时
各因素的大致范围, 选取降解温度 ( A )、硫酸浓度
( B)、降解时间( C)为考察因素,进行 L9 ( 34 )试验,以
毛细管电泳内标法测定单糖为指标对各因素和水平
进行评价和选择。
由正交试验结果(表 1)可知, 3个因素对板蓝根
多糖降解效果的影响顺序为:降解温度> 酸浓度> 降
解时间,最优组合为 A 2B2C3 ,即 1 mol/ L 硫酸溶液,
95 恒温降解 5 h。方差分析结果(表 2)表明提取温
度、酸浓度和提取时间对鼠李糖等单糖提取效率的影
响有统计学意义。最终选取的降解条件为:精密称取
板蓝根多糖20 mg,溶于1 mol/ L H 2SO 4溶液2 0 mL
中, 密封, 95 恒温5 h,冷却后,以4 mol/ L NaOH 溶
液中和,冷却,移至 10 mL 量瓶中, 精密加入 2 0 mL
上述硫脲溶液,加水定容,摇匀,待衍生。
表 1 多糖降解的正交试验结果
Table 1 Results of orthogonal test of polysaccharide degrading
试验号 A B C D(误差) 单糖/ %木糖 阿拉伯糖 葡萄糖 鼠李糖 甘露糖 半乳糖 总量
1 1 1 1 1 0 32 201 0 56 0 26 0 20 0 64 4 02
2 1 2 2 2 0 25 311 6 22 0 41 1 32 1 07 12 41
3 1 3 3 3 0 62 216 14 94 0 70 1 74 2 07 22 26
4 2 1 2 3 0 22 276 16 39 ∃ 0 71 2 52 22 62
5 2 2 3 1 0 42 301 23 36 0 40 1 86 2 60 31 67
6 2 3 1 2 0 27 254 18 87 0 27 1 53 2 28 25 77
7 3 1 3 2 0 77 195 18 56 ∃ 1 40 2 13 24 82
8 3 2 1 3 ∃ 305 24 36 ∃ 2 43 2 49 32 25
9 3 3 2 1 ∃ 172 16 12 ∃ 0 53 1 90 20 26
K 1 12 90 17 15 20 71 18 65
K 2 26 69 25 47 18 44 21 00
K 3 25 81 22 77 26 25 25 74
R 13 79 8 32 7 81 7 09
∃ 代表未检测到该单糖
- indicated undetected
表 2 方差分析
Table 2 Variance of analysis
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 0 323 2 0 162 1 580466 P < 0 01
B 0 094 2 0 047 456 961 P < 0 01
C 0 091 2 0 046 446 550 P < 0 01
D(误差) 0 000 103 2 0 000 05
F 005( 2, 2) = 19 0 F001 (2, 2) = 99 0
2 4 板蓝根多糖降解产物的衍生:精密量取供试品
溶液 80 L, 加入 50 L 0 5 mol/ L PMP 甲醇溶液
和 50 L 0 3 mol/ L NaOH 溶液, 70 条件下水浴
0 5 h,冷却至室温后加入 50 L 0 3 mo l/ L H Cl溶
液中和, 再加入 2 mL 三氯甲烷萃取去除过量的
PMP, 0 45 m 微孔滤膜滤过后即得。
#746# 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
2 5 样品测定:取 3种不同来源的板蓝根多糖,按照
上述方法进行样品制备和测定,计算得到木糖、阿拉伯
糖、葡萄糖、鼠李糖、甘露糖、组成半乳糖物质量的比分
别为( n= 3) : 1号 1 69) 904) 531 )1 00 ) 1 67)
6 51; 2号 0 65)579)295)1 00) 3 28)407; 3号
1 12)363)19 8)100)1 88)2 64。
3 讨论
虽然实验结果表明 3个不同来源板蓝根多糖的
单糖组成类似, 但其组成比例差异显著。中药内在
质量的稳定性是实现中药质量控制的前提, 中药标
准化研究急需突破。
曾选择硫脲、苯巴比妥、水杨酸等作为内标物,
鉴于样品成分复杂, 最终选用硫脲作为内标物,保留
时间适宜,且其他成分对选取的内标电泳峰无干扰。
马莉等[ 4]报道通过薄层色谱分析, 所得到板蓝
根多糖的 4种组分均由单一木糖组成。而本实验结
果表明板蓝根多糖含有木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠
李糖、甘露糖和半乳糖等多种单糖。结果的差异可
能是因为文献采用了不同来源的板蓝根药材所含多
糖种类不同,也可能是文献采用的薄层色谱法分辨
率不理想造成了结果的差异。毛细管电泳法柱效
高、分离能力强, 用于分析多糖的单糖组成,专属性
高,可靠性强。
参考文献:
[ 1] 肖珊珊,金 郁,孙毓庆 板蓝根化学成分、药理及质量控制研
究进展 [ J ] 沈阳药科大学学报, 2003, 20( 6) : 455459
[ 2] 雷黎明,潘清平 板蓝根化学、药理、质量及提取方法的研究进
展 [ J] 时珍国医国药, 2007, 18( 10) : 25782580
[ 3] 吴寿金,赵 泰,秦永奇 现代中草药成分化学 [ M ] 北京:中
国医药科技出版社, 2002
[ 4] 马 莉,唐健元,李祖伦,等 板蓝根多糖分离纯化及其性质的
研究 [ J] 中草药, 2007, 38( 8) : 11431146
[ 5] 王志远,戴 玲,朱业云,等 半杖莲酸性多糖 SBPs 的纯化、
性质及抗氧化活性研究[ J ] 中草药, 2009, 40( 5) : 728731
[ 6] 陈 蕾,吴 昊 多糖降解方法的研究进展 [ J ] 中华中医药
学刊, 2008, 26( 1) : 133135
正交试验法优选麻黄的提取工艺研究
吴晓云
(杭州市第三人民医院 药剂科,浙江 杭州 310009)
摘 要:目的 筛选 50%乙醇回流法提取麻黄中盐酸麻黄碱的最佳工艺。方法 采用正交试验法, 以提取次数、提
取时间、溶媒用量为因素, HPLC 法测定盐酸麻黄碱并作为评价指标。采用 Dikma D iamonsil C18柱( 250 mm ∋ 4 6
mm, 5 m) ;流动相: 0 2%磷酸水溶液乙腈( 96) 4) ;检测波长: 205 nm; 体积流量: 1 mL/ min。结果 盐酸麻黄碱
在 0 488~ 3 416 g 线性关系良好, 平均回收率为 100 26% , RSD 为 2 17%。提取次数对盐酸麻黄碱的提取率有
显著性影响。结论 麻黄中盐酸麻黄碱的最佳提取工艺为 50%乙醇回流提取 2次, 每次 2 h, 7倍量溶媒。
关键词:麻黄; 盐酸麻黄碱;提取工艺; 正交试验
中图分类号: R284 2 文献标识码: B 文章编号: 02532670( 2010) 05074703
麻黄为麻黄科植物草麻黄 Ephedr a sinica
Stapf、中麻黄E intermedia Schr enk et CAMey
或木贼麻黄 E equi setina Bag 的干燥草质茎。味
辛、微苦, 性温, 具发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿之
功效[ 1] 。主要成分为盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱。
本实验以盐酸麻黄碱为指标, 采用 HPLC 法测定,
利用正交试验设计, 以 50%乙醇为溶媒加热回流提
取,考察影响盐酸麻黄碱提取率的因素,筛选麻黄的
最佳提取工艺条件。
1 仪器与试药
Perkin Elmer Series 200 高效液相色谱仪
( PerkinElmer 公司 ) ; Per kin E lmer Lanmda 20 紫
外/可见分光光度仪 ( Per kin Elmer 公司) ; Dikma
Diamonsil C18柱 (迪马公司) ; AB204 ∃ S 电子分析
天平( M ett ler To lrd公司)。
乙腈(色谱纯, TEDIA 公司) ;盐酸麻黄碱对照
品 (购自中国药品生物制品检定所, 批号 722
200006) ;麻黄药材购自萧山市医药有限责任公司中
药分公司,经浙江省中药研究所药材资源室鉴定为
草麻黄。
#747#中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20091023 作者简介:吴晓云( 1981 ∃ ) ,女,浙江庆元人,中药师, 2002年毕业于浙江中医药大学药学系, 从事中药成分测定及中药不良反应研究。T el :
( 0571) 87823122 Email : yaojianmeng@ 126. com