全 文 ：白花丹醌对肝癌细胞 HepG2 增殖及血管内皮生长因子表达的影响
朱 　芳1 ,伍 　钢1 3 ① 何远桥2 ,李振宇1 ,彭 　纲1 ,任精华1
(11 华中科技大学同济医学院附属协和医院 肿瘤中心 ,湖北 武汉 　430022 ; 21 华中科技大学
同济医学院附属协和医院 泌尿外科 ,湖北 武汉 　430022)
摘 　要 :目的 　研究白花丹醌对人肝癌细胞 Hep G2 的增殖、克隆形成及血管内皮生长因子 (V EGF) 表达的影响。
方法 　M TT 法检测白花丹醌对人肝癌细胞 Hep G2 的增殖抑制率 ;平板克隆形成实验检测白花丹醌对 Hep G2 细
胞克隆形成率的影响 ;RT2PCR 及免疫荧光细胞化学检测白花丹酯对 Hep G2 细胞 V EGF mRNA 和蛋白表达的影
响。结果 　M TT 法结果显示白花丹醌对人肝癌细胞 Hep G2 的增殖有抑制作用 ,且随着药物浓度增加 (2、8、32、
128μmol/ L) 和作用时间 (24、48、72 h) 延长 ,其抑制作用逐渐增强 ,与细胞对照组相比有显著差异 ( P < 0105) ;平
板克隆形成实验显示白花丹醌对 Hep G2 细胞克隆形成有显著抑制作用 ( P < 0105) ; RT2PCR 及免疫荧光细胞化
学均显示随白花丹醌药物浓度增高 , Hep G2 细胞 V EGFmRNA 及蛋白表达水平下调。结论 　白花丹醌对人肝癌
细胞 Hep G2 的增殖、克隆形成及 V EGF 表达均有显著抑制作用 ,其可能成为一种新的抗肿瘤药物。
关键词 :白花丹醌 ; 肝癌 ; 细胞增殖 ; 克隆形成 ; 血管内皮生长因子 (V EGF)
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0520775204
　　白花丹为蓝雪科植物白花丹 Pl umbago zey2
l anica L . 的干燥根、根茎及全草 ,为东南亚多个国
家及中国常用药材 ;在我国 ,其主要生长于四川、福
建、广西、广东等地区 ;主要具有祛风散瘀、解毒杀
虫、消肿止痛等作用[1 ,2 ] 。白花丹醌 (plumbagin)
为白花丹的主要活性成分[3 ] ,具有广泛的药理作用 ,
如抗炎、抗凝等。目前有细胞及动物实验表明白花
丹醌对卵巢癌[4 ] 、乳腺癌[5 ] 、胃肠道肿瘤等具有一定
的抗肿瘤活性。肝癌为一种人类常见的高度恶性肿
瘤 ,其浸润和转移能力强 ,预后差。本研究旨在通过
体外实验检测白花丹醌对人肝癌细胞 Hep G2 的生
长、增殖及血管内皮细胞生长因子 (V EGF) 表达的
影响 ,研究其对肝癌细胞的抗肿瘤活性。
1 　材料与方法
111 　药品、试剂与仪器 :白花丹醌购自 Sigma 公
司 ,用二甲基亚砜 (DMSO) 溶解 ,配成 011 mol/ L
储备液 ,于 - 20 ℃保存。RPMI 1640 及小牛血清
购自 Gibco 公司 ,四甲基偶氮唑蓝 (M T T) 及 DM2
SO 购自 Sigma 公司 , RNA 抽提试剂 Trizol 购自
Invit rogen 公司 ,MMLV 逆转录酶购自 TO YOBO
公司 , TaqDNA 聚合酶购自美国 Fermentas 公司 ,
DNA marker I 购自北京天根时代公司 ,V EGF 单
克隆抗体购自美国 santa cruz Biotechnology 公司 ,
PCR 引物由上海生工公司合成。PCR 仪、电泳仪为
Biomet ra 公司产品 , UV Ipro 凝胶成像分析系统为
Uvitec 公司产品。
112 　细胞培养 :人肝癌细胞 Hep G2 为华中科技大
学附属协和医院肿瘤中心实验室保存。取 Hep G2
细胞冻存液于 37 ℃水浴锅中解冻 1 min ,培养于含
10 % 小牛血清的 RPMI 1640 培养基中 ,将培养瓶置
于 37 ℃、5 % CO2的恒温细胞培养箱内培养 ,每 1～2
天换液传代 1 次 ,取对数生长期细胞进行实验。
113 　M T T 比色法检测白花丹醌对 Hep G2 细胞增
殖的影响 :将 100μL 细胞悬液加入 96 孔板中 ,每
孔 1 ×104个细胞 ,设空白对照组 (培养基) 、细胞对
照组 (培养基 + Hep G2 细胞) 及实验组 (培养基 +
Hep G2 细胞 + 白花丹醌) 。实验组设 4 个浓度梯
度 ,分别为 2、8、32、128μmol/ L ,每组设 4 个复孔。
置于 37 ℃、5 % CO2分别培养 24、48、72 h 后 ,弃上
清 ,每孔加入含 10μL M T T (5 g/ L) 的无血清培养
基 100μL ,继续培养 4 h 后 ,吸去培养基 ,每孔加入
DMSO 200μL ,振荡 10 min 后 ,置于酶标仪上于
570 nm 波长处检测吸光度 ( A) 值。计算细胞增殖
抑制率 ,实验重复 3 次。
增殖抑制率 = [ (细胞对照组 A 值 - 空白对照组 A
值) - (实验组 A 值 - 空白对照组 A 值) ]/ (细胞对照组 A
值 - 空白对照组 A 值) ×100 %
114 　平板克隆形成实验检测白花丹醌对 Hep G2
细胞克隆形成能力的影响 :取对数生长期细胞 ,以
·577·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
①收稿日期 :2009207213　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
作者简介 :朱　芳 (1982 —) ,女 ,湖北荆州人 ,博士在读 ,研究方向为抗肿瘤血管新生。
0125 % 胰酶消化并吹打成单个细胞 ,以 200 个细
胞/ 孔分别接种于含 4 mL 完全培养基的 6 孔板中 ,
轻轻转动 ,使细胞分散均匀 ,设细胞对照组和实验
组 ,实验组设 4 个浓度梯度 ,分别为 4、8、16、32
μmol/ L ,每组设 4 个复孔。将 6 孔板置于 37 ℃、
5 % CO2的培养箱中培养 ,中途未换液 ,药物未洗
脱 ,2 周后弃去培养液 ,用 PBS 小心浸洗 2 次 ,加纯
甲醇 5 mL 固定细胞 15 min 后 ,加适量 Mayor′s 苏
木素染细胞核 1 min ,然后用流水缓慢洗去染色液 ,
空气干燥。将 6 孔板底部置一张带网格的透明胶
片 ,低倍显微镜 ( ×40) 下计数克隆 ,以 50 个细胞以
上形成的细胞集落为 1 个克隆 ,计算克隆形成率。
克隆形成率 = 克隆数/ 接种细胞数 ×100 %
115 　R T2PCR 检测白花丹醌对 Hep G2 细胞
V EGF mRNA 表达水平的影响 :将 6 孔板中细胞以
不同浓度白花丹醌 (分别为 0、4、8、16、32μmol/ L)
干预 24 h 后 ,每孔细胞以 Trizol 提取液按说明书
提取总 RNA ,紫外分光光度仪测定纯度 ( A 260 / A 280
为 118～210) 及浓度以定量。逆转录获取 cDNA。
V EGF 引物设计参照人 V EGF cDNA 基因文库[6 ] 。
上 游 引 物 : 5′2CGAA GT GGT GAA GT TCA T G2
GA T G23′, 下 游 引 物 : 5′2T TCT GTA TCA GT2
CT T TCCT GGT GA G23′。 V EGF121 和 V EGF165
cDNA 的扩增片段分别为 403、535 bp 。参照基因
GA PD H 上 游 引 物 : 5′2ACCACA GTCCA T GC2
CA TCAC23′;下游引物 : 5′2TCCACCACCCT GT T2
GCT GTA23′,cDNA 的扩增片段为 451 bp 。PCR
反应条件 : 94 ℃、5 min 解链 , 94 ℃、30 s 变性 ,
V EGF165 54 ℃、30 s 退火 , GA PD H 55 ℃、30 s 退
火 ,72 ℃、1 min 延伸 ,重复变性、退火、延伸 ,共 38
个循环 ,再以 72 ℃、5 min 充分延伸结束。取每例
PCR 产物 5μL ,置于 2 % 琼脂糖凝胶中 ,以 100 V
电压电泳 20 min ,结果经 UV Ipro 凝胶成像分析系
统分析。样本 V EGF mRNA 的 PCR 产物条带扫
描量与 GA PD H PCR 产物扫描量的比值 ,为该亚型
V EGF mRNA 在组织中的相对量。每孔设 4 个复
孔 ,取平均值进行统计学分析。
116 　免疫荧光细胞化学检测白花丹醌对 Hep G2
细胞 V EGF 蛋白水平表达的影响 :将经多聚赖氨酸
预处理的盖玻片置于 6 孔板中 ,将 Hep G2 细胞接
种于 6 孔板内。经不同浓度白花丹醌 (分别为 0、4、
8、16、32μmol/ L) 处理 24 h 后 ,以 4 % 多聚甲醛固
定细胞 15 min ,用 PBS 冲洗 2 次 ,加入 0125 %
加入 1 % 牛血清白蛋白 (BSA) 封闭 30 min ,加入
兔抗人 V EGF 一抗 (1 % BSA 以 1 ∶300 稀释) ,4
℃孵育过夜。次日 37 ℃回温 1 h 后 , PBS 洗 3
次 ,加入 FITC 标记的羊抗兔 Ig G (1 % BSA 以 1 ∶
500 的比例稀释) ,室温下避光孵育 30 min ,BPS 再
次洗涤 3 次 ,用 Hoechst 33258 10μL 室温下染色 5
min ,缓冲甘油封片 ,荧光显微镜 ( ×100) 下观察、
拍片 ,以 IPP 610 软件分析各组 V EGF 表达的 A
值 ,每组设 4 个复孔。
117 　统计学方法 :各计量资料以 x ±s 表示 ,用
SPSS 1115 统计分析软件进行统计 ,组间比较采用 t
检验。
2 　结果
211 　对 Hep G2 细胞增殖的影响 :分别以 2、8、32、
128μmol/ L 白花丹醌作用 Hep G2 细胞后 ,各处理
组细胞增殖活性明显低于细胞对照组 ,其作用 24 h
的 IC50值为 (27108 ±0140) μmol/ L ,随药物作用时
间延长 ,其 IC50值逐渐减小 ,作用 48、72 h 的 IC50值
分别为 (12118 ±0151) 、(6176 ±0137) μmol/ L 。结
果见图 1 ,白花丹醌在 2～128 μmol/ L 范围内对
Hep G2 细胞的增殖抑制作用呈剂量和时间依赖性。
图 1 　白花丹醌对 HepG2 细胞增殖的抑制作用 ( n = 4)
Fig. 1 　Inhibition of plumbagin on proliferation
of HepG2 cells ( n = 4)
212 　对 Hep G2 细胞克隆形成的影响 :不同浓度
(4、8、16、32μmol/ L) 的白花丹醌对 Hep G2 细胞克
隆形成均有抑制作用 , Hep G2 细胞的克隆形成率随
白花丹醌浓度升高而下降 ,见表 1 及图 2。
表 1 　白花丹醌对 HepG2 细胞克隆形成率的影响
( x ±s , n = 4)
Table 1 　Effect of plumbagin on clone formation rate
of HepG2 cells ( x ±s , n = 4)
组别 C/ (μmol ·L - 1) 克隆形成数 克隆形成率/ %
对照 0 12210 ±1012 6110 ±511
白花丹醌 4 7210 ± 914 3610 ±417 3
8 3410 ± 611 1710 ±311 3
16 　710 ± 213 315 ±112 3
32 　　　0 　　0
　　与对照组比较 : 3 P < 0105
·677· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
图 2 　白花丹醌对 HepG2 细胞克隆形成的影响
Fig. 2 　Effect of plumbagin on clone formation of HepG2 cells
213 　对 Hep G2 细胞 V EGF mRNA 表达的影响 :
对照组 Hep G2 细胞 V EGF mRNA 高表达 ,不同浓
度的白花丹醌对 V EGF 两个亚型 V EGF165 、
V EGF121表达均有抑制作用 ,见图 3。以灰度分析软
件计算 V EGF165 / GA PD H、V EGF121 / GA PD H 值 ,
结果显示随着药物浓度的升高 ,V EGF165 、V EGF121
表达呈下降趋势。即白花丹醌在 4～32μmol/ L 范
围内 ,呈浓度依赖性抑制 V EGF 表达。各组与对照
组比较 ,差异显著 ( P < 0105) 。
M2DNA Marker Ⅰ　12对照组
2～52白花丹醌 4、8、16、32μmol ·L - 1组
M2DNA Marker Ⅰ　12cont rol group
2 —52plumbagin 4 , 8 , 16 , and 32μmol ·L - 1
图 3 　白花丹醌对 HepG2 细胞 VEGF mRNA 表达的影响
( n = 4)
Fig. 3 　Effect of plumbagin on expression of VEGF
mRNA in HepG2 cells ( n = 4)
214 　对 Hep G2 细胞 V EGF 蛋白表达的影响 :以免
疫荧光细胞化学检测白花丹醌干预 24 h 后 , Hep G2
细胞 V EGF 蛋白表达的影响 ,V EGF 主要表达于胞
核 ,部分表达于胞浆 ,对照组呈强阳性表达 ,以 IPP
610 软件分析各组 V EGF 表达的 A 值 ,结果显示随
着白花丹醌浓度升高 , V EGF 蛋白表达呈下降趋
势 ,见图 4。
3 　讨论
　　白花丹醌是一种小分子萘醌化合物 ,其化学结
图 4 　白花丹醌对 HepG2 细胞 VEGF 蛋白表达的影响
( n = 4)
Fig. 4 　Effect of plumbagin on expression of VEGF
protein in HepG2 cells ( n = 4)
met hyl21 ,42nap ht hoquinone) 。其最早用于抗动脉
粥样硬化、护肝、强心等。目前大量研究表明其对多
种肿瘤细胞系有抗肿瘤作用。Sugie 等[7 ] 通过动物
实验研究表明 ,白花丹醌可显著抑制氧化偶氮甲烷
诱发的小肠肿瘤 ;Sandur 等[8 ]研究表明其可能通过
抑制 N F2κB 通路达到抗肿瘤作用 ;Nair [9 ] 等研究表
明白花丹醌可通过诱导凋亡增加宫颈癌细胞对放疗
的敏感性。
肝癌是我国癌症死亡的第二大病因 ,晚期患者
中位生存期仅数月 ,目前的治疗方法尚不能明显延
长患者生存期。鉴于 M T T 法检测的是大量细胞在
药物作用下存活的情况 ,而平板克隆形成法是检测
单个细胞增殖形成克隆的能力。本研究以 M T T 法
和平板克隆形成法联合检测白花丹醌对 Hep G2 细
胞生长、增殖的影响 ,发现随着药物浓度增加和作用
时间延长 ,细胞存活率和克隆形成率均下降 ,结果一
致。即白花丹醌可呈浓度依赖性抑制 Hep G2 细胞
·777·中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
肿瘤的生长、浸润和转移均需依赖新生血管的
形成。而 V EGF 为目前发现的最重要的促进肿瘤
血管生成的细胞因子[10 ] ,其可通过促进血管内皮细
胞增殖、增加微血管通透性及改变细胞外基质等途
径促进肿瘤血管新生。V EGF 有多种亚型 ,其中 ,
V EGF165 和 V EGF121 在肿瘤血管新生中起主要作
用。本研究通过 R T2PCR 及免疫荧光细胞化学实
验表明 ,白花丹醌干预肝癌 Hep G2 细胞后 ,V EGF
mRNA 及蛋白表达水平均随药物浓度增加而下调。
本研究结果表明 ,白花丹醌体外可抑制肝癌
Hep G2 细胞生长、克隆形成及 V EGF 表达 ,其可能
通过该途径抑制肿瘤生长、血管新生 ,达到抗肿瘤作
用。然而 ,其在体内对肝癌生长、浸润等生物学行为
的影响及其机制尚待进一步研究。
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红豆杉多糖对 Beagle 犬心肌缺血再灌注模型心肌细胞凋亡
及单核细胞趋化蛋白21 与 NO 表达的影响
朱天民1 ,朱慧民2 ,李 　辉3
①
(11 成都中医药大学 ,四川 成都 　610075 ; 21 台州市中心医院 ,浙江 台州 　318000 ;
31 成都大学医护学院 ,四川 成都 　610081)
摘　要 :目的 　观察红豆杉多糖对 Beagle 犬心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡及单核细胞趋化蛋白21 (MCP2
1) 、NO 表达的影响。方法 　将 30 只 Beagle 犬随机分为假手术组、模型组、红豆杉多糖 (8915、357 mg/ kg) 组、卡
维地洛 (1 mg/ kg) 对照组 ,每组 6 只 ,分别给药 7 d 后 ,建立心肌缺血再灌注模型。TUN EL 染色法标记缺血再灌
注区凋亡心肌细胞 ,计算凋亡指数 (A I) ;Western blotting 法检测缺血再灌注区心肌 MCP21 蛋白表达 ;硝酸还原酶
法检测心肌组织中 NO 水平。结果 　模型组、红豆杉多糖低剂量组心肌细胞 AI 较假手术组显著升高 ( P < 0101) ;
红豆杉多糖高剂量组、卡维地洛组心肌细胞 A I 显著低于模型组和红豆杉多糖低剂量组 ( P < 0105) ,与假手术组比
较无显著差异 ( P > 0105) 。模型组、红豆杉多糖低剂量组、卡维地洛组 MCP21 蛋白表达较假手术组显著升高
( P < 0105) ,红豆杉多糖低、高剂量组 ,卡维地洛组 MCP21 蛋白表达较模型组显著下降 ( P < 0101) ,红豆杉多糖高
剂量组 MCP21 蛋白表达显著低于低剂量组和卡维地洛组 ( P < 0101) 。模型组及各治疗组心肌组织 NO 水平较假
手术组显著升高 ( P < 0101) ,红豆杉多糖高剂量组心肌 NO 显著低于模型组 ( P < 0105) 及低剂量组 ( P < 0101) 。
结论 　红豆杉多糖可抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡 ,其机制可能与降低心肌组织 MCP21 蛋白表达及 NO
水平、抑制心肌细胞凋亡有关。
关键词 :红豆杉多糖 ; 心肌缺血再灌注 ; 细胞凋亡 ; 单核细胞趋化蛋白21 (MCP21) ; NO
中图分类号 :R28515 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :025322670 (2010) 0520778204
·877· 中草药　Chinese Traditional and Herbal Drugs 　第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
①收稿日期 :2009207225　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
基金项目 :浙江省科技厅科技攻关计划基金资助项目 (2006C33005)