全 文 ：一种膜荚黄芪凝集素的分离纯化研究
朱利芬1 ,闫巧娟2 ,江正强1 * , Kumar Narasimha1 , 黄林华2
( 1 中国农业大学食品科学与营养工程学院,北京 100083; 2 中国农业大学工学院,北京 100083)
摘 要:目的 从膜荚黄芪根中分离纯化一种凝集素。方法 通过硫酸铵分级沉淀和 ConASepharo se 4B 亲和色
谱从膜荚黄芪根浸提液中分离纯化一种凝集素。结果 经过上述两步纯化得到电泳纯的凝集素, SDSPAGE 和
Superdex 75 凝胶过滤色谱测定该凝集素的相对分子质量分别为 3 15 104 和 3 35 104 , 糖蛋白染色显示其为糖
蛋白 ,总糖的量为 10 7%。结论 从膜荚黄芪根中分离纯化得到一种凝集素,该蛋白为单亚基糖蛋白, 具有对兔血
红细胞的凝集活性,凝集活性的比活力为 391 9 U / mg。
关键词:膜荚黄芪; 凝集素;纯化; 亲和色谱
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05071404
Isolation and purification of a lectin from roots of Astragalus membranaceus
ZHU Lifen1 , YAN Q iaojuan2 , JIANG Zhengqiang1 , KUMAR Narasimha1 , HUANG Linhua2
( 1 Co lleg e of Food Science and Nutr itio nal Eng ineering , China Ag ricultur al Univ ersit y, Beijing 100083, China;
2 Co lleg e of Engineer ing, China Ag ricultura l Univer sity, Beijing 100083, China)
Abstract: Objective T o isolate and pur ify a lect in fr om the ro ots of A str agalus membranaceus
Methods T he protein w as purif ied using a combinat ion o f 20% ! 60% ammonium sulfate f ract ion and
ConASephar ose 4B af finity chromato graphy Results The purified protein appeared as a single band w ith
molecular mass o f 3 15 104 on SDSPAGE and the relat ive mo lecular mass w as est imated by gel f iltr at ion
on a calibrated Superdex 75 co lumn w ith apparent molecular w eight o f 3 35 104 This lect in w as a g lyco
protein w ith a neutr al carbohydrate content of 10 7% Conclusion A lect in is iso lated and purif ied f rom
the r oots of A membr anaceus for the f irst t ime It is a monomer gly coprotein and its specif ic activity is
391 9 U / mg
Key words: A str agalus membranaceus ( F isch ) Bunge; lect in; purif ication; aff inity chromatog raphy
凝集素是一类非免疫源的能凝集细胞或沉淀含
糖大分子的蛋白质[ 1] 。其存在比较广泛, 且具有促
使细胞(如恶性肿瘤细胞等)凝集、细胞有丝分裂、防
御昆虫危害、消除入侵的微生物等外源性作用和机
体内的生理功能,已经引起越来越多的专家学者的
重视[ 2] 。目前已分离出多种凝集素 [ 3] , 常用的分离
方法有离子交换色谱、分子筛色谱、亲和色谱等。其
中亲和色谱由于具有纯化工艺简单、纯化时间短、蛋
白活性损失小等优点而被广泛应用于凝集素的分离
纯化,而将纯化的凝集素作为配基偶联到色谱介质
上制备的亲和色谱是近年来才应用于凝集素分离纯
化中的[ 4, 5]。黄芪系豆科植物蒙古黄芪 A str ag alus
membranaceus ( Fisch ) Bunge var monghol icus
( Bunge ) Hsiao 或膜荚黄芪 A membranaceus
( F isch ) Bunge 的干燥根, 具有补气固表、利尿托
毒、排脓、敛疮生肌之功效[ 6] ,还具有增强免疫功能、
增强机体耐缺氧及应激能力、促进机体代谢、改善心
功能、调节血糖、抗菌及抑制病毒作用等[ 7] ,其功能性
成分的研究主要集中于多糖、皂苷及黄酮等方面,而
蛋白成分的作用和功能研究很少。Yan等[ 8] 从蒙古
黄芪根分离纯化出一种具有抗真菌活性的凝集素和
一个具有核糖核酸酶活性的病程相关蛋白( AmPR
10) ,但有关其同属的膜荚黄芪根中蛋白质的研究尚
未见报道。本研究利用 ConASepharode 4B 亲和色
谱从膜荚黄芪根中分离纯化一种凝集素,为进一步研
究膜荚黄芪凝集素的性质和功能奠定基础。
∀714∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090819 基金项目:国家自然科学基金资助项目( 20502032) ;教育部新世纪优秀人才支持计划( NCET080534)作者简介:朱利芬( 1982 ! ) ,女,山西省左云县人,硕士研究生,主要对中草药中的生物活性蛋白进行研究。
T el : 13426443585 Email: lya zlf . student@ s ina. com
* 通讯作者 江正强 T el: ( 010) 62737689 Em ail : zh qjiang@ cau edu cn
1 材料与仪器
ConASepharose 4B 为瑞典 Pharmacia 公司产
品,膜荚黄芪根购于北京时珍中草药技术有限公司,
并由本院周成明博士鉴定为 Ast ragalus membr a
naceus ( Fisch ) Bunge的干燥根。高速万能粉碎机
购于天津泰斯特仪器有限公司, 万分之一电子天平
购于德国 Sartorius公司。
2 方法与结果
2 1 SDSPAGE 和蛋白质的测定: SDSPAGE 按
照 Laemmli的方法进行,分离胶浓度为 12 5% , 浓
缩胶浓度为 4 5% , 考马斯亮蓝 R250染色; 蛋白质
的测定采用 Low ry 法,以牛血清白蛋白为标准。
2 2 血凝活性的测定:取新鲜兔血, 3 000 r/ m in 下
离心 1 min, 去上清, 将红细胞用生理盐水洗涤 3
次,再用生理盐水配制成 2%的浓度, 加入胰蛋白酶
至质量浓度为 1 mg/ mL, 4 # 下处理 15 min 后
3 000 r / min离心1 min,用生理盐水洗涤 3次,最后
用生理盐水将兔红细胞配制成 2%的浓度 4 # 下贮
存,备用。在 96孔 U 型血凝板上用生理盐水 50 L
对凝集素 50 L 进行倍比稀释, 以生理盐水作空白
对照,加入相应的 50 L 红细胞,在 4 000 r/ min 下
震荡 5 min, 室温静置 2 h后观察结果。一个单位的
凝集活性定义为能使 2%的兔红细胞产生完全凝集
现象所需凝集素样品的最高稀释倍数的倒数 [ 8]。
2 3 膜荚黄芪凝集素的分离纯化步骤
2 3 1 膜荚黄芪粗提液: 10 g 膜荚黄芪根经粉碎
后加入 60 mL pH 7 2 50 mmol/ L 的磷酸缓冲液
(膜荚黄芪根与提取缓冲液的质量体积比为 1∃ 6) ,
于 4 # 下搅拌浸提 4 h, 用 4 层纱布滤过, 滤液在
11 000 r/ m in 下离心 20 m in, 上清液即为膜荚黄芪
粗提液。
2 3 2 硫酸铵分级沉淀: 粗提液进行 20% ~ 60%
饱和度的硫酸铵沉淀, 11 000 r/ min下冷冻离心 10
min, 沉淀用 10 mL pH 7 4 20 mmol/ L Tr isHCl
缓冲液溶解,并用相同缓冲液在 4 # 下透析过夜后
进行 ConASepharose 4B亲和色谱分离。
2 3 3 ConASepharose 4B亲和色谱分离: 将透析
的样品于 11 000 r/ min 下冷冻离心 10 m in, 取上清
液,加入 NaCl使其终浓度达到 1 mol/ L , 同时加入
MnCl2、MgCl2、CaCl2 使其终浓度均为 1 mmol/ L。
过预先用 pH 7 4 20 mmol/ L T risH Cl(含1 mol/ L
NaCl、1 mmol/ L M nCl2、MgCl2、CaCl2 )缓冲液平衡
好的 ConASephaose 4B( 3 cm 1 cm )亲和柱, 以
0 1 mL/ m in 的体积流量上样,上样后关闭柱出口,
静置 30 m in, 之后用平衡缓冲液以 0 5 mL/ m in的
体积流量洗涤未结合部分蛋白, 然后用 pH 7 4 20
mmol/ L Tr isHCl(含 1 mol/ L 葡萄糖)以 0 5 mL/
m in 的体积流量洗脱目标蛋白, 收集洗脱峰, 用 20
mmol/ L pH 7 4的 TrisHCl 缓冲液透析即为目标
蛋白。
10 g 膜荚黄芪根粉碎后, 用50 mmo l/ L pH 7 2
的磷酸缓冲液浸提,浸提液采用硫酸铵分级沉淀,测
定凝集活性及蛋白,结果表明 20% ~ 60%饱和度的
硫酸铵沉淀为最佳条件, 此时凝集活性的回收率为
86 5% ,纯化倍数为 1 7倍(表 1)。
回收率= 纯化过程中每一步所得到的蛋白的总活力/粗
提液总活力
纯化倍数= 纯化过程中每一步所得到的蛋白的比活/粗
提液比活
表 1 膜荚黄芪凝集素纯化
Table 1 Purification of a lectin from roots
of A membranaceus
纯化步骤 总蛋白/
mg
总活力/
U
比活/
( U ∀ mg- 1 )
纯化
倍数
回收率/
%
粗提液 148 4 5 920 39 9 1 0 100
20%~ 60%硫酸铵沉淀 73 8 5 120 69 4 1 7 86 5
ConASepharose 4B 7 8 3 072 391 9 9 8 51 9
将硫酸铵沉淀的活性组分用 10 mL pH 7 4 20
mmol/ L T risHCl 缓冲液溶解、透析后上 ConA
Sephaose 4B亲和色谱柱。检测 A 280绘出色谱分离
曲线,见图 1。C1为未吸附蛋白峰, C2 为葡萄糖溶
液洗脱峰,活性测定结果表明 C1 峰样品没有凝集
活性,凝集活性主要集中在 C2峰处, 经 SDSPAGE
检测活性峰样品达到电泳纯(图 2)。
C1未吸附蛋白峰 C21 m ol / L 葡萄糖洗脱蛋白峰
C1un ob served f ract ion C21 mol/ L glu cose elut ion f ract ion
图 1 凝集素的 ConASepharose 4B色谱图
Fig 1 Chromatogram of lectin on ConASepharose 4B
膜荚黄芪凝集素整个纯化过程的电泳图见图
2, 经过硫酸铵沉淀、ConASephaose 4B亲和色谱后
得到电泳单一带凝集素。纯化中活性变化见表 1,
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Lane M标准蛋白 1膜荚黄芪粗提液 220% ~ 60%
硫酸铵分级沉淀 3ConAS eph arose 4B亲和色谱产品
4膜荚黄芪凝集素糖蛋白染色
Lane MMarker protein 1crude ex t ract ion of A membranaceu s
220% ! 60% amm on ium sulfate precipitat ion
3ConASepharose 4B af finity ch rom atography
4 glycoprotein staining of lect in A membr anaceus
图 2 膜荚黄芪凝集素纯化过程 SDSPAGE电泳图
Fig 2 SDSPAGE Electrophoresis of purif ication
of a lectin from A membranaceus
凝集活性回收率为 51 9% , 纯化倍数为 9 8倍, 凝
集素的比活性由浸提液的 39 9 U/ mg 上升到
391 9 U / mg。
2 4 糖蛋白染色和糖的量: 糖蛋白染色参照
Zacharius等[ 10]的方法采用高碘酸Schiff 显色。糖的
测定参照 Dubois等[ 11]的方法, 采用苯酚硫酸法, 以
葡萄糖做标准曲线,根据标准曲线计算凝集素中总糖
的量。结果表明该凝集素为一种糖蛋白(图 2)。苯
酚硫酸法测定其蛋白中总糖的量为 107%。
2 5 凝集素相对分子质量的测定:膜荚黄芪凝集素
相对分子质量的测定采用 SDSPAGE 和 Super dex
75凝胶过滤色谱法。SDSPAGE 中分离胶浓度为
12 5%,浓缩胶浓度为 4 5%。低相对分子质量标
准蛋白为: 磷酸化酶 ( 9 70 104 )、牛血清蛋白
( 6 60 104 )、鸡卵清蛋白 ( 4 50 104 )、碳酸酐酶
( 3 00 104 )、大豆胰蛋白酶抑制剂( 2 00 104 )、牛乳
清蛋白( 144 104 )。以标准蛋白相对分子质量的常用
对数为纵坐标,迁移率为横坐标作图,得出线性方程后
根据目标蛋白的迁移率计算出其相对分子质量。
凝集素活性状态下的相对分子质量的测定采用
Super dex75凝胶过滤法( 40 cm 1 0 cm ) 测定。
凝胶柱先用 pH 7 2 50 mmol/ L 磷酸盐缓冲液(含
0 1 mol/ L NaCl)平衡,然后分别将 2 mg/ mL 标准
蛋白和膜荚黄芪凝集素以 0 35 mL/ m in的流速过
凝胶柱,以洗脱体积为横坐标,标准蛋白相对分子质
量的常用对数为纵坐标作图,得出线性方程后根据
待测样品的洗脱体积计算其相对分子质量。标准蛋
白分别为牛血清白蛋白 ( 6 80 104 )、卵清蛋白
( 4 50 104 )、胰凝乳蛋白酶原 A ( 2 57 104 )和细
胞色素 C( 1 23 104 )。
SDSPAGE法测定膜荚黄芪凝集素的相对分
子质量时,以标准蛋白相对分子质量的常用对数为
纵坐标, 迁移率为横坐标作图, 得出线性方程 Y =
- 0 951 9 X+ 2 016 4( Y : lgM r; X : 相对迁移率) ,
通过计算表明该凝集素的相对分子质量为 3 15
10
4。Superdex 75凝胶过滤色谱法测定膜荚黄芪凝
集素相对分子质量时, 以洗脱体积为横坐标,标准蛋
白相对分子质量的常用对数为纵坐标作图,得出线
性方程 Y= - 0 178 1 X + 8 889 1( Y : lgM r; X : 洗
脱体积) , 计算其相对分子质量为 3 35 104。因
此,该凝集素为单亚基蛋白。
3 讨论
ConASepharose 4B亲和色谱常用于分离纯化
糖蛋白,其中一些含糖基的凝集素也是利用该亲和
介质分离纯化的,如 Absar 等[ 4] 和 Absar 等 [ 5]分别
从桑葚种子和凹鼻鲀鱼中用 ConASepharose 4B分
离纯化出甘露糖特异结合的凝集素, 本研究也采用
了这种以凝集素作为配体进行特异性吸附的亲和色
谱法进行纯化,经过一步亲和色谱从膜荚黄芪根中
获得了一种活性蛋白凝集素。经过纯化该凝集素
的凝集活性回收率达到 51 9%, 纯化倍数为 9 8
倍,凝集素的比活性由浸提液的 39 9 U/ mg 上升到
391 9 U/ mg。与本研究采用的一步亲和色谱法相
比, Yan等[ 8]研究的蒙古黄芪凝集素经过一步硫酸
铵沉淀和三步离子交换色谱分离纯化, 其回收率只
有 16%。可见本实验采用的一步亲和色谱是一种
高效的纯化方法。
将 SDSPAGE 和 Superdex 75 测定的膜荚黄
芪凝集素的相对分子质量的结果进行比较( SDS
PAGE 法测定其相对分子质量为3 15 104 , Super
dex 75凝胶过滤色谱法测定其为 3 35 104 ) ,结果
表明该凝集素为一个单亚基蛋白, 与大多报道的凝
集素多为多亚基或双亚基蛋白的凝集素如板栗树种
子[ 1 2]及蒙古黄芪凝集素[ 8] 存在差异。在凝集素类
中, 有些凝集素是不含糖基的, 如伴刀豆凝集素
( ConA) , 而有些是含糖的, 如蒙古黄芪凝集素[ 8] 的
∀716∀ 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
总糖量分别为 19 6% ,本研究中纯化的凝集素也是
一种糖蛋白, 总糖的量在 10 7%, 与其他凝集素存
在一定的相似性。该凝集素的生物学活性(如抗菌
及抗肿瘤活性等)仍需进一步研究。
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亚临界水提取槐角中总异黄酮的研究
丛艳波,张永忠* ,刘 潇
(东北农业大学理学院 应用化学系,黑龙江 哈尔滨 150030)
摘 要:目的 考察了亚临界水提取槐角总异黄酮的最佳实验条件。方法 通过单因素和正交试验,以染料木苷
为对照、总异黄酮的得率为指标, 优选出槐角异黄酮的提取工艺参数。结果 当提取时间为 45 min、提取温度为
130 # 、液固比为 12 5 mL/ g 时槐角总异黄酮的得率为 23 3%。结论 与传统的提取方法相比, 亚临界水提取技
术是新发展起来的一种新型提取技术,具有提取时间短、效率高、环境友好等优点。
关键词:槐角; 总异黄酮;亚临界水提取
中图分类号: R284. 2; R286 02 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05071704
Study on total isoflavones from Fructus Sophorae by subcritical water extraction
CONG Yanbo , ZHANG Yongzhong , LIU Xiao
( Colleg e of Science, No rtheast Agr icultural Univer sity, Harbin 150030, China)
Abstract: Objective T o opt imize the ext racting condition of to tal iso flavones f rom Fr uctus Sophorae
by subcr it ical w ater ext ract ion Methods T aking isof lav ones yield as index and genist in as control, the
technolo gy parameter of subcrit ical w ater ext raction of Fr uctus Sop horae iso flavones w as opt imized by sin
g le factor and orthogonal experiment Results The y ield o f Fr uctus S op hor ae total isof lav ones in the ex
t racts w as 23 3% at 130 # fo r 45 min w ith the liquidsolid ratio of 12 5 mL/ g Conclusion Compar ed
w ith t radit ional ext racting methods, subcr it ical w ater ex tr act ion is a new developing technolog y in r ecent
year s Its advantage is fast , g oodselective
Key words: Fr uctus S ophor ae ; total isof lav ones; subcr it ical w ater ex t ract ion
∀717∀中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090914 基金项目:国家 863课题( 2008AA10Z331)作者简介:丛艳波( 1985 ! ) ,女,黑龙江绥化兰西人,在读硕士研究生, 2004 ! 2008年考入东北农业大学食品分析与检验专业, 2008年保送到东北农业大学研究生学院攻读应用化学硕士,主要研究天然活性物质的分离纯化及其应用。
T el : 13624612968 Email: cyb happy love@ 126 com
* 通讯作者 张永忠 Email: zyz1953@ sohu com