全 文 ：一极为显著的除杂质过程, 才确保了树脂更好地发
挥作用。
AB8树脂对连翘酯苷 A 的分离纯化, 是一个
简单、环保且高效的纯化过程,非常适合于大生产操
作,再加上树脂 A 和 B 后续除杂, 形成了一条很好
的连翘酯苷 A的工艺开发路线,具有广阔的工业生
产应用前景。
参考文献:
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(冲剂)中连翘酯苷 A的含量[ J ] 中草药, 1999, 30( 4) : 268
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的研究[ J] 中成药, 2006, 28( 6) : 794796
克感利咽口服液的超声提取工艺研究
秦春梅,廖晓嘉
(广州王老吉药业股份有限公司,广东 广州 510450)
摘 要:目的 研究克感利咽口服液处方药材的超声提取方法。方法 分别以黄芩苷、栀子苷、色谱图相似度、总
固体得率作为指标,采用均匀设计试验, 结合药理学指标, 研究克感利咽口服液超声提取工艺。结果 优选最佳超
声提取工艺为: 8 mm 药材粒度, 9 倍量 40%乙醇, 超声温度 60 , 超声功率 1 200 W , 提取 2 次, 每次 30 min。结
论 克感利咽口服液采用超声提取工艺切实可行, 具有节能、省时、提高提取效率等优势。
关键词:克感利咽口服液; 均匀设计;超声提取
中图分类号: R284 2 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05073504
克感利咽口服液由黄芩、金银花、栀子等 14 味
药材组成。原工艺中采用乙醇回流提取或水煎煮等
传统提取工艺, 整个工艺能耗较大, 工艺流程长、成
本较高。随着现代制剂提取工艺的飞速发展, 超声
提取技术作为一门药物提取的现代新技术, 由于其
省时、节能、提取效率高等特点和优势, 在中药领域
的应用已经受到了广泛关注和研究,并且具有广阔
的应用前景和开发价值[ 1~ 3] 。本实验将在原工艺基
础上,采用均匀设计法,确立克感利咽口服液超声提
取的最佳工艺参数,以化学评价和生物活性评价指
标,进行原工艺与超声提取工艺的对比研究, 力求科
学、客观地评价新工艺的可行性和适用性。
1 仪器、试剂与材料
Waters 600高效液相色谱仪( 600四元梯度泵,
2996 DAD检测器, 717自动进样器, 柱温箱) ; Em
pow er工作站; M et t ler AE 240型电子天平(十万分
之一,瑞士梅特勒托利多公司)。SCQ ! 2400 型超
声波提取设备( 25 kH z、40 kHz, 2 400 W, 上海声浦
超声波设备厂)。
栀子苷 (批号 110749200410)、黄芩苷 (批号
110715200514)、木犀草苷(批号 111720200501)、
升麻苷(批号 522200203)、绿原酸 (批号 110753
200413)、黄芩素(批号 111595200402)、连翘苷(批
号 110821200406 )、甘 草酸 铵 ( 批 号 110731
200409)对照品由中国药品生物制品检定所提供。
黄芩(批号 0601037)、金银花(批号 0601042)、荆芥
(批号 0601040)、薄荷 (批号 0602002)、防风(批号
0601039)、栀子 ( 批号 0601032 )、连 翘 ( 批号
0601003)、甘草 ( 批号 0601031 )、僵 蚕 ( 批号
0601034)、桔梗 ( 批号 0601015 )、蝉 蜕 ( 批号
0602009)、射 干 ( 批 号 051102 )、地 黄 ( 批 号
0601038)、玄参(批号 051101)药材均由广州王老吉
药业股份有限公司提供,经中心检验室药材组鉴定,
符合∀中国药典#2005年版各药材项下的相关要求。
大耳白家兔,雌雄各半, 体质量为( 1 5 ∃ 0 25)
kg, 由北京市海淀天旺实验动物养殖场提供, 许可
证编号: SCXK(京) 2006006。昆明种小鼠,清洁级,
体质量 21~ 23 g, 雌雄各半,由中国人民解放军军事
医学科学院实验动物中心提供,合格证号 SCX(军)
2002001。
%735%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090806 基金项目:广东省关键领域重点突破项目( 2003A30907)作者简介:秦春梅( 1979 ! ) ,女,湖南娄底人,工程师,硕士,主要从事中药新药研究。
T el : ( 020) 86200716 Fax: ( 020) 86601051 Em ail: ch unmeiqin@ hotmai l com
2 方法与结果
2 1 黄芩苷的测定 [ 4]
2 1 1 对照品溶液的制备:精密称取黄芩苷对照品
8 15 mg ,置 50mL 量瓶中, 加 60%乙醇至刻度, 摇
匀,制成 0 163 mg/ mL 的溶液,即得。
2 1 2 供试品溶液的制备:精密移取超声提取液样
品 2 mL,置 25 mL 量瓶中, 加 60%乙醇稀释至刻
度,摇匀, 即得。
2 1 3 色谱条件: Diamonsil C18色谱柱( 150 mm &
4 6 m, 5 m) ;流动相: 甲醇0 4%磷酸( 44∋56) ;体
积流量: 1 mL/ min;检测波长: 277 nm; 柱温: 35 。
该色谱条件下,黄芩苷峰形良好,对称因子1 02,且与
相邻峰的分离度为 1 7(均大于 15) ,理论塔板数按
黄芩苷峰计算为 4 068,保留时间 13 6 min。
2 2 栀子苷的测定[ 5]
2 2 1 对照品溶液的制备: 精密称取栀子苷对照
品5 91 mg,置 50 mL 量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,
制成 0 118 2 mg/ mL 的溶液,即得。
2 2 2 供试品溶液的制备:精密移取超声提取液样
品 2 mL,置 25 mL 量瓶中, 加 50%甲醇定容至刻
度,摇匀, 即得。
2 2 3 色谱条件: Diamonsil C18色谱柱( 150 mm &
4 6 m, 5 m) ; 流动相: 甲醇水( 29 ∋ 71) ; 体积流
量: 1 mL/ min; 柱温: 30 ; 检测波长: 241 nm。该
色谱条件下,栀子苷峰形良好, 对称因子 1 03, 且与
相邻峰的分离度均大于 1 5,理论塔板数按栀子苷
峰计算为 8 562,保留时间 14 7 min。
2 3 化学成分 HPLC 色谱图评价标准的研究 [ 6] :
由于复方中药成分复杂, 为防止仅采用单一指标成
分对工艺评价的片面性, 采用了指纹图谱的研究思
路,提取更多的成分信息并确定已知成分或特征峰
的归属,建立原工艺 HPLC 色谱图, 作为工艺研究
的评价标准,结果采用国家药典委员会∀中药色谱指
纹图谱相似度评价系统( A版)#软件计算相似度,以
此相似度作为超声提取评价指标。
2 3 1 色谱条件: Diamonsil C18色谱柱( 250 mm &
4 6 mm, 5m) ;检测波长: 254 nm; 柱温: 35 ; 流
动相:乙腈( A )0 1% 甲酸水溶液 ( B) , 梯度洗脱:
0~ 90 min, 2% ( 40% A, 体积流量: 0 8 ( 1
mL/ min; 90~ 120 min, 40% ( 60% A, 体积流量: 1
mL/ min。在此色谱条件下, 按照指纹图谱的方法学
验证要求,对其稳定性、精密度、重现性试验作了相
应考察,结果证明稳定性及重复性良好。
2 3 2 特征峰的归属: 将克感利咽口服液样品、自
制样品、处方药材以及各药材的指纹图谱叠加, 结合
在样品溶液中加入已知对照品溶液的方法,并借助
保留时间、DAD检测器提取的光谱图等进行综合分
析,初步筛选并确定其中 8种成分的归属,见图 1。
1样品+ 混合对照品 2样品 3对照品
1sample+ mixed reference su bstan ces 2s ample
3mixed reference substances
图 1 色谱峰的归属和确定
Fig 1 Assignment and definition of chromatographic peak
2 3 3 原工艺标准色谱图的建立: 10 批克感利咽
口服液,在上述色谱条件下完成 HPLC 分析, 所有
图谱数据导入国家药典委员会∀中药色谱指纹图谱
相似度评价系统( A版)#软件, 时间窗设为 0 5 s,经
自动匹配生成标准对照图谱(图 2) ,以此作为超声
提取研究用的标准图谱。与对照图谱(共有模式)相
比,所有样品的相似度均大于 0 99。
1绿原酸 2栀子苷 3升麻苷 4木犀草苷
5黄芩苷 6黄芩素 7甘草酸铵
1ch lorogenic acid 2 gardenoside 3cimside 4cyn aros ide
5b aicalin 6baicalein 7glycyrrhiz ic acid ammonium
图 2 用于超声提取研究的标准 HPLC图谱(共有模式)
Fig 2 Typical HPLC chromatogram of ultrasonic
extraction reference
该标准对照图谱所建立的色谱评价方法较简便
可行,重复性好, 反应的信息量较多, 采用国家药典
委员会∀中药色谱指纹图谱相似度评价系统( A 版) #
软件计算相似度, 以此相似度结果作为下一步超声
提取的重要评价指标。
2 4 超声提取工艺的均匀试验设计: 以提取物
HPLC色谱图与标准图谱的相似度、黄芩苷、栀子苷
的量及总固体得率共4个指标作为化学评价手段,采
%736% 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
用均匀设计试验,以药材粒度、超声温度、超声功率、
超声时间、溶媒用量、溶媒体积分数、提取次数为考察
因素,采用 7因素表 U 10 ( 107 )安排 14味药材乙醇超
声提取试验。试验水平和因素见表 1,结果见表2。
采用 SAS软件, 针对以上均匀设计的 4个评价
指标即:总固体得率、栀子苷、黄芩苷的量、色谱图相
似度结果分别进行方差分析、多重比较及回归分析,
根据 SA S统计分析结果,初步确定克感利咽口服液
乙醇超声提取工艺: 14 味药材, 8 mm 药材粒度, 9
倍量 40% 乙醇, 超声温度 60 , 超声功率 1 200
W,提取 2次, 每次 30 m in。
2 5 验证试验:按上述优化工艺, 放大生产 3批样
品,并与原工艺样品及质量标准限度进行比较分析,
结果见表 3。
表 1 因素与水平
Table 1 Factors and levels
水平 因 素
A 药材粒度/ mm B超声温度/ C超声功率/ W D 超声时间/ min E乙醇用量/倍 F乙醇体积分数/ % G 提取次数/次
1 6 常温 300 20 3 0 1
2 8 45 600 25 4 10 2
3 10 50 1 200 30 5 20 3
4 12 60 1 800 40 6 30 1
5 不粉碎 70 2 400 45 7 40 2
6 6 常温 300 50 8 50 3
7 8 45 600 55 9 60 1
8 10 50 1 200 60 10 70 2
9 12 60 1 800 65 11 80 3
10 不粉碎 70 2 400 70 12 90 2
表 2 U10 ( 107 )结果分析( n= 2)
Table 2 Results of U10 ( 107 ) uniform design test ( n= 2)
编号 因 素
A B C D E F G
总固体/ % 黄芩苷/ ( mg % g- 1 ) 栀子苷/ ( mg % g- 1) 相似度
1 1 7 5 2 3 10 4 4 18 0 75 1 21 0 638 0
2 2 3 10 4 6 9 8 11 99 2 46 2 76 0 732 0
3 3 10 4 6 9 8 1 8 86 1 86 1 89 0 284 5
4 4 6 9 8 1 7 5 10 60 1 83 0 76 0 804 0
5 5 2 3 10 4 6 9 16 82 3 91 1 38 0 874 5
6 6 9 8 1 7 5 2 16 37 4 80 3 26 0 886 0
7 7 5 2 3 10 4 6 21 66 5 05 4 28 0 884 5
8 8 1 7 5 2 3 10 12 90 0 00 1 75 0 333 5
9 9 8 1 7 5 2 3 20 04 0 00 2 53 0 234 0
10 10 4 6 9 8 1 7 15 23 0 00 0 56 0 297 0
表 3 验证试验结果( n= 3)
Table 3 Result of verification test ( n= 3)
不同提取方法 总固体/ % 黄芩苷/ ( mg % g- 1) 栀子苷/ ( mg % g- 1) 相似度
超声提取新工艺 15 1 ∃ 0 36 5 94 ∃ 0 20 2 52 ∃ 0 18 0 943 ∃ 0 007
原工艺 17 0 ∃ 1 41 7 74 ∃ 0 13 1 39 ∃ 0 18 0 995 ∃ 0 007
原质量标准限度 > 3 379 > 0 56
以上验证试验结果表明, 应用超声提取新工艺
稳定可行,且与原工艺样品比较,相似度大于 0 9以
上,指标性成分也符合质量标准限度要求。
2 6 生物活性(药理)指标优选超声提取工艺:以上
仅仅为通过化学分析手段初步筛选出来的优化工
艺,为了进一步评价超声提取工艺的可行性和适用
性,结合克感利咽口服液)疏风散热、解毒利咽∗的功
能主治以及相关文献报道[ 7, 8] , 采用对大肠杆菌脂
多糖致家兔发热的影响和抑制炎性肿胀试验, 对超
声优化工艺及原工艺进行药效学比较, 结果分别见
表 4和表 5。
以上结果表明, 超声提取新工艺表现出相对更
强的作用效果。通过以上比较分析, 进一步证明克
感利咽口服液应用超声提取是切实可行的。
3 讨论
在本研究中,化学评价是确定优化工艺的重要
因素,为了最大限量地反映复方中大多数药材的特
征成分或指标性成分,故以原工艺建立的标准图谱
%737%中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
表 4 不同工艺的克感利咽口服液对内毒素致热家兔的解热作用( n= 10)
Table 4 Ef fect of Kegan Liyan Oral Solution by diff erent technology on rabbit fever induced by endotoxin ( n= 10)
组 别 剂量/
( g % kg- 1 % d- 1 )
基础体温
( x ∃ s ) /
药后不同时间体温升高值( x ∃ s ) /
1 h 2 h 3 h 4 h
模型对照 ! 3923 ∃ 0 241 1 59 ∃ 0 331 1 71 ∃ 0 470 1 88 ∃ 0 358 1 51 ∃ 0 418
阿司匹林 0 1 3932 ∃ 0 270 1 15 ∃ 0 447* 1 39 ∃ 0 482 1 49 ∃ 0 520 1 01 ∃ 0 657
原工艺 10 3940 ∃ 0 368 1 20 ∃ 0 291* 1 47 ∃ 0 395 1 60 ∃ 0 457 1 27 ∃ 0 648
5 3920 ∃ 0 316 1 34 ∃ 0 295 1 75 ∃ 0 337 1 95 ∃ 0 398 1 58 ∃ 0 492
新工艺 10 3937 ∃ 0 347 1 04 ∃ 0 313* * 1 22 ∃ 0 559* 1 63 ∃ 0 414 1 41 ∃ 0 493
5 3934 ∃ 0 184 1 19 ∃ 0 338* 1 46 ∃ 0 481 1 55 ∃ 0 306* 1 22 ∃ 0 305
与模型对照组比较: * P < 0 05 * * P < 001
* P< 0 05 * * P < 0 01 v s model grou p
表 5 不同工艺的克感利咽口服液对二甲苯所致小鼠耳肿胀的抑制作用( n= 10)
Table 5 Inhibition of Kegan Liyan Oral Solution by different technology on ear edema of mice induced by xylene ( n= 10)
组 别 剂量(生药 g % k g- 1) 左耳质量/ mg 右耳质量/ mg 肿胀率/ %
对照 ! 17 00 ∃ 1 62 39 43 ∃ 5 33 134 52 ∃ 41 62
氢化可的松 0 025 16 14 ∃ 1 92 28 35 ∃ 4 58 75 80 ∃ 20 76* * *
原工艺 24 16 14 ∃ 1 75 33 50 ∃ 5 32 107 71 ∃ 26 85*
12 16 57 ∃ 1 95 35 64 ∃ 2 90 116 64 ∃ 20 69
新工艺 24 16 86 ∃ 1 95 30 28 ∃ 5 32 81 28 ∃ 34 91* * *
12 17 14 ∃ 2 07 32 78 ∃ 7 04 92 26 ∃ 39 99* *
与对照组比较: * P < 0 05 * * P < 0 01 * * * P < 0 001
* P< 0 05 * * P < 0 01 * * * P < 0 001 v s cont rol group
作为评价标准, 将克感利咽口服液中的特征信息尽
量多地反映在 HPLC 色谱图上,寻找并确定已知成
分或特征峰的归属, 以此评价超声新工艺,可以弥补
仅以某单一指标成分评价工艺的局限性, 也具有一
定创新性和可行性。
本研究对超声提取的影响因素如超声功率、超
声温度、药材粒度、溶媒量等均进行了综合考察, 其
中超声波频率也是其主要影响因素,但是由于使用
的设备为 24、40 kHz的固定双频率,在研究中均采
用固定的低频率,未进行不同频率对超声提取影响
的研究,需要在以后实验中进一步完善。
通过化学评价、工艺验证、生物活性(药理)指标
及与原工艺进行比较分析, 认为克感利咽口服液处
方药材采用乙醇超声提取工艺是可行的, 并具有节
能、省时、提高提取效率等优势,值得继续深入研究。
在后续工作中, 笔者将结合生产成本等实际大生产
需求,采用水作为提取溶媒,进一步深入研究克感利
咽口服液处方药材的超声提取工艺。
致谢:所有试验由陈凤庭顾问指导完成,其中药
效学试验为委托中国中医科学院广安门医院顾丽贞
等完成, SAS统计分析由丁金龙博士完成。
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%738% 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月