全 文 ：肿瘤的生长、浸润和转移均需依赖新生血管的
形成。而 VEGF 为目前发现的最重要的促进肿瘤
血管生成的细胞因子 [ 10] ,其可通过促进血管内皮细
胞增殖、增加微血管通透性及改变细胞外基质等途
径促进肿瘤血管新生。VEGF 有多种亚型, 其中,
VEGF 165和 VEGF121在肿瘤血管新生中起主要作
用。本研究通过 RTPCR 及免疫荧光细胞化学实
验表明,白花丹醌干预肝癌 HepG2 细胞后, VEGF
mRNA 及蛋白表达水平均随药物浓度增加而下调。
本研究结果表明, 白花丹醌体外可抑制肝癌
HepG2 细胞生长、克隆形成及 VEGF 表达,其可能
通过该途径抑制肿瘤生长、血管新生,达到抗肿瘤作
用。然而,其在体内对肝癌生长、浸润等生物学行为
的影响及其机制尚待进一步研究。
参考文献:
[ 1] 郭晓庄 有毒中草药大辞典 [ M ] 天津:天津科技翻译出版
公司, 1992
[ 2] 谭明雄, 王恒山, 陈振锋, 等 白花丹化学成分和药理活性
研究进展 [ J] 中草药, 2007, 38( 2) : 289293
[ 3] 刘 园, 刘 超 RPHPLC法测定不同采收期白花丹中白
花丹醌 [ J] 中草药, 2007, 38( 8) : 12581259
[ 4] S rinivas G, Annab L A, Gopin ath G, et a l . Ant isen se b loc
king of BRCA1 enhances s ensit ivity to plumbagin bu t not
tam ox ifen in BG1 ovarian cancer cell s [ J ] Mol Car cinog ,
2004, 39( 1) : 1525
[ 5] Ahmad A, Banerjee S, Wang Z, e t al . Plumbaginin duced
apoptosi s of human br east cancer cells is mediated by inact iva
t ion of NFkappaB and Bcl2 [ J] J Cel l B iochem, 2008, 105
( 6) : 14611471
[ 6] 王辅林, 陈乐真, 韦立新, 等 血管内皮生长因子在肺癌组
织中表达的定量观察 [ J] 中华病理学杂志, 1999, 28( 4 ) :
295
[ 7] Sugie S , Ok amoto K, Rahman K M, et al . Inh ibitory ef fect s
of plum bagin and juglone on azoxym ethaneinduced intest inal
carcinogenesis in rat s [ J ] Canc er L e tt , 1998, 127 ( 12 ) :
177183
[ 8] Sandur S K, Ich ikaw a H, Sethi G, et al . Plumbagin ( 5hy
droxy2methyl1, 4naphthoquinone) suppress es NFkappaB
act ivat ion an d NFk appaBr egulated gene products through
modulat ion of p65 and IkappaBalph a kin as e act ivat ion, lead
ing to potent iat ion of apoptosis indu ced b y cytokine an d
ch emotherapeut ic agents [ J] Biol Chem, 2006, 281 ( 25 ) :
1702317033
[ 9] Nair S , Nair R R, S rinivas P, et al . Radiosen sit izing ef fect s
of plum bagin in cervical cancer cell s i s th rou gh m odulation of
apoptot ic pathw ay [ J] Mol Carc inog , 2008, 47( 1) : 2233
[ 10] Leung D W , C achian es G, Ferrara N, e t a l . Vascular en do
thelial g row th factor i s a s ecreted angiogenic mitogen [ J ]
S cience, 1989, 246 ( 4935) : 13061309
红豆杉多糖对 Beagle犬心肌缺血再灌注模型心肌细胞凋亡
及单核细胞趋化蛋白1 与 NO表达的影响
朱天民1 , 朱慧民2 , 李 辉3
( 1 成都中医药大学, 四川 成都 610075; 2 台州市中心医院,浙江 台州 318000;
3 成都大学医护学院, 四川 成都 610081)
摘 要:目的 观察红豆杉多糖对 Beagle 犬心肌缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡及单核细胞趋化蛋白1 ( M CP
1)、NO 表达的影响。方法 将 30 只 Beagle 犬随机分为假手术组、模型组、红豆杉多糖 ( 89 5、357 mg/ kg) 组、卡
维地洛 ( 1 mg/ kg ) 对照组, 每组 6 只, 分别给药 7 d 后, 建立心肌缺血再灌注模型。TUNEL 染色法标记缺血再灌
注区凋亡心肌细胞,计算凋亡指数 ( A I) ; Western blotting 法检测缺血再灌注区心肌 MCP1 蛋白表达; 硝酸还原酶
法检测心肌组织中 NO 水平。结果 模型组、红豆杉多糖低剂量组心肌细胞 AI 较假手术组显著升高 ( P< 0 01) ;
红豆杉多糖高剂量组、卡维地洛组心肌细胞 AI 显著低于模型组和红豆杉多糖低剂量组 (P < 0 05) ,与假手术组比
较无显著差异 (P > 0 05)。模型组、红豆杉多糖低剂量组、卡维地洛组 MCP1 蛋白表达较假手术组显著升高
( P< 0 05) ,红豆杉多糖低、高剂量组,卡维地洛组 M CP1 蛋白表达较模型组显著下降 (P < 0 01) , 红豆杉多糖高
剂量组 MCP1 蛋白表达显著低于低剂量组和卡维地洛组 (P < 0 01)。模型组及各治疗组心肌组织 NO 水平较假
手术组显著升高 (P< 0 01) ,红豆杉多糖高剂量组心肌 NO 显著低于模型组 ( P< 0 05) 及低剂量组 ( P < 0 01)。
结论 红豆杉多糖可抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡, 其机制可能与降低心肌组织 MCP1 蛋白表达及 NO
水平、抑制心肌细胞凋亡有关。
关键词:红豆杉多糖; 心肌缺血再灌注; 细胞凋亡; 单核细胞趋化蛋白1 ( MCP1) ; NO
中图分类号: R285 5 文献标识码: A 文章编号: 02532670( 2010) 05077804
778 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
收稿日期: 20090725 基金项目:浙江省科技厅科技攻关计划基金资助项目 ( 2006C33005)作者简介:朱天民( 1977 ! ) ,女,副教授,博士,研究方向为中西医结合康复的实验与临床研究。
T el : 13608216905 Email: tmzhu@ hotmail. com
红豆杉多糖为本课题组首次以极性梯度提取技
术从红豆杉科红豆杉属植物南方红豆杉 T axus
chinensi s var. mair ei Cheng et L . K. Fu 中发现、提
纯的一种全新多糖。红豆杉 T . chinensi s ( P ilger)
Rehd 又名紫杉、赤柏松等, 现代药理学研究发现红
豆杉茎叶皮内富含多种化合物, 如紫杉醇、紫杉酚、
紫杉碱等[ 1] ,具有良好的抗白血病、抗肿瘤和降血糖
作用 [ 2~ 4] ; 近年来本课题组在临床应用南方红豆杉
基地种植的南方红豆杉水煎剂抗肿瘤治疗时, 发现
其对伴发冠心病及心肌梗死的肿瘤患者能够明显改
善心肌缺血症状;实验研究发现其水提物可缩小冠
状动脉结扎急性心肌梗死大鼠的心肌梗死范围, 有
很好的心脏保护效果, 且其剂量远低于其含有的紫
杉醇所要求的剂量 ( 10~ 30 mg / m2 )。因此, 本课
题组对红豆杉枝叶提取物的成分进行了研究, 发现
其主要成分为国内外文献尚未报道的多糖类物质,
进而采用离子交换色谱提纯、非线性优化控制模拟
移动床纯化等, 得到高纯度红豆杉多糖;同时应用核
磁共振等进行了多糖分子结构鉴定,已获得国家专
利 (专利号: ZL03129421 9)。本实验进一步研究
该多糖对心肌缺血再灌注 Beagle 犬的心脏保护作
用及其作用机制,为其临床应用提供依据。
1 材料
1 1 实验动物: 实验用 Beagle 犬, 一级, 30 只, 雌
雄各半,体质量 8 0~ 10. 5 kg, 8~ 12 月龄, 由四川
省医学科学院实验动物研究所提供,实验动物生产
许可证号: SCXK (川) 200415。
1 2 主要药品与试剂:卡维地洛片 (上海罗氏制药
有限公司, 批号: MH6600908) , T UNEL 检测试剂
盒 (瑞士 Roche 公司) , 兔抗犬单核细胞趋化蛋白1
( MCP1) 多克隆抗体 ( Santa Cruz公司) ,羊抗兔 IgG
( Beyotime公司) , ECL Plus ( Beyotime 公司) , NO 检
测试剂盒 (南京建成生物工程研究所) , MFV ! 3200
电磁流量计 (日本光电公司生产) , HX ! 300S 动物呼
吸机 (成都泰盟科技有限公司生产)。
2 方法
2 1 红豆杉多糖的提取与分析:应用极性梯度提取
技术从红豆杉枝叶中分离多糖组分,并对其化学组
成和结构进行分析鉴定。红豆杉多糖初提采用极性
递减的溶剂进行分步抽提,纯化符合∀中国药典#要
求的多糖采用模拟移动床 ( SMB) 连续逆流色谱对
有效组分进行纯化,并采取非线性控制软件对电磁
阀的运动进行优化控制。提纯分离出相对分子质量
为 23 000 的主要多糖成分,质量分数 99%,提取率
约 70%。
2 2 分组和给药:将 30只 Beag le犬随机分为假手
术组、模型组、红豆杉多糖 (低、高剂量) 组、阳性对
照组,每组 6 只。假手术组、模型组不给药; 红豆杉
低、高剂量组分别 ig 给予红豆杉多糖 89 5、357
mg/ kg, 阳性对照组 ig 卡维地洛 1 mg/ kg ,共 7 d。
给药结束后建立心肌缺血再灌注模型。
2 3 模型的建立: Beag le 犬经 3% 戊巴比妥钠 30
mg/ kg 麻醉后, 仰卧位固定, 气管插管, 接 HX !
300S 动物呼吸机, 以呼吸比 5∃ 4,呼吸频率 18~ 20
次/ min,潮气量 120~ 135 mL 行机械通气。于 5、6
肋间开胸,暴露肺和心脏, 用撑胸器撑开胸腔,做心
包摇篮, 充分暴露手术野, 在左冠状动脉前降支
( LAD) 中下段游离约 1 cm,于 LAD的中下 1/ 3处
确定夹闭点,并在夹闭部位上缘附近套上合适直径
的电磁流量计卡式探头, 接 MFV ! 3200 电磁流量
计,夹闭已分离的 LAD 主干 60 min (在电磁流量
计监控下使 LAD 血流量降低约 80% ) ,然后开放再
灌注 120 min。假手术组手术方法同上, 但仅分离
LAD,不夹闭。
2 4 心肌细胞凋亡的检测: 犬处死后, 于心尖附近
取灌注区心肌组织, 4% 多聚甲醛固定,梯度乙醇脱
水,二甲苯透明, 浸蜡, 石蜡包埋切片, 然后参照
T UNEL 检测试剂盒说明书进行凋亡细胞染色。镜
下观察,凋亡细胞核为棕黄色或黄色,阴性细胞核呈
蓝色。每例切片随机选取 5个 400 倍视野, 计数凋
亡细胞与总细胞数, 计算细胞凋亡指数 ( apoptosis
index, AI, AI= 凋亡细胞数/总细胞数% 100%)。
2 5 Western blo tt ing 法检测 MCP1 蛋白表达:
在超净工作台无菌条件下取心尖附近再灌注区心肌
组织 100 mg ,经预冷的 PBS 洗涤 2次,剪碎,加入 1
mL SDS 裂解液,同时加入 100 mmol/ L 甲基磺酰
氟 ( PMSF) 10 L 冰上匀浆, 充分裂解约 20 min。
4 & 、12 000 r/ min 高速离心 20 min,小心吸取上清
液, BAC法测定蛋白浓度。取各样本蛋白各 100 g
与等体积的上样缓冲液混合均匀, 沸水浴 5~ 10
m in,自然冷却后行 12% SDS ! PAGE 电转膜, 用
1∃ 200 的兔抗犬 MCP1 多克隆抗体进行杂交, 用
1∃ 1 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗标记,
利用 ECL 法进行显色,以 GADPH 为内参照,凝胶自
动成像系统扫描,以指标条带蛋白的荧光强度/内参
蛋白条带的荧光强度表示蛋白相对表达水平。
2 6 心肌组织 NO 检测: 每例样本取心尖附近缺血
再灌注区心肌组织约 100 mg,加入 09 mL 冷生理盐
779 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
水冰浴匀浆后,以 3 000 r/ min 离心 15 min,取上清
液,参照 NO 检测试剂盒说明书硝酸还原酶法测定。
2 7 统计学分析:计量资料以 x ∋ s 表示, 用 SPSS
13 0 软件分析,采用单因素方差分析和重复测量数
据的方差分析。
3 结果
3 1 一般状况: 在建立心肌缺血再灌注模型期间,
模型组 1只犬在再灌注 18 min 时发生室颤,经抢救
无效死亡, 其余犬经电磁流量计检测缺血前、缺血
60 m in 及再灌注 60、120 min 时冠状动脉左前降支
血流量 ( CBFLAD ) ,显示成功建立心肌缺血再灌注模
型,见表 1。
表 1 各组犬冠状动脉左前降支血流量 ( CBFLAD ) ( x∋ s)
Table 1 Lef t anterior descending coronary artery blood flow of dog in groups ( CBFLAD ) ( x∋ s)
组 别 剂量/
( mg kg- 1 )
动物/
只
CBFL AD/ ( mL min- 1)
缺血前 缺血 60 m in 再灌注 60 m in 再灌注 120 min
假手术 - 6 21 87∋ 1 81 22 15∋ 1 65 22 12∋ 1 58 22 10 ∋ 1 73
模型 - 5 22 00∋ 1 71 4 36∋ 0 36( ( # # 11 32∋ 1 64( ( # # 17 98 ∋ 1 54 ( (# #
红豆杉多糖 89 5 6 21 83∋ 1 45 4 35∋ 0 21( ( # # 10 92∋ 1 06( ( # # 18 15 ∋ 1 30 ( (# #
357 6 22 10∋ 1 56 4 28∋ 0 15( ( # # 14 53∋ 1 09( ( * * ) ) # # 21 58 ∋ 1 42* * ) )
卡维地洛 1 6 22 75∋ 1 63 4 47∋ 0 22( ( # # 15 73∋ 1 32( ( * * ) ) # # 22 43 ∋ 1 38* * ) )
与假手术组比较: ( (P < 0 01; 与模型组比较: * * P < 0 01
与红豆杉多糖 89 5 m g kg- 1组比较: ) ) P < 0 01; 与缺血前比较: # # P < 0 01
( (P< 0 01 v s Sham gr ou p; * * P< 0 01 v s model grou p
) ) P< 0 01 v s t axus polys accharide 89. 5 m g kg- 1 gr ou p; # # P< 0 01 v s prei schemia grou p
3 2 各组心肌凋亡指数 ( A I) 比较: 模型组、红豆
杉多糖低剂量组心肌细胞 AI 较假手术组显著升高
( P< 0 01) ;红豆杉多糖高剂量组、卡维地洛组心肌
细胞 AI 显著低于模型组和红豆杉多糖低剂量组
( P< 0 05) ;红豆杉多糖高剂量组、卡维地洛组心肌
细胞 AI 虽较假手术组升高, 但无显著差异 ( P>
0 05)。结果见图 1和表 2。
3 3 对MCP1蛋白表达的影响 :模型组、红豆杉
图 1 心肌细胞 TUNEL染色结果
Fig. 1 Results of myocardial TUNEL staining
多糖低剂量组、卡维地洛组 MCP1 蛋白表达较假
手术组显著升高 ( P< 0 05) ; 红豆杉多糖低、高剂量
组及卡维地洛组 MCP1 蛋白表达较模型组显著下
降 ( P< 0 01) ; 红豆杉多糖高剂量组 MCP1 蛋白
表达显著低于红豆杉多糖低剂量组和卡维地洛组
( P< 0 01) , 与假手术组比较无显著差异 ( P >
0 05)。见图 2和表 2。
图 2 心肌组织 MCP1 蛋白表达
Fig. 2 Expression of MCP1 protein in myocardial tissue
3 4 对心肌 NO 的影响: 模型组及各治疗组心肌
组织 NO 水平较假手术组显著升高 ( P< 0 01) , 红
豆杉多糖高剂量组心肌 NO 显著低于模型组 ( P<
0 05) 及低剂量组 ( P< 0 01)。见表 2。
4 讨论
心肌缺血再灌注损伤是心肌缺血后在一定时间
内恢复血供, 缺血心肌发生的更严重的损伤。细胞
凋亡是由局部环境生理或病理性变化引起的、自身
内部机制调节的一种主动的、按一定程序进行的细
胞自发性死亡方式。心肌细胞凋亡是多种心血管疾
病发生与演变的细胞学基础,缺血再灌注可导致心
肌细胞凋亡,凋亡是急性心肌缺血和再灌注过程中
心肌细胞死亡的重要机制之一。抑制心肌细胞凋亡
可减少心肌缺血再灌注损伤。本研究选择 TU NEL
染色观察心肌细胞凋亡情况,结果显示红豆杉多糖高
剂量组心肌细胞 AI 显著低于模型组和低剂量组
( P< 0 05) , 与假手术组无显著差异。证明红豆杉多
780 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月
表 2 红豆杉多糖对心肌缺血再灌注犬心肌细胞凋亡指数、MCP1 蛋白表达、心肌 NO水平的影响 ( x ∋ s)
Table 2 Effect of taxus polysaccharide on myocardial apoptosis index, MCP1 protein expression,
and myocardial cells NO content of Beagle dogs (x ∋ s)
组别 剂量/ ( mg k g- 1) 动物/只 AI/ % M CP1 蛋白表达 心肌 NO/ ( m ol mg- 1 )
假手术 6 - 23 981 ∋ 6 037 7 103∋ 0526 1 010 ∋ 0 103
模型 5 - 38 861 ∋ 7 969 ( ( 11 608∋ 1080 ( ( 1 958 ∋ 0 219 ( (
红豆杉多糖 6 89 5 37 917 ∋ 9 019 ( ( 8 473∋ 1021 ( * * 1 898 ∋ 0 153 ( (
6 357 29 100 ∋ 3 346* # 6 248∋ 0994* * # # ∗ ∗ 1 573 ∋ 0 179 ( (* * # #
卡维地洛 6 1 30 403 ∋ 2 731* # 8 378∋ 1122 ( * * # 1 756 ∋ 0 173 ( (
与假手术组比较: (P< 0 05 ( (P< 0 01; 与模型组比较: * P < 0 05 * * P < 001
与红豆杉多糖 89 5 m g kg- 1组比较: # P < 0 05 # # P< 0 01; 与卡维地洛组比较: ∗ ∗P< 001
( P< 0 05 ( (P < 0 01 v s Sham group; * P< 0 05 * * P< 0 01 v s m odel group
# P< 0 05 # # P < 0 01 v s t ax us polysacch aride 89. 5 mg kg- 1 group; ∗ ∗P < 0 01 v s carvedilol group
糖可抑制缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。
MCP1 又称单核细胞趋化活化因子 ( monoc
chemotact ic and activat ing facto r, MCAF) 是一种
含有 76 个氨基酸残基的低相对分子质量可溶性碱
性蛋白质, 隶属于 CC 趋化因子超家族 (亚族)。
MCP1 在静息状态并不表达, 但内皮细胞、平滑肌细
胞、单核/巨噬细胞等许多细胞活化后均能产生。近
来研究发现,M CP1 在心、肾等器官缺血再灌注中有
不同程度的表达[ 5, 6] , MCP1 主要引起单核细胞的趋
化及其内皮下间隙的募集, 诱导单核细胞钙离子内
流,产生大量的活性氧 ( ROS)。研究发现, ROS 与细
胞凋亡的关系密切,细胞内产生的 ROS 可通过多途
径诱致细胞凋亡[ 7]。Zhou 等[ 8] 研究发现, MCP1 能
诱导一种新型的转录因子单核细胞趋化蛋白诱导蛋
白 ( MCPIP) ,而这种因子能导致心肌细胞的凋亡和
心室结构的异常。此外, MCP1 可诱导单核细胞和
内皮细胞表达黏附分子、促进白介素 ( IL1、IL6) 的
释放[ 9]。IL1 可与肿瘤坏死因子 ( TNF) 协同作用,
促进心肌细胞内诱导型 NO合酶 ( iNOS) 的表达,产
生大量 NO[ 10]。近年研究证实 NO 与心肌缺血再灌
注导致的细胞凋亡有密切关系。心肌缺血再灌注时
NO 升高是诱导心肌细胞凋亡,加重心肌细胞缺血再
灌注损伤的重要原因之一 [11, 12]。
本研究结果显示模型组心肌组织 MCP1 蛋白
及 NO 较假手术组显著升高 ( P< 0 01) ,提示缺血
再灌注时心肌组织 NO 升高可能与 MCP1 表达升
高有关。经高剂量红豆杉多糖治疗后, M CP1 蛋白
及 NO 较模型组显著降低 ( P< 0 01)。提示红豆
杉多糖可能通过降低心肌组织 MCP1及 NO,减轻
缺血再灌注导致的心肌细胞凋亡。
总之, 本研究首次证实红豆杉多糖可抑制缺血
再灌注导致的心肌细胞凋亡,其机制可能与其降低
心肌组织 MCP1 及 NO 有关, 该多糖有进一步研
究的价值,这将为开发红豆杉多糖为主原料的纯天
然心脏保护药物打下坚实的基础。
参考文献:
[ 1] 李存芳, 刘 勇, 董 玫, 等 南方红豆杉化学成分的研究
进展 [ J ] 中草药, 2007, 38( 8) : 11211132
[ 2] 唐朝晖, 钟德玝 紫杉醇抗肿瘤的分子机制 [ J] 中国临床
康复, 2006, 10( 27) : 125127
[ 3] 鲁翠涛, 赵应征, 梅兴国 红豆杉细胞提取物抑制肿瘤细胞
增殖及诱导凋亡的实验研究 [ J ] 中草药, 2003, 34 ( 11 ) :
10131015
[ 4] 赵 锐, 赵玮玮 抗癌植物药紫杉醇研究进展与动态 [ J ]
中草药, 2009, 40( 7) : 1172附 2
[ 5] Kak io T , Matsumori A, Ono K, e t al . Roles and relation
ship of macr oph age and monocyte chem otact ic and act ivatin g
factor/ mon ocyte ch emoat t ractant protein1 in the isch emic
an d r eperfus ed rat h eart [ J] Lab Inv est , 2000, 80 ( 7 ) :
11271136
[ 6] Sung F L, Zhu T Y, AuYeun g K K, e t al . Enhanced MCP
1 ex pres sion during ischem ia/ reperfus ion injury is mediated
by oxidat ivest ress and NFkappaB [ J] K id ney Int , 2002, 62
( 4) : 11601170
[ 7] 孙 涛, 苏全生 自由基与心肌缺血/再灌注损伤 [ J] 实用
医院临床杂志, 2006, 3( 4) : 9496
[ 8] Zhou L, Azfer A, Niu J, et al . Monocyte chemoat t ractan t
protein1 induces a novel t ranscription factor that cau ses car
diac myocyte apoptosis and vent ricular dysfunct ion [ J] Circ
R es, 2006, 98( 9) : 11771185
[ 9] 彭 彬 单核细胞趋化蛋白1 与心力衰竭的关系研究进展
[ J] 心血管病学进展, 2007, 28(4) : 570572
[ 10] 张艳芳. 白细胞介素1, 8, 10 与心肌缺血再灌注损伤 [ J ]
新乡医学院学报, 2006, 23( 2) : 210212
[ 11] 吴 青, 王 峻, 游 敏, 等 一氧化氮对大鼠模拟缺血再
灌注心肌细胞凋亡的影响 [ J] 中华医药杂志, 2005, 10
( 5) : 925926
[ 12] 裴 荣, 侯 波 一氧化氮在大鼠模拟心肌缺血/再灌注损
伤中的作用 [ J ] 中国药物与临床, 2007, 7( 3) : 197199
781 中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 41 卷第 5 期 2010 年 5 月